普通微生物學

普通微生物學第1頁/共115頁第一節(jié)微生物生長的測定微生物生長的概念及常規(guī)測定方法（原理和操作）第二節(jié)細菌的群體生長繁殖細菌生長繁殖的規(guī)律（標準生長曲線）及控制技術（連續(xù)培養(yǎng)的概念和方法）各種常見物理、化學因素對微生物生長的影響第三節(jié)微生物生長繁殖的控制第2頁/共115頁生長：繁殖：細胞物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆地增加，導致細胞體積擴大的生物學過程。微生物生長到一定階段由于細胞結(jié)構的復制與重建并通過特定方式產(chǎn)生新的生命個體，即引起生命個體數(shù)量增加的生物學過程。參見P132第3頁/共115頁生長是一個逐步發(fā)生的量變過程，繁殖是一個產(chǎn)生新的生命個體的質(zhì)變過程。在高等生物里這兩個過程可以明顯分開，但在低等特別是在單細胞的生物里，由于個體微小，這兩個過程是緊密聯(lián)系又很難劃分的過程。參見P132第4頁/共115頁一個微生物細胞合適的外界條件，吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進行代謝如果同化作用的速度超過了異化作用個體的生長原生質(zhì)的總量（重量、體積、大?。┚筒粩嘣黾尤绻骷毎M分是按恰當?shù)谋壤L時，則達到一定程度后就會發(fā)生繁殖，引起個體數(shù)目的增加群體內(nèi)各個個體進一步生長群體的生長第5頁/共115頁個體生長個體繁殖群體生長群體生長=個體生長+個體繁殖微生物生長：在一定時間和條件下，細胞數(shù)量的增加（微生物群體生長）在微生物學中提到的“生長”，一般均指群體生長，這一點與研究大生物時有所不同。第6頁/共115頁大腸桿菌一個細胞重約10-12克，平均20分鐘繁殖一代24小時后：4722366500萬億個后代，重量達到：4722噸48小時后：2.2×1043個后代，重量達到2.2×1025噸相當于4000個地球的重量一頭500kg的食用公牛，24小時生產(chǎn)0.5kg蛋白質(zhì)，而同樣重量的酵母菌，以質(zhì)量較次的糖液（如糖蜜）和氨水為原料，24小時可以生產(chǎn)50000kg優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。第7頁/共115頁第一節(jié)微生物生長的測定微生物生長的概念及常規(guī)測定方法（原理和操作）第8頁/共115頁微生物生長：單位時間內(nèi)微生物數(shù)量或生物量（Biomass）的變化微生物生長的測定個體計數(shù)生物量測定重量測定生理指標測定評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；評價不同的抗菌物質(zhì)對對微生物產(chǎn)生抑制（或殺死）作用的效果；客觀地反映微生物生長的規(guī)律；參見P151第9頁/共115頁一、計數(shù)法參見P152通常用來測定樣品中所含細菌、孢子、酵母菌等單細胞微生物的數(shù)量。1、培養(yǎng)平板計數(shù)法對樣品進行適當稀釋單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖肉眼可見的菌落對菌落數(shù)目計數(shù)推測樣品中的微生物細胞數(shù)第10頁/共115頁第11頁/共115頁由于無法保證細菌細胞在分離過程中徹底分開，因此，一個菌落可能是多個細胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）來表示，而不是直接表示為細胞數(shù)（個）。菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）：

采用菌落計數(shù)時，由于不能絕對保證一個菌落只是由一個活細胞形成，計算出的活細胞數(shù)稱為CFU。CFU并不完全等同于樣品中的活菌數(shù)。第12頁/共115頁第13頁/共115頁第14頁/共115頁第15頁/共115頁采用培養(yǎng)平板計數(shù)法要求操作熟練、準確，否則難以得到正確的結(jié)果；樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒只能接觸一個稀釋度的菌液；同一稀釋度三個以上重復，取平均值；每個平板上的菌落數(shù)目合適，便于準確計數(shù)；第16頁/共115頁第17頁/共115頁第18頁/共115頁2、膜過濾培養(yǎng)法如何對菌數(shù)低的樣品，如水，中的細菌數(shù)量進行計數(shù)？菌數(shù)低的樣品膜過濾培養(yǎng)菌落計數(shù)參見P153第19頁/共115頁水中細菌總數(shù)：124cfu/100ml第20頁/共115頁第21頁/共115頁3、顯微鏡直接計數(shù)法利用特定的細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。參見P152第22頁/共115頁1）常規(guī)方法缺點：

不能區(qū)分死菌與活菌；

不適于對運動細菌的計數(shù)；

需要相對較高的細菌濃度；

個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。第23頁/共115頁2）其它方法比例計數(shù):已知濃度的樣品（如血液）+待測濃度的樣品；顯微鏡下根據(jù)二者之間的比例直接推算待測微生物細胞濃度。過濾計數(shù):菌數(shù)低的樣品（如水）膜過濾對細菌進行熒光染色熒光顯微鏡計數(shù)活菌計數(shù):采用特定的染色技術對活菌和死菌分別計數(shù)第24頁/共115頁二、生物量測定1、比濁法在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度（opticaldensity，即O.D.）表示菌量。測量時應控制在菌濃度與光密度成正比的范圍內(nèi)，否則不準確。參見P153第25頁/共115頁2、重量法以干重、濕重直接衡量微生物群體的生物量；通過樣品中蛋白質(zhì)、核酸的測定間接推算微

生物群體的生物量。測定多細胞及絲狀真菌生長情況的有效方法參見P153第26頁/共115頁3、生理指標法參見P154生理指標：呼吸強度耗氧量酶活性生物熱等，與其群體的規(guī)模成正相關第27頁/共115頁第二節(jié)細菌的群體生長繁殖細菌生長繁殖的規(guī)律（標準生長曲線）及控制技術（連續(xù)培養(yǎng)的概念和方法）參見P134第28頁/共115頁微生物的特點：個體微小除真菌外，我們?nèi)庋劭吹交蚪佑|到的微生物已不是單個，而是成千上萬個單個微生物組成的群體。微生物的接種是群體接種，接種后的生長是群體繁殖生長對細菌群體生長規(guī)律的了解是對其進行研究與利用的基礎參見P134第29頁/共115頁一、生長的規(guī)律在微生物學中提到的“生長”，均指群體生長。生長曲線（growthcurve）：細菌接種到定量的液體培養(yǎng)基（封閉系統(tǒng)）中，定時取樣測定細胞數(shù)量，以時間為橫座標，以菌數(shù)為縱座標作圖，得到的一條反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線第30頁/共115頁第31頁/共115頁細菌的生長曲線一般以菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標作圖第32頁/共115頁第33頁/共115頁第34頁/共115頁1、遲緩期將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加或增加很少，生長速度幾近于零，也稱延遲期、適應期第35頁/共115頁遲緩期細胞的特點：細胞形態(tài)變大或增長，例如巨大芽孢桿菌，在遲緩期末細胞的平均長度比剛接種時長6倍。通常處于遲緩期的細菌細胞最大。細胞內(nèi)RNA，尤其是rRNA含量高，合成代謝活躍。核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導酶。對外界不良條件反應敏感。分裂遲緩，代謝活躍以上特征說明，細胞處于活躍生長中，只是分裂遲緩。在此階段后期，少數(shù)細胞開始分裂，曲線略有上升。第36頁/共115頁遲緩期出現(xiàn)的原因：調(diào)整代謝微生物接種到一個新的環(huán)境，暫時缺乏能量和必需的生長因子，“種子”老化（即處于非對數(shù)生長期）或未充分活化，接種時造成的損傷等。調(diào)整代謝需要一段適應期。遲緩期的長短與菌種的遺傳性、菌齡及移種前后所處的環(huán)境等因素有關，有的只需幾分鐘，有的需要幾小時。第37頁/共115頁在生產(chǎn)實踐中縮短遲緩期的常用手段：通過遺傳學方法改變菌種的遺傳特性利用對數(shù)生長期的細胞作為“種子”盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大適當擴大接種量第38頁/共115頁2、對數(shù)生長期也稱指數(shù)生長期（exponentialphase）第39頁/共115頁代時（generationtime）：在細菌個體生長里，每個細菌分裂繁殖一代所需的時間，通常以G表示。倍增時間（doublingtime）：在群體生長里細菌數(shù)量增加一倍所需的時間。參見P137

t－t0

G=－－－－－－－－－

3.322（lgNt

－lgN0)第40頁/共115頁第41頁/共115頁影響微生物代時的因素：1）菌種，不同的微生物及同一微生物的不同菌株代時不同；2）營養(yǎng)成分，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長代時短；3）營養(yǎng)物濃度，在一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度成正比；4）溫度，在一定范圍內(nèi)，生長速率與溫度成正相關；第42頁/共115頁在一定范圍內(nèi)，生長速率與溫度成正相關參見P149第43頁/共115頁不同的微生物有不同的最適生長溫度范圍第44頁/共115頁3、穩(wěn)定生長期又稱恒定期或最高生長期，此時培養(yǎng)液中活菌數(shù)量最高并維持穩(wěn)定。營養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物累積和pH等環(huán)境變化環(huán)境條件逐步不適于細菌生長細菌生長速率降低直至零（細菌分裂增加的數(shù)量等于細菌死亡數(shù)量）第45頁/共115頁對數(shù)期到穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)變是細胞重要的分化調(diào)節(jié)階段：1）開始儲存糖原等內(nèi)含物2）形成芽孢或建立自然感受態(tài)（芽孢桿菌）3）發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)物的重要階段

某些放線菌抗生素的大量形成也在此期第46頁/共115頁穩(wěn)定期的長短與菌種和外界環(huán)境條件有關生產(chǎn)上延長穩(wěn)定期的方法：

補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）或取走代謝產(chǎn)物

調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)溫度

對好氧菌進行通氣、攪拌或振蕩獲得更多的菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物第47頁/共115頁營養(yǎng)物質(zhì)耗盡或有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細菌死亡速率超過新生速率，整個群體呈現(xiàn)出負增長。

死亡的細菌以對數(shù)方式增加，但由于部分細菌產(chǎn)生抗性也會使細菌死亡速率降低，在衰亡期的后期仍會有部分活菌存在。4、衰亡期（decline或deathphase）第48頁/共115頁衰亡期的特點：細菌代謝活性降低；細菌衰老并出現(xiàn)自溶；產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物，如氨基酸、抗生素、外肽酶等；菌體細胞也呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時出現(xiàn)畸形，細胞大小懸殊。有些革蘭陽性菌此時染色呈革蘭陰性。第49頁/共115頁不同的微生物或同一種微生物對不同物質(zhì)的利用能力是不同的。有的物質(zhì)可直接被利用（如葡萄糖或NH4+等）；有的需要經(jīng)過一定的適應期后才能獲得利用能力（如乳糖或NO3-等）。前者通常稱為速效碳源（或氮源），后者稱為遲效碳源（或氮源）。當培養(yǎng)基中同時含有這兩種碳源（或氮源）時，微生物生長過程中會形成二次生長現(xiàn)象。第50頁/共115頁第51頁/共115頁第52頁/共115頁第53頁/共115頁第54頁/共115頁第55頁/共115頁二、同步培養(yǎng)理想的實驗材料：群體細胞能處于同一生長階段，同時進行分裂的生長。同步生長同步培養(yǎng)（synchronousculture）：使群體中的細胞進行同步生長的培養(yǎng)技術通過同步培養(yǎng)的方法獲得的細胞稱為同步細胞或同步培養(yǎng)物參見P138第56頁/共115頁機械法環(huán)境條件控制技術離心法過濾分離法硝酸纖維素濾膜法溫度培養(yǎng)基成分控制其他（如光照和黑暗交替培養(yǎng)）同步培養(yǎng)物：一種理想的材料生理與遺傳特性研究工業(yè)發(fā)酵的種子第57頁/共115頁由于細胞的個體差異，同步生長往往只能維持2-3個世代，隨后又逐漸演變?yōu)殡S機生長。第58頁/共115頁三、連續(xù)培養(yǎng)將微生物置于一定體積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲。分批培養(yǎng)（batchculture）或封閉培養(yǎng)（closedculture）培養(yǎng)基一次加入，不予補充，不再更換。遲緩期、對數(shù)期穩(wěn)定期、衰亡期連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）在微生物的整個培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。在培養(yǎng)過程中不斷地補充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物是實現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。第59頁/共115頁控制連續(xù)培養(yǎng)的方法恒濁器連續(xù)培養(yǎng)恒化器連續(xù)培養(yǎng)不斷調(diào)節(jié)流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定保持恒定的流速第60頁/共115頁（一）恒濁器連續(xù)培養(yǎng)測定所培養(yǎng)微生物的光密度值自動調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的速率使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度當培養(yǎng)室中的濁度超過預期數(shù)值時，流速加快，使?jié)岫冉档?；當培養(yǎng)室中的濁度低于預期數(shù)值時，流速減慢，使?jié)岫壬仙?；恒濁器培養(yǎng)的工作精度是由光電控制系統(tǒng)的靈敏度來決定的如果所用培養(yǎng)基中有過量的必需營養(yǎng)物，就可以使菌體維持最高的生長速率。第61頁/共115頁一般用于菌體以及菌體生長平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)（連續(xù)發(fā)酵）連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比的優(yōu)點：縮短發(fā)酵周期，提高設備利用率；便于自動控制；降低動力消耗及體力勞動強度；產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；缺點：雜菌污染和菌種退化第62頁/共115頁（二）恒化器連續(xù)培養(yǎng)使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率下生長進行繁殖。第63頁/共115頁恒化器連續(xù)培養(yǎng)中，必須將某種必需的營養(yǎng)物質(zhì)控制在較低濃度，以限制生長速度，而其他的營養(yǎng)物質(zhì)均過量。細菌的生長速率取決于限制性因子的濃度，并低于最高生長速率。限制性因子必須是機體生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、銨鹽等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源，或者是無機鹽、生長因子等物質(zhì)。因而可在一定濃度范圍內(nèi)決定該機體生長速率。第64頁/共115頁通過控制流速可以得到生長速率不同但濃度基本恒定的培養(yǎng)物主要用于：科研遺傳學：突變株的分離生理學：不同條件下的代謝變化生態(tài)學：模擬自然營養(yǎng)條件建立實驗模型第65頁/共115頁第三節(jié)微生物生長繁殖的控制各種常見的物理、化學因素對微生物生長的控制（原理和方法）第66頁/共115頁抑制（inhibition）：生長停止，但不死亡；死亡（death）：生長能力不可逆喪失；防腐（antisepsis）：防止或抑制霉腐微生物在食品等物質(zhì)上的生長；消毒（disinfection）：殺死或滅活病原微生物（營養(yǎng)體細胞）；滅菌（sterilization）：殺死包括芽孢在內(nèi)的所有微生物；化療（chemotherapy）：殺死或抑制宿主體內(nèi)的病原微生物或病變細胞；參見P160第67頁/共115頁控制微生物的生長速率或消滅不需要的微生物，在實際應用中具有重要的意義。第68頁/共115頁理化因子是抑菌還是殺菌作用的相關因素：理化因子的強度或濃度同一濃度理化因子作用時間的長短不同種類的微生物同一種微生物不同生長時期參見P154第69頁/共115頁一、控制微生物的化學物質(zhì)抗微生物劑抗代謝物抗生素控制微生物的化學物質(zhì)第70頁/共115頁1、抗微生物劑一類能夠殺死微生物或抑制微生物生長的化學物質(zhì)抗微生物劑（antimicrobialagent）生物合成的天然產(chǎn)物人工合成的化合物第71頁/共115頁化學物質(zhì)的抗微生物能力的測定液體培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法最低抑制濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）實驗抑菌環(huán)/圈（zoneofinhibition）實驗第72頁/共115頁第73頁/共115頁殺菌？抑菌？化學物質(zhì)的抗微生物能力的測定液體培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法通過這兩種方法無法區(qū)分抗微生物劑的作用效果第74頁/共115頁待測化學物質(zhì)對數(shù)生長培養(yǎng)物定時測定總菌數(shù)和活菌數(shù)抑菌劑（bacteriostaticagent）殺菌劑（batericide）溶菌劑（bacteriolysis）第75頁/共115頁抗微生物劑消毒劑（disinfectant）防腐劑（antiseptics）第76頁/共115頁防腐劑與消毒劑特點：對一切活細胞都有毒性，不能用于人或動物體內(nèi)的化學治療。消毒劑：可殺死微生物，通常用于非生物材料的滅菌或消毒。防腐劑：可殺死微生物或抑制其生長，但對于動物或人體的組織

無毒害作用，可作為外用抗微生物藥物。第77頁/共115頁使微生物蛋白質(zhì)凝固變性,如酒精等；

破壞菌體的酶系統(tǒng),如過氧化氫等；

增加細胞膜的通透性,使細胞發(fā)生破裂或溶解.

如來蘇兒等酚類物質(zhì)。作用機理：第78頁/共115頁

消毒劑廣泛用于一些熱敏感的或無法進行高溫滅菌的物品或場所的滅菌。溫度計、帶透鏡的儀器設備、聚乙烯管或?qū)Ч艿?；墻壁、樓板、儀器設備等表面和自來水；空氣防腐劑通常作為人體的外用品！第79頁/共115頁第80頁/共115頁各種抗微生物劑殺菌能力的比較標準：石炭酸系數(shù)=待測制劑最高稀釋度達到同效的石炭酸的最高稀釋度在臨床上最早使用的消毒劑——石炭酸一般規(guī)定：處理時間為10分鐘，供試菌為Salmonellatyphi（傷寒沙門菌）由于各種抗微生物劑的殺菌機制各不相同，故石炭酸系數(shù)僅有一定的參考價值。第81頁/共115頁2、抗代謝物（antimetabolite）一類化合物：與必需的代謝物具有相似的結(jié)構

可和特定的酶結(jié)合

阻礙酶的功能

干擾代謝的正常進行葉酸對抗物（磺胺）、嘌呤對抗物（6-巰基嘌呤）苯丙氨酸對抗物（對氟苯丙氨酸）、尿嘧啶對抗物（5-FU）胸腺嘧啶對抗物（5-溴胸腺嘧啶）第82頁/共115頁磺胺藥物是最早發(fā)現(xiàn)，也是最常見的化學治療劑，抗菌譜廣，能治療多種感染性疾病。大多數(shù)革蘭氏陽性細菌（如肺炎鏈球菌、溶血性

鏈球菌等）某些革蘭氏陰性細菌（如痢疾桿菌、流感桿菌等）對放線菌也有一定的作用第83頁/共115頁1934年，德國I.G.Farben染料廠的G.Domagk一種紅色染料（prontosil），白鼠靜脈注射，可治療鏈球菌感染，但在體外無作用。1935年，進一步證明protosil對人鏈球菌感染也有效。1935年除，Domagk唯一的女兒因傷口感染瀕于死亡，在絕望中Domagk將尚未經(jīng)過臨床試驗的prontosil注射到女兒體內(nèi)，結(jié)果挽回了女兒的生命。法國人Trefuel和英國人Fuller證實：

在體內(nèi)prontosil轉(zhuǎn)化成了具有抑菌作用的磺胺。第84頁/共115頁作用機理：磺胺是葉酸組成部分對氨基苯甲酸的結(jié)構類似物很多細菌需要自己合成葉酸才能生長磺胺對人體細胞無毒性，因為人缺乏從對氨基苯甲酸合成葉酸的相關酶——二氫葉酸合成酶，不能用外界的對氨基苯甲酸合成葉酸，必須直接利用葉酸作為生長因子進行生長。第85頁/共115頁第86頁/共115頁第87頁/共115頁3、抗生素（antibiotic）第88頁/共115頁抗生素：某些生物合成或半合成的一類次級代謝產(chǎn)物或衍生物，它們在很低濃度時就能抑制或影響它種生物的生命活動，如殺死微生物或抑制其生長。自上世紀40年代以來，已找到上萬種新抗生素，合成了近10萬種半合成抗生素，但其中在臨床上常用的僅有幾十種。第89頁/共115頁1）作用機制：抑制細菌細胞壁的合成

破壞細胞質(zhì)膜

作用于呼吸鏈以干擾氧化磷酸化

抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成抑制微生物的生長或殺死它們第90頁/共115頁第91頁/共115頁第92頁/共115頁第93頁/共115頁第94頁/共115頁第95頁/共115頁青霉素青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構與D-丙氨酸末端結(jié)構相似，從而能占據(jù)丙氨酸的位置與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，并將酶滅活，肽鏈之間無法相互連接，抑制了細胞壁的合成。第96頁/共115頁由于不同微生物之間的細胞化學結(jié)構和代謝的差異，不同的抗生素抗菌譜各異。第97頁/共115頁2）細菌抗藥性的產(chǎn)生第98頁/共115頁抗性菌株的特點：細胞質(zhì)膜透性改變，使抗生素不能進入細胞或進入后被細胞主動排出；藥物作用靶改變；合成了修飾抗生素的酶；抗性菌株發(fā)生遺傳變異，導致合成新的多聚體，以取代或部分取代原來的多聚體；第99頁/共115頁一、控制微生物的物理因素殺死或抑制微生物的物理因素溫度輻射作用過濾滲透壓干燥超聲波第100頁/共115頁1、溫度當溫度超過微生物生長的最高溫度或低于生長的最低溫度都會對微生物產(chǎn)生殺滅作用或抑制作用。第101頁/共115