第五章動(dòng)植物用轉(zhuǎn)基因微生物的安全性

第五章動(dòng)植物用轉(zhuǎn)基因微生物的安全性第1頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一以微生物為受體的轉(zhuǎn)基因生物稱為轉(zhuǎn)基因微生物。微生物是轉(zhuǎn)基因最常用的轉(zhuǎn)化材料，轉(zhuǎn)基因微生物比較容易培育，應(yīng)用也最廣泛。例如，生產(chǎn)奶酪的凝乳酶，以往只能從殺死的小牛胃中獲得，現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因微生物已能夠使凝乳酶在體外大量產(chǎn)生，避免了小牛的無(wú)辜死亡，也降低了成本。如果把一種微生物的抗藥性基因或其他基因轉(zhuǎn)入另一種微生物中，使之具有抗藥性，或?qū)?dòng)植物基因轉(zhuǎn)入微生物中。這種后來(lái)具有抗藥性或其他新性狀的微生物即為轉(zhuǎn)基因微生物。例如，開始時(shí)不具有產(chǎn)蘇氨酸、天冬氨酸、凝血蛋白等，后經(jīng)導(dǎo)入外源基因而獲得產(chǎn)蘇氨酸、天冬氨酸、凝血蛋白等的微生物均為轉(zhuǎn)基因微生物。第2頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一讓微生物制造然料----含油細(xì)菌第3頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一嗜汞細(xì)菌----能清除汞污染第4頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)動(dòng)植物用轉(zhuǎn)基因微生物概況根據(jù)轉(zhuǎn)基因微生物的用途，可分為動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物、植物用轉(zhuǎn)基因微生物和醫(yī)藥用轉(zhuǎn)基因微生物三大類。動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物是應(yīng)用于動(dòng)物的活疫苗、飼料添加劑和其他用途的轉(zhuǎn)基因微生物。植物用轉(zhuǎn)基因微生物主要是指通過重組DNA微生物研制的、直接應(yīng)用于植物上的具有殺蟲、防病、固氮、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等作用的微生物。轉(zhuǎn)基因微生物釋放可能會(huì)帶來(lái)一系列安全問題，事前須對(duì)其在環(huán)境中的基因轉(zhuǎn)移潛力、存活能力、擴(kuò)散能力及對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的潛在影響等進(jìn)行安全評(píng)價(jià)，并探索有效的檢測(cè)方法和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)策略．第5頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物的發(fā)展概況1

轉(zhuǎn)基因微生物飼料添加劑酶制劑(重組酶)：利用高產(chǎn)能和生產(chǎn)飼料酶的基因工程菌，添加于飼料中，提高飼料的效價(jià)。如產(chǎn)植酸酶的重組畢氏酵母菌(2000年許可證)。抗菌肽：抗菌肽對(duì)水生生物常見病如大腸桿菌、沙門氏菌等具有廣譜殺菌作用，具有良好的應(yīng)用前景。2004年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)轉(zhuǎn)抗菌肽基因酵母生產(chǎn)的抗菌肽制劑的效價(jià)達(dá)5000U/ml重組生長(zhǎng)素：GH由腦下垂體分泌，能促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，加速蛋白質(zhì)合成，但在魚類體內(nèi)含量極微。將魚GH基因轉(zhuǎn)入微生物中大量生產(chǎn)重組魚生長(zhǎng)素，作為添加劑具有很強(qiáng)的促生長(zhǎng)作用。第6頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一產(chǎn)植酸酶的轉(zhuǎn)基因重組畢氏酵母菌第7頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2

基因工程疫苗利用重組DNA技術(shù)研制的疫苗，包括：亞單位疫苗、活載體疫苗和基因缺失疫苗。我國(guó)經(jīng)批準(zhǔn)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)的有狂犬病疫苗和牛羊腹瀉疫苗；通過安全性評(píng)估的有雞傳染性喉氣管炎疫苗、禽流感疫苗、雞痘疫苗等?；蚬こ虂唵挝灰呙纾豪梦⑸锏哪撤N表面結(jié)構(gòu)成分(抗原)制成不含有核酸、能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗稱為亞單位疫苗。它是一種保留病原體中有效免疫原成分,而去除其無(wú)效或有害成分的單純疫苗。例如,只含霍亂毒素B亞單位制成的霍亂毒素B亞單位疫苗；用狂犬病毒主要抗原粘附在脂質(zhì)體上制成的狂犬病毒免疫體亞單位疫苗；以及麻疹病毒亞單位疫苗；等等.第8頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

將病原微生物的主要的保護(hù)性免疫原基因轉(zhuǎn)移到非致病的微生物中表達(dá)，可從其培養(yǎng)物中分離制備出亞單位疫苗試劑。轉(zhuǎn)基因活疫苗：活疫苗是指將病原微生物在人工誘發(fā)突變，失去致病性但保留免疫原性、繁衍能力和剩余毒力的無(wú)毒或弱毒病原微生物。

活疫苗接種后在人體內(nèi)有一定程度的繁殖或復(fù)制，類似一次輕型的自然感染，但不導(dǎo)致人發(fā)病。

轉(zhuǎn)基因活疫苗根據(jù)其外源基因載體可分為病毒活載體疫苗和細(xì)菌活載體疫苗。前者針對(duì)病毒病，后者針對(duì)細(xì)菌性疾病。轉(zhuǎn)基因活疫苗已在全球范圍開展科技研發(fā)和應(yīng)用研究，將成為今后疫苗制劑的主要趨勢(shì)。第9頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、植物用轉(zhuǎn)基因微生物的發(fā)展概況

§應(yīng)用重組DNA技術(shù)有目的地改變微生物或其產(chǎn)品的遺傳性狀和生物學(xué)活性,可進(jìn)一步增強(qiáng)殺蟲防病效果、擴(kuò)大作用譜、延長(zhǎng)田間持效期、從而提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。§各國(guó)獲準(zhǔn)進(jìn)入田間釋放的轉(zhuǎn)基因微生物主要為轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌遺傳工程菌和轉(zhuǎn)基因根瘤菌等活體產(chǎn)品，轉(zhuǎn)基因病毒殺蟲劑、防病轉(zhuǎn)基因微生物?！煳覈?guó)已構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌近百株，有十多株轉(zhuǎn)基因微生物處于安全性評(píng)價(jià)和田間試驗(yàn)，6種菌經(jīng)安全性評(píng)價(jià)后進(jìn)入環(huán)境釋放，5種菌劑完成產(chǎn)品登記，其中的聯(lián)合固氮菌和高效廣譜的抗性基因工程菌BMB820Bt已進(jìn)入商品化生產(chǎn)。第10頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1

轉(zhuǎn)基因生物農(nóng)藥殺蟲轉(zhuǎn)基因微生物

轉(zhuǎn)基因病毒殺蟲劑：通過基因工程方法將外源殺蟲基因如蝎子神經(jīng)毒素基因等與昆蟲病毒重組，使重組病毒殺蟲速度和毒性提高，或成為雙價(jià)殺蟲劑；

轉(zhuǎn)Bt基因殺蟲劑：將來(lái)自蘇氏桿菌的Bt基因?qū)胧荏w菌株中，利用受體菌或載體的增效基因，制備效力更強(qiáng)和更持久的基因工程菌，以菌體或分離的Bt毒蛋白制造殺蟲劑。在國(guó)外已有10多種制劑投入商業(yè)化生產(chǎn)。防病轉(zhuǎn)基因微生物：通過對(duì)生防菌進(jìn)行基因改良，使之獲得對(duì)多種病害有拮抗活性，或增強(qiáng)抗菌活性。

將外源幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入一些木霉菌、枯草桿菌的菌株中，使其產(chǎn)生更強(qiáng)烈的抑菌作用。將一些殺蟲基因轉(zhuǎn)移到生防菌中，可使其同時(shí)具有防病和殺蟲的功效。

第11頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第12頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一相對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)合成農(nóng)藥，生物農(nóng)藥具有安全、高效、針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在人們環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)的今天，生物農(nóng)藥受到越來(lái)越多的重視，在全球的市場(chǎng)需求穩(wěn)步攀升。隨著轉(zhuǎn)基因作物的增加，病蟲害綜合防治措施的應(yīng)用，以及有機(jī)農(nóng)業(yè)的不斷擴(kuò)大，預(yù)計(jì)在未來(lái)數(shù)年生物農(nóng)藥的研發(fā)將取得更多突破性的進(jìn)展。

生物農(nóng)藥的主要發(fā)展趨勢(shì)為：以基因重組為核心高技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈，關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新顯著加快；轉(zhuǎn)基因生物農(nóng)藥新品種不斷涌現(xiàn)，其研發(fā)和應(yīng)用向更安全和更環(huán)保方向發(fā)展；產(chǎn)品更新?lián)Q代速度加快，已成為涉農(nóng)工業(yè)最具前景的發(fā)展領(lǐng)域。第13頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2

轉(zhuǎn)基因微生物肥料轉(zhuǎn)基因微生物肥料主要是遺傳改良的聯(lián)合固氮菌和根瘤菌，是采用基因工程技術(shù)對(duì)外源固氮基因及其調(diào)控基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移至受體微生物而構(gòu)建出來(lái)的新型重組固氮菌。由于銨對(duì)固氮菌的固氮有一定的阻遏作用，構(gòu)建耐銨或泌銨的固氮工程菌株將能減輕銨對(duì)固氮的阻遏作用，明顯提高其固氮效率。美RearchSeeds公司的轉(zhuǎn)基因根瘤菌RMBPC-2已于1997年獲準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)；我國(guó)中科院、廣東微生物所和中科院上海植生所研制的聯(lián)合固氮菌AC-1541已獲準(zhǔn)在遼寧生產(chǎn)；中科院植物所和中國(guó)農(nóng)大聯(lián)合研究的玉米聯(lián)合固氮耐銨工程菌E7已獲準(zhǔn)在黑龍江進(jìn)行環(huán)境釋放。

第14頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)

動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物安全性評(píng)價(jià)動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物與動(dòng)物和人類健康密切相關(guān)，也是公眾最關(guān)心和最顧慮的一類轉(zhuǎn)基因生物。微生物生長(zhǎng)繁殖快、變異類型多，有許多類型本身就是動(dòng)植物的病原體。因此，轉(zhuǎn)基因微生物向環(huán)境中釋放有可能會(huì)帶來(lái)一系列的安全問題。由于轉(zhuǎn)基因微生物種類及其應(yīng)用環(huán)境的多樣性,也由于對(duì)轉(zhuǎn)基因工作可能產(chǎn)生的各種表型變異及其作用還缺乏足夠和充分的了解,因此現(xiàn)階段對(duì)其安全性的評(píng)價(jià)一般采取個(gè)案分析的原則。大面積釋放之前必須對(duì)轉(zhuǎn)基因微生物在環(huán)境中發(fā)生基因轉(zhuǎn)移的潛力、存活能力、擴(kuò)散能力及對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的潛在影響等進(jìn)行生態(tài)學(xué)研究和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，還要探索有效的檢測(cè)方法和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)策略。第15頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、受體微生物的安全性評(píng)價(jià)1

受體微生物概述受體微生物是被導(dǎo)入了重組DNA的微生物，其安全性評(píng)價(jià)要考慮以下幾個(gè)方面。受體微生物背景資料和生物學(xué)特性：分類地位、天然野生還是人工培養(yǎng)、應(yīng)用情況、是否對(duì)人畜產(chǎn)生過不良影響、演變?yōu)橛泻ι锏目赡苄浴⒎敝撑c擴(kuò)散方式。受體微生物所適應(yīng)的生態(tài)環(huán)境：地理分布、自然生境、

生長(zhǎng)發(fā)育要求、與其他生物的生態(tài)關(guān)系，對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響及潛在危險(xiǎn)性。受體微生物的遺傳變異：遺傳穩(wěn)定性、質(zhì)粒穩(wěn)定性及其潛在危險(xiǎn)、轉(zhuǎn)座子狀況及潛在危險(xiǎn)、是否發(fā)生過對(duì)人畜有危害的變異、自然條件下與其他微生物、動(dòng)物發(fā)生基因重組的可能性、監(jiān)測(cè)和監(jiān)控的可能性。第16頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2

受體微生物安全等級(jí)根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》第十一條有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，分為I-IV級(jí)，即：不存在危險(xiǎn)、低度危險(xiǎn)、中度危險(xiǎn)、高度危險(xiǎn)。常用的受體微生物的安全等級(jí)如下：

巴斯畢赤酵母GS115和啤酒酵母AB103

定為

I級(jí)；

大腸桿菌BL21

定為

I級(jí)；

禽痘病毒定為

I級(jí)；

痘苗病毒和腺病毒定為

Ⅱ級(jí)；

沙門氏菌和志賀氏菌定為Ⅱ級(jí)；

單核細(xì)胞增生李斯特菌定為Ⅲ級(jí)；

重組卡介苗(分枝桿菌屬)定為

I級(jí)；第17頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

啤酒酵母大腸桿菌

痘病毒腺病毒沙門氏菌志賀氏菌李斯特菌分支桿菌第18頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、轉(zhuǎn)基因操作的安全性評(píng)價(jià)1轉(zhuǎn)基因操作安全性評(píng)價(jià)概述所引入的基因或?qū)⒈恍揎椀男誀畹奶匦浴?/p>

實(shí)際插入的序列及操作過程中將被刪除的序列：

大小和結(jié)構(gòu)、性狀和功能、序列信息及拷貝數(shù)。目的基因與載體構(gòu)建的圖譜：

載體的特性、安全性和各插入片段的資料；

能否向不含該類基因的微生物轉(zhuǎn)移及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)?；虿僮鞣椒ǎ?/p>

基因操作對(duì)受體生物安全等級(jí)的影響；

目的基因表達(dá)的穩(wěn)定性及其檢測(cè)；

重組DNA的分子結(jié)構(gòu)、復(fù)制特性和安全性?；虿僮饔绊懙念愋停侯愋?

-增加安全性；

類型2

-不影響安全性；類型3

-降低安全性。

第19頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3

常用菌株轉(zhuǎn)基因操作的安全性酵母菌

轉(zhuǎn)入的表達(dá)基因：抗菌肽基因、植酸酶基因、

生長(zhǎng)素基因、甘露聚糖酶基因。

基因操作對(duì)酵母菌安全性影響：定為類型

2大腸桿菌：轉(zhuǎn)入的表達(dá)基因：生長(zhǎng)素基因、酸性植酸酶基因、豬防御素基因。

基因操作對(duì)大腸桿菌安全性影響：定為類型

2痘苗病毒、禽痘病毒和腺病毒：轉(zhuǎn)入的表達(dá)基因：病原體抗原基因、血凝素基因、

腫瘤抗原基因、胸苷激酶基因、重組病毒等

基因操作對(duì)其安全性影響：定為類型

2第20頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一沙門氏菌轉(zhuǎn)入的表達(dá)基因：病原體抗原或抗原亞單位基因

基因操作對(duì)其安全性影響：定為類型

2志賀氏菌轉(zhuǎn)入的表達(dá)基因：大腸桿菌腸毒素基因、

動(dòng)物抗原蛋白基因、大腸桿菌菌毛抗原基因

基因操作對(duì)其安全性影響：定為類型

2李斯特菌轉(zhuǎn)入的表達(dá)基因：病原體抗原或抗原亞單位基因

腫瘤抗原基因。

基因操作對(duì)其安全性影響：定為類型

2重組卡介苗轉(zhuǎn)入的表達(dá)基因：病原體抗原或抗原亞單位基

基因操作對(duì)其安全性影響：定為類型

2第21頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物的安全性評(píng)價(jià)1

動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物安全性評(píng)價(jià)的內(nèi)容動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物的生物學(xué)特性。動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)動(dòng)物的安全性。動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)人類的安全性及潛在危險(xiǎn)。動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全性。動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物的檢則和鑒定技術(shù)。動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物的安全等級(jí)分為4個(gè)等級(jí)

其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)考慮：受體微生物安全等級(jí)I-IV級(jí)

基因操作的影響類型1-3

類型

綜評(píng)價(jià)之后確定：轉(zhuǎn)基因微生物的安全性

I-IV

級(jí)第22頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一受體安全等級(jí)基因操作轉(zhuǎn)基因微生物

安全等級(jí)I類型12安全等級(jí)I類型3安全等級(jí)

IⅡ

Ⅲ

Ⅳ

安全等級(jí)Ⅱ類型12安全等級(jí)

IⅡ

類型3安全等級(jí)ⅡⅢ

Ⅳ

安全等級(jí)Ⅲ類型1安全等級(jí)

IⅡ

Ⅲ類型2安全等級(jí)

Ⅲ

類型3安全等級(jí)

Ⅲ

Ⅳ

安全等級(jí)Ⅳ類型1安全等級(jí)

I

ⅡⅢⅣ類型2安全等級(jí)

Ⅳ類型3安全等級(jí)

Ⅳ第23頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2幾種代表性受體微生物轉(zhuǎn)基因后的安全性轉(zhuǎn)重組抗菌肽基因酵母菌：華南農(nóng)大、深圳藝鵬公司、廣州微生物所和廣州華桑公司聯(lián)合研制，已通過中間試驗(yàn)和環(huán)境釋放安全性評(píng)價(jià)，在動(dòng)物體內(nèi)未檢出殘留，2004年7月獲農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)生產(chǎn)。痘苗病毒-狂犬病毒糖蛋白G重組體：已在多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)注冊(cè)，我國(guó)評(píng)定的安全等級(jí)為Ⅱ級(jí)。轉(zhuǎn)基因禽痘病毒：已用于生產(chǎn)抗雞新城疫疫苗、H5亞型禽流感疫苗、狂犬病毒糖蛋白重組疫苗，根據(jù)我國(guó)有關(guān)機(jī)構(gòu)和部門的安全性評(píng)價(jià)，其安全等級(jí)為Ⅰ級(jí)，可望不久的將來(lái)投入生產(chǎn)。轉(zhuǎn)p53基因腺病毒：導(dǎo)入了腫瘤抑制基因p53，其產(chǎn)品為“今又生”重組人p53腺病毒注射液，已獲國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)生產(chǎn)，其安全等級(jí)為Ⅱ級(jí)。第24頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一轉(zhuǎn)基因沙門氏菌：主要用于生產(chǎn)重組病原生物抗原疫苗、抗腫瘤疫苗和口服生長(zhǎng)抑素疫苗，經(jīng)安全性評(píng)價(jià)其安全等級(jí)為Ⅱ級(jí)。其安全性主要是針對(duì)沙門氏菌的擔(dān)憂，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中過量服用可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損并引起部分動(dòng)物死亡。轉(zhuǎn)基因志賀氏菌：還未獲批準(zhǔn)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)安全性評(píng)價(jià)其安全等級(jí)為Ⅱ級(jí)。其主要的副作用是引起炎癥和發(fā)熱。轉(zhuǎn)基因單核細(xì)胞增生李斯特菌：還未獲批準(zhǔn)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)安全性評(píng)價(jià)其安全等級(jí)為Ⅱ級(jí)。由于其宿主范圍較廣，載體安全體系復(fù)雜，存在一定安全問題，其應(yīng)用可能受限。轉(zhuǎn)基因（重組）卡介苗：已有多種疫苗進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)，尚未獲批進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)安全性評(píng)價(jià)其安全等級(jí)為Ⅰ級(jí)，具有較高的安全性。第25頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3減毒病毒和細(xì)菌疫苗中存在的隱患毒力及反應(yīng)原性回復(fù)：減毒表型要穩(wěn)定并防止回復(fù)突變?cè)斐啥玖貜?fù)，可用雙基因缺失突變解決；水平基因轉(zhuǎn)移：含外源基因的活載體即轉(zhuǎn)基因生物體釋放在環(huán)境中，可能引起轉(zhuǎn)基因的水平轉(zhuǎn)移。如果轉(zhuǎn)基因微生物毒株或外源基因片段帶致病基因、抗藥基因等，有可能通過突變或基因重組引起生物災(zāi)害。結(jié)合應(yīng)用條件致死突變可能防止。載體的抗生素抗性基因：主要擔(dān)憂是可能引起病源菌的抗藥性或耐藥性，可通過改變選擇標(biāo)記來(lái)解決問題。潛在性：指DNA疫苗注射后整合到宿主細(xì)胞基因組DNA上、或整合后引起宿主基因失活、或引起細(xì)胞癌變的可能性。第26頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四、動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)1動(dòng)物轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的內(nèi)容轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)品的穩(wěn)定性；生產(chǎn)、加工活動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)基因微生物安全性的影響；

分為三個(gè)類型：

類型1-增加轉(zhuǎn)基因微生物的安全性類型2-不影響轉(zhuǎn)基因微生物的安全性類型3-降低轉(zhuǎn)基因微生物的安全性轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)品與轉(zhuǎn)基因微生物在環(huán)境安全性方面的差異；轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)品與轉(zhuǎn)基因微生物在對(duì)人類健康影響方面的差異。參照《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》第十四條有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，確定轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)品安全等級(jí)。第27頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2幾類動(dòng)物用轉(zhuǎn)基因微生物產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)品：從其濾液或菌體回收產(chǎn)品；生產(chǎn)和加工活動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物影響類型為類型2；轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)人畜和環(huán)境具有較高的安全性；因此，轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)品的安全等級(jí)為Ⅰ級(jí)。轉(zhuǎn)基因大腸桿菌產(chǎn)品：產(chǎn)品純度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、安全性好，生產(chǎn)和加工活動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物影響為類型2，因此轉(zhuǎn)基因大腸桿菌產(chǎn)品的安全等級(jí)為Ⅰ級(jí)。轉(zhuǎn)基因病毒產(chǎn)品：轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)或其裂解物中，通過收獲細(xì)胞培養(yǎng)物制備相關(guān)產(chǎn)品(如液體疫苗或凍干疫苗)，生產(chǎn)過程在封閉環(huán)境中進(jìn)行，生產(chǎn)、加工活動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物影響為類型2，轉(zhuǎn)基因病毒產(chǎn)品安全等級(jí)等同于重組病毒。第28頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一減毒菌的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品：

主要是活疫苗產(chǎn)品，通過轉(zhuǎn)基因減毒菌的培養(yǎng)、收集培養(yǎng)物、離心收集菌體、加入保護(hù)劑、轉(zhuǎn)入西林瓶、制備液體疫苗或凍干疫苗；

生產(chǎn)過程嚴(yán)格GMP要求組織生產(chǎn)；

產(chǎn)品穩(wěn)定性好、加入保護(hù)劑安全有效，沒有引入有害物質(zhì)；生產(chǎn)和加工活動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物影響類型為類型2；

因此轉(zhuǎn)基因活菌產(chǎn)品的安全性等同于轉(zhuǎn)基因的減毒菌株。

第29頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)植物用轉(zhuǎn)基因微生物安全性評(píng)價(jià)一、受體微生物的安全性評(píng)價(jià)1評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容受體微生物的背景資料受體微生物的生物學(xué)特性受體微生物的生態(tài)環(huán)境受體微生物的遺傳變異根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》附錄Ⅲ中規(guī)定的評(píng)價(jià)方法和依據(jù)，分析植物用轉(zhuǎn)基因微生物可能對(duì)人畜和生態(tài)環(huán)境可能存在的危害和潛在的危險(xiǎn)程度，為采取安全管理措施和防控潛在危害提供科學(xué)依據(jù)。第30頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2主要受體微生物的安全性評(píng)價(jià)桿狀病毒的安全性評(píng)價(jià)：

被開發(fā)為生物殺蟲劑的桿狀病毒是核型多角體病毒NPV和顆粒體病毒CV，專性感染節(jié)肢動(dòng)物，昆蟲是其自然宿主，每種桿狀病毒能感染一種或幾種昆蟲。

大量試驗(yàn)表明，桿狀病毒對(duì)動(dòng)植物和人類是安全的，NPV在田間施用不會(huì)引起環(huán)境污染，用于生物防治的桿狀病毒制劑對(duì)有益昆蟲也是安全的。

桿狀病毒的安全性已得到

公認(rèn)，根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因

生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》

第十一條的規(guī)定，確定桿狀病毒的安全等級(jí)為I級(jí)。第31頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第32頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一熒光假單孢菌的安全性評(píng)價(jià)

為好氧的革蘭氏陰性桿菌或球桿菌，是土壤和水體微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分。

是根際促生菌，通過其產(chǎn)生的多種次生代謝物和在根際定殖防治多種植物病害。

作為轉(zhuǎn)基因受體菌株是從自然環(huán)境中分離的生防菌，具有良好的安全性，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境的危害，對(duì)多種植物病原菌有較好的拮抗作用。

根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》第十一條的規(guī)定，確定桿狀病毒的安全等級(jí)為I級(jí)第33頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第34頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一枯草芽孢桿菌的安全性評(píng)價(jià)枯草芽孢桿菌為嗜溫性好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，在自然界中廣泛存在，是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生細(xì)菌。

枯草芽孢桿菌對(duì)人畜無(wú)害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，經(jīng)多種農(nóng)作物試驗(yàn)對(duì)多種病害表現(xiàn)出良好的防治效果。

枯草芽孢桿菌制劑1988年已作為農(nóng)藥登記，國(guó)內(nèi)外已有多種枯草芽孢桿菌殺菌劑投入實(shí)際應(yīng)用。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》第十一條的規(guī)定，確定桿狀病毒的安全等級(jí)為I級(jí)。第35頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第36頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一木霉的安全性評(píng)價(jià)

是自然界廣泛存在的天然生防菌，用于防治多種植物真菌性病害，其活菌制劑無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)殘毒，不傷害土壤中其他有益微生物。

對(duì)動(dòng)物和環(huán)境無(wú)害，不影響土壤的微生態(tài)循環(huán)。

根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》第十一條的規(guī)定，確定桿狀病毒的安全等級(jí)為I級(jí)。聯(lián)合固氮菌的安全性評(píng)價(jià)

定植于根表或根際，能侵入根的皮層形成共生關(guān)系，有固氮作用，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，增加產(chǎn)量。

根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》第十一條的規(guī)定，確定桿狀病毒的安全等級(jí)為I級(jí)。第37頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一重組根瘤菌的安全性評(píng)價(jià)

為一類革蘭氏陰性好氧細(xì)菌，其固氮作用成為農(nóng)業(yè)的主要氮源供應(yīng)，根瘤菌劑已在世界范圍內(nèi)得到推廣和普及。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》第十一條的規(guī)定，確定重組根瘤菌的安全等級(jí)為I級(jí)蘇云金芽孢桿菌的安全性評(píng)價(jià)

為革蘭氏陽(yáng)性的土壤細(xì)菌，可在菌體一端形成內(nèi)生芽孢而另一端同時(shí)形成伴孢晶體，對(duì)20多種重要農(nóng)作物害蟲有顯著防治效果。

對(duì)人畜無(wú)害，對(duì)環(huán)境安全，根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》第十一條的規(guī)定，確定桿狀病毒的安全等級(jí)為I級(jí)。第38頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、基因操作的安全性評(píng)價(jià)對(duì)植物用轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)時(shí)，主要考慮以下幾方面內(nèi)容：

----植物用轉(zhuǎn)基因微生物中引入或修飾性狀和特征；----實(shí)際插入或刪除序列的資料；----載體的名稱和來(lái)源；載體特性和安全性；----載體插入?yún)^(qū)域各片段的資料；

----基因操作方法；重組DNA分子的結(jié)構(gòu)、復(fù)制特性和安全性。

----目的基因的生存前景和表達(dá)的穩(wěn)定定性?；虿僮鲗?duì)受體生物安全性影響分為3種類型第39頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1桿狀病毒基因操作的安全性評(píng)價(jià)針對(duì)野生型桿狀病毒殺蟲速度相對(duì)較慢、寄主范圍較窄的缺陷，對(duì)其基因操作主要包括：

----缺失病毒非必需基因(無(wú)關(guān)復(fù)制)增加殺蟲效果；

----插入外源基因提高殺蟲速度,包括昆蟲激素基因、昆蟲毒素基因、植物蛋白酶抑制基因、昆蟲病毒增強(qiáng)蛋白(增強(qiáng)病毒對(duì)幼蟲的感染力)基因。表達(dá)系統(tǒng)常用啟動(dòng)子是桿狀病毒本身的啟動(dòng)子，也可是組成型啟動(dòng)子hsp70或其他啟動(dòng)子。由于插入的外源基因均是針對(duì)昆蟲，對(duì)人畜和環(huán)境無(wú)害，基因操作對(duì)受體生物安全性影響定為類型2，即不影響安全性。第40頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2

熒光假單孢菌基因操作的安全性評(píng)價(jià)對(duì)熒光假單孢菌的基因操作主要包括：

轉(zhuǎn)入Bt殺蟲基因形成殺蟲防病雙價(jià)基因工程菌；使用質(zhì)粒載體和非抗生選擇標(biāo)志，完全性較高，但遺傳穩(wěn)定性較低，易在傳代中丟失；

或者使用染色體整合的載體將目的基因整合到細(xì)菌染色體中，達(dá)到穩(wěn)定遺傳。轉(zhuǎn)入的Bt基因的殺蟲目標(biāo)為農(nóng)業(yè)上的害蟲，對(duì)人畜無(wú)害，也不產(chǎn)生環(huán)境污染。因此轉(zhuǎn)基因操作對(duì)假單孢桿菌安全性的影響定為類型2，即不影響受體生物的安全性。第41頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3

枯草芽孢桿菌基因操作的安全性評(píng)價(jià)目前對(duì)枯草芽孢桿菌基因操作主要是導(dǎo)入Bt殺蟲基因，使新構(gòu)建工程菌株具有殺蟲防病的作用。新構(gòu)建枯草芽孢桿菌工程菌中采用的載體有質(zhì)粒載體和染色體整合載體，安全性較高。對(duì)人畜無(wú)害，其基因操作對(duì)安全性影響為類型2。4木霉基因操作的安全性目前對(duì)木霉基因操作主工是導(dǎo)入外源基因(Bt殺蟲基因、幾丁質(zhì)酶基因、隱地蛋白基因)提高抗菌活性或構(gòu)建殺蟲防病工程菌。轉(zhuǎn)基因方法有PEG-CaCl2介導(dǎo)法和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，有潮霉素抗性選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)入基因?qū)θ诵鬅o(wú)害，基因操作安全性為類型2。第42頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5

聯(lián)合固氮菌基因操作的安全性評(píng)價(jià)主要轉(zhuǎn)入對(duì)固氮有正調(diào)控作用的

nifA、hup、ntrc基因以提高固氮活性，或構(gòu)建耐銨固氮工程菌。采用載體為質(zhì)粒載體或轉(zhuǎn)座子載體，安全性較高。所有目的基因均來(lái)自固氮菌，對(duì)人畜無(wú)害，對(duì)環(huán)境安全，故對(duì)固氮菌基因操作安全性定為類型2。6重組根瘤菌基因操作的安全性評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)入正調(diào)節(jié)基因

nifA提高根瘤菌固氮酶活性，或轉(zhuǎn)入四碳二羧酸系統(tǒng)的dct基因提高固氮效率。采用載體為Tn5轉(zhuǎn)座子載體，可將攜帶的外源基因插入細(xì)菌基因組DNA中。外源基因和載體對(duì)人畜無(wú)害，對(duì)環(huán)境安全，故基因操作的安全性為類型2。第43頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一7

蘇云金芽孢桿菌基因操作的安全性評(píng)價(jià)基因操作的目的是拓寬殺蟲活性譜、提高殺蟲效果、延緩昆蟲對(duì)毒蛋白產(chǎn)生抗性。轉(zhuǎn)入的基因主要有：提高抗蟲活性的新殺蟲基因CryIAc、增加抗蟲譜的Cry3Aa基因。采用的載體為轉(zhuǎn)座子載體或去掉抗生素抗性基因的位點(diǎn)專一性重組質(zhì)粒載體。目的基因均來(lái)自天然菌株，可提高工程菌的殺蟲活性和擴(kuò)大抗蟲譜，根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》第十二條確定蘇云金芽孢桿菌的相關(guān)基因操作為類型2，即基因操作不影響受體菌的安全性。第44頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、植物用轉(zhuǎn)基因微生物的安全性評(píng)價(jià)植物用轉(zhuǎn)基因微生物的安全性評(píng)價(jià)，主要考慮以下幾個(gè)方面：與受體微生物相比，其定殖、存活、擴(kuò)展、致病性、毒性、遺傳變異等方面的能力是否改變；與受體微生物相比，其與植物、動(dòng)物、人類或與其他微生物的生態(tài)關(guān)系是否發(fā)生改變；與人畜接觸的可能性及危險(xiǎn)性；與同用途的其他生物農(nóng)藥、其他生物肥料相比較的安全性；對(duì)應(yīng)用范圍內(nèi)的生態(tài)環(huán)境的影響及潛在危險(xiǎn)性；對(duì)靶標(biāo)生物或非靶標(biāo)生物的有益性或有害性。第45頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1

轉(zhuǎn)基因桿狀病毒的安全性評(píng)價(jià)已有實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因桿狀病毒對(duì)非靶標(biāo)鱗翅目昆蟲和非靶標(biāo)鱗翅目節(jié)肢動(dòng)物是安全的通過動(dòng)物注射和皮膚接觸試驗(yàn)，證明其對(duì)哺乳動(dòng)物是安全的。不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，僅短期表達(dá)。重組病毒殺蟲劑對(duì)捕食天敵的影響與野生病毒基本相同，對(duì)捕食天敵個(gè)體發(fā)育與種群特征的影響很小，通過捕食天敵而獲得的擴(kuò)散力很有限。病毒DNA不存在于寄生性天敵的組織中。在生態(tài)效應(yīng)方面，重組病毒比野生病毒的適應(yīng)性較低，對(duì)環(huán)境影響也低，比野生病毒危險(xiǎn)性低。重組病毒具有可靠的安全性，安全等級(jí)為等級(jí)I。第46頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2

轉(zhuǎn)基因熒光假單孢菌的安全性評(píng)價(jià)土壤跟蹤監(jiān)測(cè)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因熒光假單孢菌對(duì)土壤細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生可檢測(cè)的影響。轉(zhuǎn)三價(jià)Bt-Cry基因的熒光假單孢菌經(jīng)溫室和田間釋放證明對(duì)人畜安全無(wú)毒，安全等級(jí)為等級(jí)I。北京和江蘇連云港對(duì)轉(zhuǎn)基因熒光假單孢菌IPP202和BioP8菌株的田間試驗(yàn)表明，沒有在土壤中殘留和擴(kuò)散，對(duì)土壤