大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備原理步驟以及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化解析

1.認(rèn)識(shí)感覺(jué)態(tài)細(xì)胞生理特征及制備條件，掌握大腸桿菌感覺(jué)態(tài)細(xì)胞制備方法。DNA半乳糖苷酶基因插入失活選擇 (一)大腸桿菌感覺(jué)態(tài)細(xì)胞制備的原理所謂感覺(jué)態(tài)，是指細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中的某一階段的培育物，只有某一世長(zhǎng)階段中的細(xì)菌才能作為DNA成后，細(xì)胞生理狀態(tài)會(huì)發(fā)白質(zhì)和酶，負(fù)責(zé)供體DNA的聯(lián)合和加工等。細(xì)胞表面正電荷增添，通透，形成能接受外來(lái)的DNA分子的受體位點(diǎn)等。本實(shí)驗(yàn)為了把外源DNA(重組質(zhì)粒)引 (1)抽芽的芽孢桿菌簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)變； (2)大腸桿菌的原生質(zhì)體不可以被噬菌體感染，卻能受噬菌體DNA轉(zhuǎn)變； (3)適當(dāng)?shù)娜芫改芴嵘D(zhuǎn)變率。 (2)細(xì)胞分裂過(guò)程中，向來(lái)有局部原生質(zhì)化，但感覺(jué)態(tài)只在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的中初期出現(xiàn)； (3)分別到感覺(jué)態(tài)因子，能使非感覺(jué)態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成感覺(jué)細(xì)胞。當(dāng)前對(duì)感覺(jué)態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變理論還沒(méi)有有一致結(jié)論，可是很多實(shí)驗(yàn)室向來(lái)進(jìn)行探究，試圖從實(shí)驗(yàn)中CaCl對(duì)受體菌辦理，可提升轉(zhuǎn)變效率幾十倍，往常把細(xì)胞懸浮l (二)重組DNA的轉(zhuǎn)變?cè)鞤NA是rec基因缺點(diǎn)型的突變體，同時(shí)它們一定是限制系統(tǒng)缺點(diǎn)或體細(xì)胞中的穩(wěn)固性。制備的大腸桿菌細(xì)胞就擁有這三種缺點(diǎn)(rk-mk-rec-)同時(shí)此受體細(xì)胞仍是氨芐青霉素敏感(Ap)。在體外建立好的重組分子上擁有分解氨芐青霉素(Ap)基因存在，當(dāng)它導(dǎo)入受體細(xì)胞后，就立的重組子。一個(gè)多克隆位點(diǎn),但并無(wú)損壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功體時(shí)可形成擁有酶活性的蛋白質(zhì)。這類lacZ基因上缺失近操控基因區(qū)段的突變體與帶有完好位點(diǎn)上后會(huì)致使讀碼框架改變,表達(dá)蛋白失活,產(chǎn)生的氨基酸片段失掉α-互補(bǔ)能力所以在相同條件下含重,組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)變子在生色引誘培育基上只好形成白色菌落。由此可將重組質(zhì)粒與自己環(huán)化的載體DNA分件，提升轉(zhuǎn)變率是很有可能的，一些研究表示以下要素能夠提升轉(zhuǎn)變率： (3)攤平板條件會(huì)影響轉(zhuǎn)變率；(4)對(duì)不一樣轉(zhuǎn)變菌株熱辦理(效應(yīng)不一致)。除上述要素外，轉(zhuǎn)變?cè)囼?yàn)還注意以下問(wèn)3、在平板上涂布細(xì)菌時(shí)。注容防止頻頻往返涂布，由于感覺(jué)態(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過(guò)多三、資料 器與器皿恒溫振蕩器分光光度計(jì)電動(dòng)積淀離心計(jì)旋渦混淆器恒溫培育箱隔電熱恒溫水浴鍋恒溫?fù)u床一般冰箱Eppendorf樣器微波爐三角燒瓶試管刻度離心管保溫瓶酒精燈等 (二)菌種(三)培育基與試劑3.氨芐青霉素溶液(50毫克/毫升)4.DNA連結(jié)反響液X-gal儲(chǔ)液和4μlIPTG儲(chǔ)液,用無(wú)菌玻棒將溶液涂勻于37℃下擱置3-4小時(shí),使培育基表面的 (一)大腸桿菌感覺(jué)態(tài)細(xì)胞制備BB養(yǎng)留宿(約16小時(shí))，必需時(shí)在顯微鏡下鏡檢菌細(xì)胞能否形態(tài)一致，有無(wú)雜菌污染。移液管無(wú)菌條件下，取留宿培育液三移液管無(wú)菌條件下，取留宿培育液三4、取1毫升培育液以未接種的LB作空白比較，在751分光光度計(jì)上測(cè)OD550的光密度無(wú)菌條件下將上述1毫升菌液倒入1.5毫升EP離心管中(離心管應(yīng)帶蓋并高壓滅菌過(guò))，7、無(wú)菌條件下，倒去上清LB，倒斜離心管，讓LB流干，留下積淀菌體，加入預(yù)冷的mmolLCaCl液600微升，用微量取樣器輕輕吸沖底部積淀菌體，使其懸浮后，把2勻后于冰浴中擱置30分鐘。 fLB，共涂布三個(gè)培育皿。5.用移液器取未經(jīng)轉(zhuǎn)變的受體大腸桿菌感覺(jué)態(tài)菌液0.1毫升直接涂布于含儲(chǔ)液50μg/mlAmp、40ml7.次日拿出培育皿，察看比較平皿和轉(zhuǎn)變平皿菌落狀況。比較平皿因受體菌對(duì)Amp敏感，故不可以在含Amp