流式細(xì)胞術(shù)在臨床科研中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)在臨床科研中的應(yīng)用第1頁/共48頁基于流式細(xì)胞術(shù)的單細(xì)胞分析在臨床及科研中的應(yīng)用第2頁/共48頁(一)流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是利用流式細(xì)胞儀對生物顆粒包括細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、各類組織細(xì)胞、血小板等)、微生物以及人工合成微球的多種物理和生物學(xué)特性進行定量分析，并能對特定細(xì)胞群體加以分選的細(xì)胞參量分析技術(shù)。一、流式細(xì)胞術(shù)的基本原理第3頁/共48頁(二)FCM的工作原理1.熒光染色(1)用熒光染料直接染色，如：PI(2)用熒光抗體間接染色，F(xiàn)ITC,PE2.液流技術(shù)：細(xì)胞懸液被吸入檢測室后，在鞘液的約束下，通過噴嘴，使其形成單細(xì)胞懸液。3.激光技術(shù)：散射光信號(FS、SS)

熒光信號(FL1、FL2、FL3、FL4)4.數(shù)據(jù)處理第4頁/共48頁FlowCellInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid第5頁/共48頁LaserFluorescenceDetectorsFluorescenceFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)第6頁/共48頁PMTPMTPMTPMT4DichroicFiltersBandpassFiltersFlowCytometryPrincipleLaser1234Flowcell525BP575BP620BP675BP第7頁/共48頁第8頁/共48頁流式細(xì)胞儀檢測平臺的獨特之處單細(xì)胞為檢測單位速度快（>100000細(xì)胞/秒）靈敏度高（具有1/10000）多色標(biāo)記---多種信息能夠同時檢測細(xì)胞表型，功能，蛋白表達，磷酸化現(xiàn)象等，是細(xì)胞研究中唯一可以多角度，深層次剖析細(xì)胞的工具

特異、靈敏、多元化、高速、客觀、省時第9頁/共48頁腫瘤學(xué)應(yīng)用（1）-DNA及細(xì)胞周期分析DNA含量測定解析細(xì)胞周期細(xì)胞增殖動力學(xué)變化早期診斷探討化療藥物的作用機制，化療藥物選擇放療強度、時間決定評估療效判斷預(yù)后和轉(zhuǎn)移第10頁/共48頁腫瘤學(xué)應(yīng)用（2）-膜抗原分析造血系統(tǒng)腫瘤的分型腫瘤基因表達產(chǎn)物多藥耐藥性基因的表達產(chǎn)物腫瘤相關(guān)抗原激素受體淋巴細(xì)胞亞群其它與癌細(xì)胞生物行為有關(guān)因子第11頁/共48頁腫瘤學(xué)應(yīng)用（3）－細(xì)胞凋亡分析DNA單染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡峰（Ap峰，

Apoptosis），壞死及其它原因引起的細(xì)胞碎片形成不規(guī)則的峰形，位于Ap峰與G1峰之間。AnnexinV熒光標(biāo)記，與磷酯酰絲氨酸（細(xì)胞凋亡早期從膜內(nèi)暴露到膜外）結(jié)合，F(xiàn)CM檢測。多色分析，熒光探針標(biāo)記DNA和蛋白質(zhì)。第12頁/共48頁腫瘤的臨床應(yīng)用細(xì)胞周期和倍體分析淋巴細(xì)胞及其亞群白血病免疫分型及殘留第13頁/共48頁DNA細(xì)胞周期分析與臨床應(yīng)用

細(xì)胞周期0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細(xì)胞數(shù)量2N4N第14頁/共48頁

利用特殊的熒光染料與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被熒光染料染色的細(xì)胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀通過測定細(xì)胞的熒光強度推算出細(xì)胞的DNA含量，解析細(xì)胞周期。細(xì)胞DNA分析原理第15頁/共48頁DNA檢測常用熒光染料355nm或375nm：Hoechst33342、DAPI、DyeCycle?Violet488nm：PI、7-AAD、DyeCycle?Green、DyeCycle?Orange、633nm：DRAQ5-FCM在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用主要是DNA和抗體標(biāo)記-DNA標(biāo)記主要是488nm激發(fā)的PI-抗體標(biāo)記則主要是488nm激發(fā)的FITC、PE、PC5、PC7等染料第16頁/共48頁DNA細(xì)胞周期分析參數(shù)DNA倍體性Ploidy細(xì)胞內(nèi)染色體DNA含量二倍體Diploid正常體細(xì)胞內(nèi)染色體DNA含量DNA指數(shù)（DI）測定標(biāo)本的G0/G1期細(xì)胞DNA含量與同種系正常細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞

DNA含量的比值，表示細(xì)胞倍體性S期含量SPFS期細(xì)胞占總周期細(xì)胞的比例CVG0/G1期細(xì)胞DNA含量變異系數(shù)第17頁/共48頁DNA的倍體和DNA指數(shù)的關(guān)系DI=樣品G0/1細(xì)胞峰均道值正常二倍體標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞G0/1期細(xì)胞均道值第18頁/共48頁FCM在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用-血液標(biāo)本腫瘤患者的免疫功能檢查腫瘤患者的粘附分子檢查ICAM-1CD54ICAM-2CD102ICAM-3CD106第19頁/共48頁FCM在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用-脫落細(xì)胞DNA分析尿液宮頸分泌物胸腹水肺泡灌洗液各種刺激液食道鏡鉗取的活檢組織支氣管鏡鉗取的活檢組織等第20頁/共48頁ＤＮＡ倍體檢測轉(zhuǎn)移性癌良性反應(yīng)性增生第21頁/共48頁趙XX淋巴結(jié)細(xì)針穿刺DNA出現(xiàn)異陪體，CD45陰性，幾乎所有標(biāo)記都是陰性（轉(zhuǎn)移性癌）第22頁/共48頁顏XX淋巴結(jié)細(xì)針穿刺

非霍奇金淋巴瘤（彌漫大B細(xì)胞型）

AnnArbor分期IIIA期、IPI評分高危組

第23頁/共48頁DNA含量的表示細(xì)胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指數(shù)（DNAindex，DI)表示相對含量，一個正常的二倍體細(xì)胞峰，其G0/G1期細(xì)胞DNA含量為2C，DI值為1.0。DI=（樣本G0/G1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)）/（正常二倍體標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)）第24頁/共48頁對于一個正常人體的二倍體細(xì)胞群，G0/G1期占85-90%以上，S+G2M細(xì)胞占10-15%以下。第25頁/共48頁王XX超聲內(nèi)鏡下膽總管下段刷檢涂片（病理診斷：見癌細(xì)胞，傾向腺癌） 第26頁/共48頁周XX肺泡灌洗液（右上肺腺癌大小1.8*1.0cm) 第27頁/共48頁費XX尿液病理高度可疑癌細(xì)胞（左腎盂尿路上皮癌，低分化,大小3cm×3cm）， 第28頁/共48頁蔣XX淋巴結(jié)（右肺癌伴頸部淋巴結(jié)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移,可能為大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌或分化差癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化） 第29頁/共48頁王XX腹水（婦科腹膜間皮瘤）第30頁/共48頁手術(shù)切除的乳腺腫塊第31頁/共48頁DNA細(xì)胞周期分析臨床意義DNA診斷腫瘤DNA非整倍體細(xì)胞峰或突出的四倍體細(xì)胞峰S期細(xì)胞含量>10-15%DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個重要標(biāo)志在淋巴瘤病理形態(tài)學(xué)不能做出診斷前可提供確切診斷信息DNA非整倍體的交界瘤應(yīng)按惡性對待形態(tài)學(xué)表現(xiàn)良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示惡變可能DNA指數(shù)可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標(biāo)第32頁/共48頁DNA細(xì)胞周期分析臨床意義DNA及倍體分析在某些腫瘤有預(yù)后價值：膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、皮膚黑色素瘤非整倍體的腫瘤惡性程度高，復(fù)發(fā)率高，轉(zhuǎn)移率預(yù)后差。近二倍體和二倍體腫瘤預(yù)后好，少數(shù)腫瘤的DNA分析對預(yù)后無判斷價值。高S期腫瘤一般比低S期對化療敏感。S期比率與腫瘤組織學(xué)分級密切相關(guān)：肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直腸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、腦型星形細(xì)胞瘤第33頁/共48頁DNA細(xì)胞周期分析臨床意義監(jiān)測病情與藥效：流式細(xì)胞術(shù)可精確檢測藥物對腫瘤細(xì)胞的作用，研究腫瘤化療藥物的選擇，制定合理的化療方案，并隨時監(jiān)測病情發(fā)展和治療效果，判斷臨床治療方法的療效或用于探討新藥新方法的作用機理和療效。脫落細(xì)胞DNA分析:

細(xì)胞抽吸物、體液、組織液、灌洗液脫落細(xì)胞的DNA分析。第34頁/共48頁腫瘤細(xì)胞SPF(S期含量)腫瘤細(xì)胞(單克隆)(14.18%)正常骨髓細(xì)胞(2.93%)腫瘤細(xì)胞(多克隆)(28.52%)第35頁/共48頁免疫功能檢測第36頁/共48頁淋巴細(xì)胞亞群分析淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞（CD3+）↓細(xì)胞免疫輔助性Th細(xì)胞(CD3+CD4+)↓抑制T\細(xì)胞毒T(CD3+CD8+)↑B淋巴細(xì)胞（CD19+）體液免疫

NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+）↓能殺傷某些腫瘤細(xì)胞、已經(jīng)被病毒感染的機體細(xì)胞，在機體殺傷腫瘤、防御感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用

第37頁/共48頁激活T淋巴細(xì)胞:CD3+CD25+CD3+HLA-DR+CD3+CD69+誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+CD45RA+抑制性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD8+CD28-細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD8+CD28+記憶T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+CD45RA-CD45RO+未活化T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+CD45RA+CD45RO-淋巴細(xì)胞亞群分析第38頁/共48頁流式蛋白定量技術(shù)的應(yīng)用

（ApplicationofCytometricBeadArray）第39頁/共48頁

正常人體內(nèi)的Th1類細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2）與Th2類細(xì)胞因子（IL-10、IL-5、IL-4）保持著相對的平衡。當(dāng)這種平衡被打破也預(yù)示著疾病的發(fā)生，腫瘤的發(fā)生也伴隨著Th1/Th2的轉(zhuǎn)歸與變化。由于細(xì)胞因子功能的多效性與細(xì)胞因子之間存在相互影響與轉(zhuǎn)化，單個細(xì)胞因子的變化難以清楚的判斷與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，Th1/Th2的分類使腫瘤細(xì)胞免疫學(xué)的概念清晰化，近年來研究Th1/Th2兩類細(xì)胞因子的漂移方向逐漸成為熱點。

Th1/Th2漂移第40頁/共48頁CBA簡介CytometricBeadArray單個樣本，同時定量液相中多種蛋白濃度抗原抗體反應(yīng)原理基于流式細(xì)胞儀平臺

一系列熒光強度不同的微球包被有特異性捕獲抗體，與待測樣本孵育后，形成“三明治”復(fù)合物。

CaptureBead

CaptureAbBead++AnalyteofinterestFluorescentdetectionAb第41頁/共48頁123不同強度紅色熒光的捕獲微球，在FCMFL3檢測不同的目標(biāo)蛋白PE標(biāo)記的檢測抗體，在FCMFL2檢測。熒光強度即為靶蛋白量456CBA檢測原理第42頁/共48頁CytometricBeadArray(CBA)+

IL-8

IL-6100100101101102102103103104104BeadIntensityFL3(670LP)DetectorAbIntensityFL2(585/42BP)R1第43頁/共48頁CBA與ELISA比較分析可溶性蛋白定量分析結(jié)果高靈敏度ELISA抗原檢測的經(jīng)典方法單項檢測每項實驗樣本用量50-200L酶-底物背景干擾CV10-20%BDCBA流式細(xì)胞儀自動檢測多參數(shù)同時檢測樣本用量少50L操作方便，節(jié)省時間標(biāo)準(zhǔn)曲線自動測定，專用軟件自動計算無酶-底物背景干擾提高檢測效率CV5-12%相似點區(qū)別第44頁/共48頁CBA應(yīng)用領(lǐng)域血清、血漿或培養(yǎng)液