傳統(tǒng)測序和二代測序與應(yīng)用

傳統(tǒng)測序和二代測序與應(yīng)用第一頁，共82頁。第二頁，共82頁。Questionsfromlasttalk:基因表達(dá)的組織特異性，請舉例用什么方法可以檢測。用春化現(xiàn)象簡要說明環(huán)境因素對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。RNA加工的類型。什么是RNA干擾，有哪些類型和特征？介紹轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)構(gòu)特性；第三頁，共82頁?；蚪M測序與序列組裝第四頁，共82頁。主要內(nèi)容:什么是基因組DNA測序的方法DNA序列的組裝人類基因組計劃水稻基因組計劃后基因組學(xué)第五頁，共82頁。1.什么是基因組

基因組就是一個物種中所有基因的整體組成。

基因組有兩層意義：遺傳物質(zhì)和遺傳信息。

要揭開生命的奧秘，就需要從整體水平研究基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相互關(guān)系。

第六頁，共82頁。Zeamays8,000Homosapiens3,000Oryzasativa400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana100Saccharomycescerevisiae12E.coli4.6GenomeSize(Mb)第七頁，共82頁。重復(fù)順序

高度重復(fù)順序：

長度：幾個——幾千個bp

拷貝數(shù)：幾百個——上百萬個

首尾相連，串聯(lián)排列

集中分布于染色體的特定區(qū)段（如端粒，著絲粒等）

也稱衛(wèi)星DNA中度重復(fù)順序：

一般分散于整個基因組中；

長度和拷貝數(shù)差別很大單一順序：

基因主要位于單一順序

動物中單一順序約占50％

植物中單一順序約占20％第八頁，共82頁。基因家族

一群具有一致的或相似順序的基因,有的還擔(dān)負(fù)類似的生物學(xué)功能,可以相互補償,比如:E2ftranscriptionfactorMousesymbolHumanOrthologE2f1E2F1E2f2E2F2E2f3E2F3E2f4E2F4E2f5E2F5E2f6E2F6第九頁，共82頁。假基因(Pseudogene)來源于功能基因

但已失去活性

的DNA序列產(chǎn)生假基因的原因有:由重復(fù)產(chǎn)生的假基因;加工的假基因,由RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后再整合到基因組中;殘缺的基因(Truncatedgene)第十頁，共82頁。重疊基因:同一段DNA能攜帶兩種不同蛋白的信息.

重迭基因有以下幾種情況：*一個基因完全在另一個基因內(nèi)部*部分重疊*兩個基因共用少數(shù)堿基對

第十一頁，共82頁。3.DNA測序的方法鏈終止法測序化學(xué)降解法測序自動化測序非常規(guī)DNA測序第十二頁，共82頁。3.1鏈終止法測序(thechainterminationmethod)

基本原理:

通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。FrederickSanger(1918.8.13－2013.11.19)

第十三頁，共82頁。技術(shù)路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

A克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNAC噬?？寺NADPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高酶活性B無5’→3′外切酶活性C無3′→5′外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子,不是羥基第十四頁，共82頁。第十五頁，共82頁。第十六頁，共82頁。3.2化學(xué)降解法測序基本原理:

在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)集團(tuán),再用化合物處理,使DNA分子在被修飾的位置降解.第十七頁，共82頁。技術(shù)路線

將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣?/p>

每個單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶↓

分別用不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體↓

電泳,讀取DNA的核苷酸順序第十八頁，共82頁。Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)技術(shù)

堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對N7進(jìn)行甲基化,使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時,可用肼除去胞嘧啶第十九頁，共82頁。3.3自動化測序基本原理

與鏈終止法測序原理相同,只是用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光,ddGTP標(biāo)記黃色熒光,ddTTP標(biāo)記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.第二十頁，共82頁。H2OBufferBigdyePrimerDNA模板PCR循環(huán)上機結(jié)果測序基本操作反應(yīng)體系：第二十一頁，共82頁。ABI3730測序儀第二十二頁，共82頁。第二十三頁，共82頁。DNA芯片測序

基本原理

（1）將各種排列順序的寡核苷酸點播在芯片上,每個點播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置.

（2）待檢測的DNA分子與芯片溫浴,

（3）凡是能雜交的寡核苷酸都會在確定位置發(fā)出信號,

（4）然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸的順序進(jìn)行對比組裝,拼接成完全的DNA順序.第二十四頁，共82頁。利用基因芯片進(jìn)行雜交測序的原理第二十五頁，共82頁。問題：所測片段較短，一般小于2kb，而基因組很大，怎么辦？第二十六頁，共82頁。4序列的組裝4.1隨機測序與序列組裝

隨機測序也稱”鳥槍法”.

序列組裝原理:直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸.

優(yōu)點:不需預(yù)先了解任何基因組的情況.ABCABCABCABC小片段測序計算機拼裝第二十七頁，共82頁。ABC小片段測序計算機拼裝鳥槍法(Shotgun)測序的問題CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP重復(fù)序列：錯裝第二十八頁，共82頁。實例:流感嗜血桿菌基因組的測序及順序組裝超聲波打斷純化的基因組DNA↓瓊脂糖電泳收集1.6～2.0Kb的區(qū)段、純化

↓構(gòu)建到質(zhì)粒載體中↓隨機挑選19687個克隆,進(jìn)行28643次測序,得到可讀順序為11631485bp↓組裝成140個覆蓋全基因組范圍的獨立的順序重疊群,↓第二十九頁，共82頁。

各重疊群間仍有間隙

順序間隙

物理間隙

↓↓

載體或宿主菌

選用不當(dāng)而被丟失的順序測序時遺漏的測序解決辦法:通過相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫第三十頁，共82頁。4.2

限制測序

限制測序：是指將一段染色體區(qū)段的DNA順序進(jìn)行組裝.

一些已繪制了遺傳圖與物理圖的微生物基因組測序中也采用這一方法.

如高等植物擬南芥基因組的測序完全依據(jù)克隆重疊群,先進(jìn)行各個BAC克隆的隨機測序,再進(jìn)行序列組裝；

水稻基因組測序計劃采取得策略與此相同.第三十一頁，共82頁。4.3Shot-gun法

建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上的”鳥槍法”,即所謂”指導(dǎo)鳥槍法”或”指導(dǎo)測序”。

在人類基因組進(jìn)入測序組裝階段就采用此方法，其基本步驟如下:A構(gòu)建平均為2Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序;B構(gòu)建平均10Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序,讀取2個端部順序;C參考人類基因組圖,特別是大量的STS位標(biāo)作為基點,進(jìn)行序列組裝，排成重疊克隆群.第三十二頁，共82頁。

先將染色體打成比較大的片段(幾十-幾百Kb),利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig),分別測序后拼裝.這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段測序拼裝第三十三頁，共82頁。兩種策略的比較鳥槍法策略

指導(dǎo)測序策略不需背景信息

構(gòu)建克隆群(遺傳、物理圖譜)時間短

需要幾年的時間

需要大型計算機得到的是草圖(Draft)得到精細(xì)圖譜第三十四頁，共82頁。Nanopore（納米孔法）第三十五頁，共82頁。ByOxfordUniversity第三十六頁，共82頁。ByOxfordUniversity第三十七頁，共82頁。ByOxfordUniversity第三十八頁，共82頁。ByOxfordUniversity第三十九頁，共82頁。ByOxfordUniversity第四十頁，共82頁。ByOxfordUniversity第四十一頁，共82頁。第四十二頁，共82頁。第四十三頁，共82頁。Nanopore（納米孔法）Pleaseclickthecentrearea.第四十四頁，共82頁。5.人類基因組計劃

人類基因組計劃（Humangenomeproject）于1990年啟動，我國于1999年加入該計劃，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號染色體短臂上約30Mb的測序任務(wù)。

第四十五頁，共82頁。于軍楊煥明1985杜爾貝克,1990:人類基因組計劃第四十六頁，共82頁。5.1人類基因組計劃的目的

闡明人類基因組30億個堿基對的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因，并搞清其在染色體上的位置;破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識自我;解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長發(fā)育的規(guī)律;認(rèn)識種屬之間和個體之間存在差異的起因、認(rèn)識疾病產(chǎn)生的機制以及長壽與衰老等生命現(xiàn)象、為疾病的診治提供科學(xué)依據(jù)。第四十七頁，共82頁。5.2人類基因組草圖的完成

2000年6月26日是人類歷史上值得紀(jì)念的一天。人類基因組的工作草圖已經(jīng)繪制完畢并于這天向全世界公布。最終完成圖要求測序所用的克隆能忠實地代表常染色體的基因組結(jié)構(gòu)，序列錯誤率低于萬分之一。第四十八頁，共82頁。A.CeleraGenomics人類基因組的測序策略5.3人類基因組測序策略第四十九頁，共82頁。采集5個自愿者的DNA樣品構(gòu)建3種不同插入子大小的基因組文庫2Kb,10Kb和50Kb完成約2700萬次插入子末端測序,總長14800MbGeneBank下載104018個BAC末端順序PFP發(fā)表的公開數(shù)據(jù)主要為BAC克隆的順序,共4443.3Mb隨機測序與序列組裝方法和指導(dǎo)測序與序列組裝方法相結(jié)合進(jìn)行序列組裝第五十頁，共82頁。B國際人類基因組測序策略構(gòu)建BAC克隆↓限制性酶處理獲得指紋↓根據(jù)指紋重疊方法組建BAC克隆重疊群↓根據(jù)STS標(biāo)記,將BAC克隆重疊群標(biāo)定在物理圖上↓每個BAC克隆內(nèi)部采用鳥槍法測序,組裝↓將BAC插入順序與BAC克隆指紋極重疊群對比,將已閱讀的順序錨定到物理圖上第五十一頁，共82頁。第五十二頁，共82頁。5.4人類基因組測序結(jié)果

基因數(shù)是3萬、4萬還是10萬

人類遺傳基因數(shù)量比原先估計的少很多。目前研究表明，人類基因組中約有3萬至4萬個蛋白編碼基因，僅僅是果蠅基因數(shù)目的兩倍，人有而鼠沒有的基因只有300個。此結(jié)論是由兩大科研小組的數(shù)據(jù)是從DNA水平上得出的；而“人類有10萬多個基因”則是從RNA水平上得出的結(jié)論。所以，這些數(shù)據(jù)不能推翻“人類有10萬個基因”的說法。第五十三頁，共82頁。人類基因組研究的驚人發(fā)現(xiàn)?

19號染色體是含基因最豐富的染色體，而13號染色體含基因量最少?目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能?人類基因組中存在“熱點”和大片“荒漠”。在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，也有大片的區(qū)域只有“無用DNA”——不包含或含有極少基因的成分。基因組上大約有1／4的區(qū)域沒有基因的片段。

?

35．3％的基因包含重復(fù)的序列。這說明那些原來被認(rèn)為是“垃圾”的DNA也起重要作用，應(yīng)該被進(jìn)一步研究。第五十四頁，共82頁。什么是單核苷酸多態(tài)性

人類99．9％的基因密碼是相同的，而差異不到0．1％，不同人群僅有140萬個核苷酸差異。這些差異是由“單一核苷酸多樣性”（SNP）產(chǎn)生的，它構(gòu)成了不同個體的遺傳基礎(chǔ)，個體的多樣性被認(rèn)為是產(chǎn)生遺傳疾病的原因。在整個基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬分之一，從而說明人類不同“種屬”之間并沒有本質(zhì)上的區(qū)別。

第五十五頁，共82頁。5.5人類基因組計劃的意義

隨著人類基因組逐漸被破譯，一張生命之圖將被繪就，人們的生活也將發(fā)生巨大變化。人類基因研究的意義在于它可以支持和推動生命科學(xué)中一系列重要的基礎(chǔ)性研究。如基因組遺傳語言的破譯，基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，生命的起源和進(jìn)化，細(xì)胞發(fā)育、生產(chǎn)、分化的分子機理，疾病發(fā)生的機理等。第五十六頁，共82頁。7水稻的基因組

2002年我國科學(xué)家完成了水稻基因組定序和初步分析。出人意表的是，水稻的基因竟比人類基因還要多得多。人類基因大約有3-4萬個，