基因工程基本操作程序

基因工程基本操作程序第一頁(yè)，共23頁(yè)。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞基因編碼區(qū)（編碼序列）：能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，即能夠編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)（調(diào)控序列）：位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的DNA序列，雖不能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，但有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，如啟動(dòng)子、終止子等第二頁(yè)，共23頁(yè)。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)

RNA聚合酶的作用是催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA。它能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開(kāi)始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。第三頁(yè)，共23頁(yè)。真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)與原核細(xì)胞比較，真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的主要特點(diǎn)是：編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的。也就是說(shuō)，能夠編碼蛋白質(zhì)的序列被不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列分隔開(kāi)來(lái)，成為一種斷裂的形式。其中，能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子，一般不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子。第四頁(yè)，共23頁(yè)。真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞基因編碼區(qū)（間隔、不連續(xù)）外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列非編碼區(qū)：與原核生物具有相似功能的啟動(dòng)子、終止子第五頁(yè)，共23頁(yè)。原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較第六頁(yè)，共23頁(yè)。啟動(dòng)子與終止子啟動(dòng)子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能引導(dǎo)RNA聚合酶與正確的基因部位結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄從起點(diǎn)開(kāi)始，沿編碼區(qū)進(jìn)行。終止子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。第七頁(yè)，共23頁(yè)。獲取目的基因從基因文庫(kù)中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成第八頁(yè)，共23頁(yè)。一、目的基因的獲取（一）從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.基因組文庫(kù)將含有某種生物不同基因的許多片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)。受體菌包含了某種生物所有的基因，該受體菌群體稱為這種生物的基因組文庫(kù)。2.部分基因文庫(kù)

受體菌包含了一種生物部分基因，該受體菌群體稱為這種生物的部分基因文庫(kù)，如cDNA文庫(kù)。第九頁(yè)，共23頁(yè)?；蚪M文庫(kù)和部分基因文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)第十頁(yè)，共23頁(yè)。供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段載體限制酶分別與載體連接，載入受體菌導(dǎo)入讓供體細(xì)胞提供的所有DNA片段分別在各個(gè)受體菌中大量復(fù)制（即擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再利用一定方法將目的基因的DNA片段分離出來(lái)。外源DNA擴(kuò)增產(chǎn)生特定性狀目的基因分離第十一頁(yè)，共23頁(yè)。通過(guò)對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因第十二頁(yè)，共23頁(yè)。cDNA合成過(guò)程

第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。第十三頁(yè)，共23頁(yè)?；蚪M文庫(kù)和部分基因文庫(kù)第十四頁(yè)，共23頁(yè)。（3）如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。第十五頁(yè)，共23頁(yè)。PCR技術(shù)—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

原理：前提：條件：PCR擴(kuò)增儀DNA雙鏈復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的兩條鏈為模板溫度控制和緩沖液第十六頁(yè)，共23頁(yè)。前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物。引物：一小段單鏈DNA或RNA，一般20～30個(gè)堿基，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。第十七頁(yè)，共23頁(yè)。2.過(guò)程高溫變性（90~95℃）低溫退火（55~60℃）中溫延伸（70~75℃）雙鏈DNA是在高溫條件下解鏈為單鏈DNA的，因此整個(gè)過(guò)程不需要解旋酶。多次重復(fù)3.特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增第十八頁(yè)，共23頁(yè)。①概念：PCR全稱為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：選修1P60聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第十九頁(yè)，共23頁(yè)。⑥過(guò)程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第二十頁(yè)，共23頁(yè)。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第二十一頁(yè)，共23頁(yè)。（三）通過(guò)DNA合成儀直接合成目的基因DNA