煙大生化35的資料

煙大生化35的資料第1頁/共71頁2023/4/172DNA重組的幾種類型及其主要特點了解Holliday模型細菌基因轉(zhuǎn)移的幾種方式

轉(zhuǎn)座重組及其生物學意義第2頁/共71頁2023/4/173DNA重組（基因重組、遺傳重組

geneticrecombination

基因重排

generearrangenment）

DNA分子內(nèi)或分子間遺傳信息的重新組合

DNA片段在細胞內(nèi)、細胞間，甚至在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然具有復制和表達的功能

意義：迅速增加群體遺傳多樣性、區(qū)分有利、不利突變、通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息參與許多重要的生物學過程（438頁）

自然界基因轉(zhuǎn)移、重組：基因變異、物種進化的基礎繁殖、病毒感染、基因表達、癌基因激活等過程中起重要的作用第3頁/共71頁2023/4/174一、DNA的重組的分類

同源重組（homologousrecombination）特異位點重組（site-specific～）轉(zhuǎn)座重組（transpositional～）第4頁/共71頁2023/4/175二、同源重組

兩條同源區(qū)的DNA分子，通過配對、鏈的斷裂和再連接產(chǎn)生片段交換（crossingover）的過程一般性重組（generalrecombination）兩個染色體或DNA分子相互交換對等部分的過程雙倍體真核生物：減數(shù)分裂，非姐妹染色單體交換相對應的區(qū)域，產(chǎn)生的單倍體配子包含父母本兩方的遺傳信息第5頁/共71頁2023/4/176第6頁/共71頁2023/4/177第7頁/共71頁2023/4/178（一）Holliday模型

——遺傳重組的分子基礎1、Holliday結構4條單鏈形成Holliday結構2、關鍵步驟1）兩個同源染色體DNA排列整齊2）DNA的一條鏈切斷并與另一個DNA對應的鏈連接3）通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA4）Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA第8頁/共71頁2023/4/179第9頁/共71頁2023/4/1710第10頁/共71頁2023/4/1711第11頁/共71頁2023/4/1712MeselsonMRaddingC修正雙鏈斷裂啟動重組啟動減數(shù)分裂第12頁/共71頁2023/4/17133、功能：1）維持種群的遺傳多樣性2）有助于DNA的損傷修復3）真核生物減數(shù)分裂中染色體正確分離到子細胞第13頁/共71頁2023/4/1714(二)細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組1、結合作用conjugation結合作用：質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一個細胞

致育因子（F因子）通過結合作用由F+細胞向F-細胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)質(zhì)粒約1/3的基因與轉(zhuǎn)移有關，traS和traT基因編碼表面排斥蛋白，阻止F+細胞之間的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)+細胞的性菌毛與F-細胞結合后收縮，使二者靠近，TraD蛋白構成轉(zhuǎn)移的通道，在TraI在TraY的幫助下結合到轉(zhuǎn)移起點oriT上，切開一條鏈，使其5?端進入受體細胞，并合成其互補鏈，使F-細胞轉(zhuǎn)化為F+細胞，給體細胞中的單鏈也可以合成互補鏈。第14頁/共71頁2023/4/1715

當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一細胞（細菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為～第15頁/共71頁2023/4/1716第16頁/共71頁2023/4/1717第17頁/共71頁2023/4/1718

在細菌基因轉(zhuǎn)移的不同時間將配對細胞分開，可以確定基因在染色體上的位置。F質(zhì)粒DNA可以通過重組整合到受體的染色體中，使受體菌成為高頻重組（Hrf)菌株，若F質(zhì)粒的DNA未能完整地進入受體菌，則受體菌不能轉(zhuǎn)化為F+,F質(zhì)粒的DNA可以被切割出來，有時可攜帶宿主菌的染色體DNA，稱作F?因子，F(xiàn)?因子攜帶的基因可在受體菌表達。第18頁/共71頁2023/4/1719大腸桿菌染色體的基因圖自然條件下感受態(tài)的形成需要10多種蛋白質(zhì)參與

通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型的過程——轉(zhuǎn)化2、轉(zhuǎn)化transformation實驗室：高濃度的Ca2+處理使細菌形成感受態(tài)第19頁/共71頁2023/4/1720第20頁/共71頁2023/4/1721普遍性轉(zhuǎn)導：宿主菌任意部位的基因取代噬菌體DNA的一部分轉(zhuǎn)入受體菌3、轉(zhuǎn)導作用

transduction通過噬菌體將細菌基因從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌限制性轉(zhuǎn)導：宿主整合部位的DNA取代噬菌體的部分

DNA

進入受體菌的基因與染色體重組第21頁/共71頁2023/4/1722噬菌體的基因重組第22頁/共71頁2023/4/1723

當病毒從被感染的細胞（供體）釋放出來，再次感染另一細胞（受體）時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組第23頁/共71頁2023/4/1724第24頁/共71頁2023/4/1725第25頁/共71頁2023/4/17264、細胞融合細胞質(zhì)膜融合導致基因轉(zhuǎn)移、重組實驗室：溶菌酶除細菌細胞壁，人工促使原生質(zhì)體融合，引起廣泛的重組。第26頁/共71頁2023/4/1727RecA蛋白：多功能蛋白1.NTP酶活性：存在單鏈DNA時，RecA具水解ATP/dATP活性，促進聯(lián)會2.單鏈DNA結合活性：RecA蛋白與單鏈DNA形成絲狀復合物，使其免受核酸酶攻擊3.DNA解旋活性：單鏈切口處解開雙螺旋4.DNA分子間聯(lián)會:部分單鏈DNA區(qū)(三)重組有關的酶第27頁/共71頁2023/4/1728溶解酶（Resolvase）活性斷裂Holliday結構的交聯(lián)橋，完成重組RecBCD：第28頁/共71頁2023/4/1729依賴RecBCD起始的重組模型:RecBCD有依賴ATP的核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶和解螺旋酶活性，當DNA斷裂時，它結合在其游離端，使其解旋并降解，直至酶移動到chi位點（GCTGGTGG)，在其3＇側4-6核苷酸處將鏈切斷，產(chǎn)生3＇游離單鏈，隨后單鏈與RecA結合，開始同源區(qū)重組。第29頁/共71頁2023/4/1730RecA蛋白的絲狀聚合體與DNA的相互作用RecA蛋白的帶狀圖解RecA蛋白的絲狀聚合體，每一圈螺旋由6個RecA蛋白單體構成，其中一個單體由紅色標出。第30頁/共71頁2023/4/1731RecA蛋白引起DNA同源重組的模型第31頁/共71頁2023/4/1732

在大腸桿菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白參與的同源重組。（a）

RuvA四聚體的圖解。四個亞基形成的結構像四個花瓣的花。（b）

RuvA/RuvB的作用：（左）RuvA四聚體結合到Holliday位點；（中）RuvB六聚體結合到雜合雙螺旋的兩對面，DNA穿過其中心，RuvB六聚體的作用像馬達，促進超螺旋分叉點通過復合體移動。（右）RuvC結合到Holliday位點，由其核酸酶活性切斷核酸鏈，切割位點由剪切體辨認。（c）

RuvA四聚體的電荷分布，藍色表示正電荷，紅色表示負電荷，注意正電荷位于四聚體的表面，有四個負電荷區(qū)域位于其中心。（d）假設的RuvA四聚體與Holliday位點結合的結構模型。第32頁/共71頁2023/4/1733三、特異位點重組

原核生物中，有時基因重組依賴于小范圍的同源序列的聯(lián)會，重組只限于該小范圍內(nèi)，只涉及特定位點的同源區(qū)，這類重組稱作～

由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合第33頁/共71頁2023/4/17341、λ噬菌體DNA的整合與切除噬菌體的整合酶識別噬菌體DNA和宿主染色體的特異靶位點，而后發(fā)生的選擇性整合第34頁/共71頁2023/4/1735

通過attP和attB間的相互重組，環(huán)狀的噬菌體DNA轉(zhuǎn)換為整合的原噬菌體，原噬菌體通過attL和attR間的相互重組而切除第35頁/共71頁2023/4/17362、細菌的特異位點重組沙門氏菌兩種鞭毛蛋白表達的調(diào)控第36頁/共71頁2023/4/17373、免疫球蛋白基因的重組IgG的分子結構第37頁/共71頁2023/4/1738（1）（2）（3）（4）（5）第38頁/共71頁2023/4/1739重組位點有7和9nt的信號序列,中間間隔12或23bp。第39頁/共71頁2023/4/1740免疫球蛋白基因重組的模型重組酶（RAC1/RAC2)復合體與重組信號序列結合復合體使編碼序列與重組信號序列之間的雙連斷裂，編碼序列的末端形成發(fā)夾結構。重組信號序列結合形成環(huán)狀結構。編碼序列連接前經(jīng)過加工，連接位點不十分確定，增加了免疫球蛋白的多樣性。DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)和DNA連接酶參與了加工和連接過程。9堿基序列7堿基序列第40頁/共71頁2023/4/1741在不同的核苷酸位點重組可以生成不同的蛋白質(zhì)第41頁/共71頁2023/4/1742四、轉(zhuǎn)座重組（transposition）

McClintock的重要發(fā)現(xiàn)第42頁/共71頁2023/4/17431950，麥克林托克，玉米籽粒顏色遺傳，存在著一種轉(zhuǎn)座因子（transposableelements）控制籽粒顏色，這些因子可在染色體上移動，控制著某些基因表達70年代，夏皮羅（Shapiro），E.coli乳糖操縱子突變株，進行雜交分析，確認轉(zhuǎn)座子的存在。存在于染色體DNA上可自主復制和位移的基本單位稱為轉(zhuǎn)座子第43頁/共71頁2023/4/1744

大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的有些基因可以從一個位置移動到另一位置可移動的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因移位或重排稱為～第44頁/共71頁2023/4/1745轉(zhuǎn)座子移位：導致DNA鏈的斷裂/重接

or某些基因啟動/關閉。引起：a.插入突變；

b.產(chǎn)生新的基因；

c.染色體畸變；

d.生物進化，遺傳效應。轉(zhuǎn)座子：原、真核細胞與同源染色體重組相比，轉(zhuǎn)座子作用頻率低得多，構建突變體有重要意義第45頁/共71頁2023/4/1746

插入序列轉(zhuǎn)座插入序列（insertionsequences，IS）：750～1500bp反向重復序列：9～41bp，位于兩側轉(zhuǎn)座酶編碼基因：產(chǎn)物引起轉(zhuǎn)座，位于中間正向重復序列：4～12bp，位于反向重復序列外側插入序列特有組成：第46頁/共71頁2023/4/1747保守性轉(zhuǎn)座：從原位遷至新位 復制性轉(zhuǎn)座：插入序列復制后，一個復制本遷到新位，另一個保留在原位方式第47頁/共71頁2023/4/1748第48頁/共71頁2023/4/1749第49頁/共71頁2023/4/1750

轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子（transposons）：可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復序列組成

反向重復序列轉(zhuǎn)座酶基因特殊基因：如抗生素抗性基因等第50頁/共71頁2023/4/1751

轉(zhuǎn)座子具有反向末端重復序列以及在靶部位兩側產(chǎn)生的同向重復序列。在該例中靶序列為5bp，轉(zhuǎn)座子末端由9bp反向重復序列組成，數(shù)字1-9指序列重復堿基對。*兩側正向重復***末端反向重復**(一)細菌的轉(zhuǎn)座因子1.插入因子第51頁/共71頁2023/4/17522.組合型轉(zhuǎn)座子：兩個插入序列之間夾著一段序列（如抗性基因）。兩個插入序列可以同向或反向排列，有時均有轉(zhuǎn)座活性，有時只有一個有轉(zhuǎn)座活性。3.復合型轉(zhuǎn)座子：插入序列被轉(zhuǎn)座酶基因取代，圖示為Tn3(TnA家族）的結構。兩端為38bp的反向重復，其兩側為5bp的靶序列，tnpA編碼轉(zhuǎn)座酶，tnpR編碼的蛋白質(zhì)可以作為解離酶（使轉(zhuǎn)座子與受體DNA形成的共整合體重組和解離），也可以作為阻遏蛋白調(diào)節(jié)tnpA和tnpR兩個基因的表達，res為解離的控制位點，TnpR蛋白結合于其上發(fā)揮調(diào)控作用。第52頁/共71頁2023/4/17534.轉(zhuǎn)座的方式轉(zhuǎn)座子可用不同的方式轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色體的斷裂、重復、缺失、倒位、易位等變化。兩個IS10組件構成一個復合轉(zhuǎn)座子，它能使位于他們之間的任何DNA易位。當Tn10是一個小的圓形分子的一部分時，IS10重復序列可轉(zhuǎn)座至環(huán)狀分子的任一側。第53頁/共71頁2023/4/1754

插入序列使靶序列的數(shù)量增加，在插入序列兩側各有一個。第54頁/共71頁2023/4/1755

復制轉(zhuǎn)座作用產(chǎn)生了轉(zhuǎn)座子的一個拷貝，它插入到一個接受位點。給予位點保持不變，給予者和接受者都有轉(zhuǎn)座子的一個拷貝。第55頁/共71頁2023/4/1756

非復制轉(zhuǎn)座作用在未被修復的情況下，可能造成致死突變。第56頁/共71頁2023/4/1757

保守的轉(zhuǎn)座作用不造成核苷酸的丟失，如λ噬菌體的整合和切除。第57頁/共71頁2023/4/1758

轉(zhuǎn)座子引起DNA的重排，正向重復序列的重組引起其間序列的切除或插入。第58頁/共71頁2023/4/1759

反向重復序列的重組能引起其間序列反向排列。第59頁/共71頁2023/4/1760

轉(zhuǎn)座作用可引起給體和受體的整合或分割，并可引起轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的增加第60頁/共71頁2023/4/1761(二)真核生物的轉(zhuǎn)座因子

原核生物的轉(zhuǎn)座酶主要作用于產(chǎn)生它的轉(zhuǎn)座因子，表現(xiàn)出順式顯性。真核生物的轉(zhuǎn)座酶可以作用于任何末端具有該酶所識別的反向重復順序的DNA,使其轉(zhuǎn)移到相應的靶位點。在玉米的激活-解離系統(tǒng)（activator-dissociationsystem,Ac-Ds)中，Ac編碼轉(zhuǎn)座酶(自主因子)，Ds（非自主因子）是Ac不同程度的缺失中間序列形成的，無轉(zhuǎn)座酶活性，但隨Ac轉(zhuǎn)座后可抑制鄰近基因的表達。在玉米的抑制-促進-增變系統(tǒng)（suppressor-promotor-mutator,Smp)中,Smp和En（增強子）序列相似，均為自主因子，與其對應的非自主因子dSmp為有缺陷的Smp因子，轉(zhuǎn)座后，若Smp插入靶基因附近的合適部位，可以促進靶位點基因的表達，若Smp插入外顯子，可抑制基因的表達。第61頁/共71頁2023/4/1762第62頁/共71頁2023/4/1763玉米的控制元件形成轉(zhuǎn)座子的不同家族，每個家族均有自主和非自主成員。第63頁/共71頁2023/4/1764

P品系的果蠅含有40-50個P因子（一種轉(zhuǎn)座子），P因子的mRNA前體含有3個內(nèi)含子，若P品系雄性與M品系雌性交配，子一代的體細胞mRNA前體加工時保留了第3個內(nèi)含子，合成阻遏蛋白，不發(fā)生轉(zhuǎn)座，性細胞mRNA前體加工時切除了全部3個內(nèi)含子，活躍的轉(zhuǎn)座使性細胞失去功能。P雄性或M雄性與P雌性交配時，由于雌性的卵細胞質(zhì)中存在抑制P因子轉(zhuǎn)座酶活性的蛋白質(zhì)，子代的生殖功能正常。第64頁/共71頁2023/4/1765四、真核生物基因表達的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控

1.染色體丟失:如四膜蟲的大核為營養(yǎng)核，由小核發(fā)育而來，約10%的DNA在發(fā)育過程中被丟失。

2.基因擴增：如非洲爪蟾卵母細胞的rDNA可以大量擴增，形成1000個以上的核仁。

3.基因重排:重排可以使表達的基因發(fā)生切換，也可以產(chǎn)生新的基因。

4.組蛋白的乙?；腿ヒ阴；航M蛋白的乙?；突虮磉_的狀態(tài)相關。組蛋白H4的乙酰化不足(underacetylation)是雌性哺乳動物一條X染色體失活的原因之一。去乙?；突蚧钚缘淖瓒粲嘘P。

5.染色體DNA的修飾和異染色質(zhì)化：DNA的甲基化可以使其失去轉(zhuǎn)錄活性，高度甲基化的DNA可以形成高度壓縮的異染色質(zhì)，異染色質(zhì)的基因無轉(zhuǎn)錄活性。第65頁/共71頁2023/4/17666.染色質(zhì)結構改變模型-組蛋白置換

占先模型(pre-emptivemodel)：決定的因素是轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白誰先占據(jù)調(diào)控位點。DNA復制時，組蛋白8聚體解離，轉(zhuǎn)錄因子乘機結合到調(diào)控位點上，一直持續(xù)到下一個復制周期，抑制了組蛋白和DNA的結合。

例1：當5SrRNA基因與組蛋白結合時TFⅢA不能激活此基因。而TFⅢA可與游離的5SrRNA基因結合，再加入組蛋白不能使此基因失活。例2：含腺病毒啟動子的質(zhì)粒能被TFⅡD結合，再被RNApolⅡ轉(zhuǎn)錄，如先加入組蛋白，則不起始轉(zhuǎn)錄，如先加入TFⅡD則形成的染色質(zhì)中，模板仍轉(zhuǎn)錄。

動態(tài)模型(dynamicmodel)

：組蛋白置換需輸入能量。一些轉(zhuǎn)錄因子結合DNA時可裂解核小體，或建立一個可產(chǎn)生核小體定位結合位點的邊界。如果蠅Hsp70啟動子上的核小體在體外實行重建。GAGA(細胞核結合蛋白)轉(zhuǎn)錄因子與啟動子中4個富含(CT)n位點結合，破壞了核小體，形成一高敏感區(qū)，而且導致鄰接的核小體重排，這樣它們就優(yōu)先插入到隨機位點。核小體打開的過程是需要水解ATP的耗能過程。第66頁/共71頁2023/4/17677.細胞周期的調(diào)控最關鍵的是兩個蛋白質(zhì)家族：周期素（cyclin)家族和依賴周期素的蛋白激酶（cyclin-dependingproteinkinase,CDK)家族,目前發(fā)現(xiàn)的周期素有10種以上，用字母A,B,C等表示，CDK有8種以上，用CDK1，CDK2，CDK3等表示。周期素AD,CDK2,CDK4的合成受轉(zhuǎn)錄因子E2F的調(diào)節(jié)，共同控制G1期向S期的轉(zhuǎn)化，周期素A、B與CDK2的結合對有絲分裂的啟動是必要的。新