質(zhì)粒抽提分析

質(zhì)粒抽提質(zhì)粒簡(jiǎn)介質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子

其大小范圍從lkb至200kb以上不等。

已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒.這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)ChromosomeDNAgenomePlasmidDNA

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)．質(zhì)粒特性

1.分子相對(duì)小2.含有高效的自主復(fù)制成分3.不相容性(incompatibility)4.轉(zhuǎn)移性5.選擇的標(biāo)記(selectivemarkers)6.限制性內(nèi)切酶單一切口質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

分子量相對(duì)較小共價(jià)閉合分子雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的抗切割和抗變性能力超螺旋DNA分子線性DNA分子半開環(huán)DNA分子Plasmidvectors

表達(dá)載體

載體含有tac啟動(dòng)子、Lac操縱基因、SD序列、LacI阻遏蛋白基因等

Exprssionvector

細(xì)菌收集純化質(zhì)粒DNA細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解質(zhì)粒DNA的提取和純化

質(zhì)粒DNA的提取和純化

一、細(xì)菌的培養(yǎng)(bacterialculture)l

先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。對(duì)于松弛型質(zhì)粒，由于它的復(fù)制在一定程度上不受到宿主細(xì)胞的控制，故在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白質(zhì)的合成和染色體DNA的復(fù)制。質(zhì)粒DNA的復(fù)制不受影響而大量擴(kuò)增l

所以使用氯霉素的主要目的，是在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少細(xì)菌的培養(yǎng)體積和細(xì)菌的數(shù)量．

有時(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌中的擴(kuò)增狀況很差，常是由于質(zhì)粒攜帶外源基因或質(zhì)粒分子量過大所致。二、細(xì)菌的收集(bacterialcollection)

細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈。三、細(xì)菌裂解細(xì)胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機(jī)溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。

質(zhì)粒提取的方法堿裂解法(Alkaline)煮沸裂解法SDS裂解法其他質(zhì)粒DNA提取方法的選擇

l

常用的煮沸法，堿法,SDS法均可獲得較滿意效果．至于有人采用堿法提取小量細(xì)菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒，用煮沸法或SDS法進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大量分離，只是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的習(xí)慣問題.l選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNA，應(yīng)考慮以下因素：1．菌株類型（type）2．質(zhì)粒的大小(size)3．細(xì)菌染色體DNA變性條件強(qiáng)弱的控制(denaturationcondition)質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml質(zhì)粒DNA的大量制備500ml大質(zhì)粒（>15kb）的處理方法：

采用溫和處理方法，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用SDS裂解，使plasmid損傷減少小質(zhì)粒（<15kb）的處理方法：

無需特殊處理，堿裂解方法等均可使用四、細(xì)菌的裂解和質(zhì)粒DNA的提取

(bacterialandplasmidextraction)在NaOH存在的強(qiáng)堿性（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA（一）堿裂解法(Alkaline)細(xì)胞被裂解后，細(xì)胞壁、膜的碎片、變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成大的復(fù)合物當(dāng)pH調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA重新恢復(fù)天然的超螺旋在高鹽條件下沉淀，經(jīng)離心分離，質(zhì)粒DNA保留在上清液中1在堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)(CC)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。

B

將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而CC質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。

C、通過離心，可去除大部分細(xì)胞碎片染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。堿裂解法示意圖1~4ml培養(yǎng)細(xì)菌收集細(xì)菌破裂溶解染色體基因組和蛋白質(zhì)變性、質(zhì)粒變性變性的細(xì)菌基因組形成網(wǎng)狀、蛋白質(zhì)變性、質(zhì)粒復(fù)性SolutionISolutionIISolutionIII分離、純化質(zhì)粒DNA堿裂解法提取質(zhì)粒的試劑及主要成分:

(mainregeantsandcomponents)SolutionI:Tris-HCl;EDTA;glucoseSolutionII:NaOH;SDSSolutionIII:CH3COOH堿裂解提取質(zhì)粒可能存在的問題少量純化質(zhì)粒是，多少菌液比較合適？2ml細(xì)菌可獲得10~15μg質(zhì)粒加入SolutionII后溶液應(yīng)該澄清，如出現(xiàn)渾濁可能存在的情況？菌體量過大菌液與SolutionI混合不充分在熱或堿的條件下時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致什么結(jié)果？質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)不可逆變性如：環(huán)狀DNA不能被限制酶酶切遷移速率在凝膠中是超螺旋近2倍

Br染色較弱等（二）煮沸裂解法（boiling）將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶能破壞細(xì)胞壁，再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈，當(dāng)溫度下降后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA,然后回收上清液中的質(zhì)粒DNA煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取小質(zhì)粒。對(duì)于會(huì)釋放出大量糖類的菌株不適宜。如HB101及衍生菌。（三）SDS裂解法將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，再用SDS裂解去壁細(xì)胞，從而溫和地釋放質(zhì)粒到等滲液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA。由于條件溫和，該法特別適用于大質(zhì)粒DNA（>15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。（四）其它方法2、牙簽少量制備法1、小量一步提取法1、小量一步提取法直接將酚/氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，然后離心去除大部分蛋白質(zhì)和染色體DNA，最后從上清液中回收質(zhì)粒DNA。本法簡(jiǎn)單快捷、成本低，提取的質(zhì)?？捎糜谙拗菩詢?nèi)切酶圖譜分析。（二）牙簽少量制備法用牙簽直接挑取生長(zhǎng)在瓊脂平板上的細(xì)菌菌落制備質(zhì)粒DNA。

由于制備的質(zhì)粒DNA有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定。質(zhì)粒DNA的純化１.CsCl-EB法２.聚乙二醇沉淀法３.柱層析法EB—CsCl密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA結(jié)合EB浮力密度降低較小，僅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達(dá)100%。

超速離心將介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過量EB存在下，蛋白質(zhì)的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結(jié)構(gòu)的DNA與EB結(jié)合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開。EB—CsCl密度梯度離心法示意圖l

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及DNA外切酶酶切缺失等實(shí)驗(yàn)，對(duì)閉合環(huán)狀雙鏈DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質(zhì)粒。

對(duì)于DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、亞克隆及探針放射性標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)，直接用小量或中量提取的DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實(shí)驗(yàn)要求。2聚乙二醇沉淀法分級(jí)沉淀，首先利用LiCl沉淀大分子RNA，用Rnase酶消化小分子RNA；在利用乙二醇選擇性沉淀大質(zhì)粒DNA，再利用酚-氯仿抽提。

方法簡(jiǎn)單實(shí)用，但是不能區(qū)分環(huán)狀或開鏈質(zhì)粒DNA3柱層析法以硅基質(zhì)作為填充層析柱的樹脂，在多鹽的條件下，DNA與硅基質(zhì)可逆性的結(jié)合進(jìn)行純化。多鹽造成磷酸二酯骨架脫水，通過暴露的磷酸鹽殘基與硅基質(zhì)結(jié)合，然后用50%的乙醇洗去RNA和糖類物質(zhì)，再加入TE或水，離心洗脫。實(shí)驗(yàn)步驟取菌液1ml置離心管中，10000~12000r/min,離心1min，去掉上清液。加入預(yù)冷的100ul溶液I，充分混勻，室溫放置2min。加入200ul溶液II,顛倒混勻5~10次，冰上放置2min。加入150ul溶液III，顛倒混勻5~10次，冰上放置10min。10000~12000r/min離心5min,取上清至新的離心管中。上清液中加入等體積苯酚/氯仿，振蕩混勻，10000~12000r/min離心2min，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中。加入5mol/LNaCl150ul，后加入2倍體積無水乙醇，混勻后10000~12000r/min5min。去除上清液，加入0.5ml70%乙醇，8000r/min離心5min，清洗沉淀，干燥。加入20ulTE，溶解沉淀，1：100稀釋后測(cè)定濃度。PCR-單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析

SingleStrandConformationPolymorphism,SSCPPCR-SSCP單鏈DNA分子具有特定的二級(jí)空間構(gòu)象，取決于該分子本身的堿基組成。突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時(shí)，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA

不同順序