熒光PCR原理及應(yīng)用

熒光PCR原理及應(yīng)用第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二

公司在首家通過國際ISO14001環(huán)境論證的深圳高新技術(shù)園區(qū)內(nèi)擁有近2000m2的GMP標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)廠房，其中包括嚴格按GMP要求建立的450m2的潔凈車間及其他輔助車間，是目前國內(nèi)第一家通過體外診斷試劑GMP認證的廠家。GMP標(biāo)準(zhǔn)廠房（GMP---藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范）第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二產(chǎn)品概述第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二乙肝病毒(HBV)核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑盒人類免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑盒丙肝病毒(HCV)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒結(jié)核桿菌(TB)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒沙眼衣原體和淋球菌(CT&NG)核酸擴增(PCR)熒光雙檢試劑盒已獲得新藥證書的產(chǎn)品第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二TORCH計劃中的產(chǎn)品人巨細胞病毒(HCMV)核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑盒人乳頭瘤病毒(HPV6/11;16/18)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒人單純皰疹病毒(HSV)核酸擴增(PCR)熒光檢試劑盒弓形蟲(TOX.)核酸擴增(PCR)熒光檢試劑盒風(fēng)疹(RUB.)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒其他產(chǎn)品解脲支原體(UU)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒乙肝病毒(HBV)YMDD突變核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒待申報產(chǎn)品第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二幽門螺旋桿菌(HP)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒肺炎支原體(MP)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒EB病毒(EBV)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒梅毒(TP)核酸擴增(PCR)熒光檢試劑盒-地中海貧血(MA)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒苯丙酮尿癥(PKU)核酸擴增(PCR)熒光檢試劑盒開發(fā)研制中的新產(chǎn)品第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二新藥試生產(chǎn)轉(zhuǎn)

正式生產(chǎn)

批件

乙型肝炎病毒（HBV）核酸擴增（PCR）熒光定量檢測試劑盒

國藥準(zhǔn)字S20020033第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二PCR基礎(chǔ)第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二PCR---DNA體外復(fù)制第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二PCR——信號放大第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二PCR的特點高靈敏度高特異性簡便快捷第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光PCR檢測原理第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光PCR？

熒光標(biāo)記引物、探針或PCR擴增產(chǎn)物動態(tài)監(jiān)測熒光信號變化第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光染料光能熱能轉(zhuǎn)移給臨近的分子第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光信號熒光染料直接結(jié)合擴增產(chǎn)物SYBRgreenI——特異性結(jié)合雙鏈，釋放熒光信號熒光標(biāo)記引物特異性熒光探針Taqman雙熒光標(biāo)記探針molecularBeacon熒光標(biāo)記探針熒光標(biāo)記雜交雙探針第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二FRET？

當(dāng)某個熒光基團的發(fā)射譜與另一熒光基團的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),實際相當(dāng)于將短波長熒光基團釋放的熒光屏蔽。第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二Taqman？特異性熒光雙標(biāo)記探針Taq酶5’→3’外切酶活性第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二Molecularbeacon？第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光標(biāo)記雜交雙探針變性退火延伸第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二CT值—樣本擴增曲線與閾值線交叉點的循環(huán)數(shù)第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二PCR熒光試劑標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線（儀器：Bio-radiCycler）1x108拷貝/ml1x107拷貝/ml1x106拷貝/ml1x105拷貝/ml1x104拷貝/ml第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二定量原理和方法原理：每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析。外標(biāo)法：將幾個已知拷貝數(shù)的純化的目的基因標(biāo)準(zhǔn)品進行FQ-PCR擴增，繪制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。內(nèi)標(biāo)法：將已知濃度的內(nèi)標(biāo)基因加到各標(biāo)本中，與標(biāo)本一起經(jīng)歷核酸提取、加樣、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增及信號檢測的全過程，比較內(nèi)標(biāo)最后的實測值與已知值，以檢驗標(biāo)本中是否存在抑制PCR的因素，也可對樣品的拷貝數(shù)加以校正。

第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光PCR定量的原理-外標(biāo)法第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二標(biāo)準(zhǔn)曲線→定量第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二對數(shù)期分析與終點分析的比較第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光PCR重現(xiàn)性第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光PCR特點靈敏度高特異性強全封閉PCR過程，無需后處理采用dUTP—UNG酶的防污染系統(tǒng)，有效降低污染機會即時反映擴增過程，摒棄終點數(shù)據(jù)，更適用于定量定量范圍寬，可達到10個數(shù)量級，無須稀釋樣品可實現(xiàn)一管多檢儀器自動分析，更快獲得結(jié)果第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二競爭性熒光內(nèi)標(biāo)(IC)定量PCR技術(shù)第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二競爭性熒光內(nèi)標(biāo)(IC)什么是IC?

Internalcontrol簡稱IC，通常是指與靶序列十分相似的一段DNA序列，兩者在相同的條件下可被同一對引物擴增，具有相同的擴增效率；區(qū)別在于兩者的探針結(jié)合區(qū)，可分別被不同序列的探針識別，通過探針的不同熒光標(biāo)記實現(xiàn)區(qū)分。IC的作用

監(jiān)控PCR反應(yīng)，避免樣本抑制物、DNA（RNA）提取過程的丟失、誤操作等造成的假陰性結(jié)果；并對以上原因造成的定量誤差進行修正。第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二內(nèi)標(biāo)工作原理圖第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光PCR

在臨床診斷上的應(yīng)用第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二熒光定量PCR的臨床應(yīng)用早期診斷病情評估和預(yù)后判斷抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)新藥驗證輸血源的篩選母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二疾病的早期診斷免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在較長的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均長達70天，不利于對疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二HBVDNA與血清免疫學(xué)的關(guān)系HBVDNA與HBsAg/HBsAb的關(guān)系

HBsAg（+）HBVDNA（-）：病毒基因的整合，此時只能表達HBsAg，而沒有DNA的復(fù)制；操作失誤；PCR試劑的靈敏度不夠。

HBsAg（-）HBVDNA（+）：“窗口期”；HBsAg的水平過低無法檢出，或者HBsAg確已消失但病毒仍處于低水平復(fù)制狀態(tài)；暴發(fā)性乙肝以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg；S區(qū)基因發(fā)生逃避免疫變異造成HBsAg陰性而HBVDNA陽性；血清亞型的漏檢；老年人HBsAg檢出率低于5%，

HBsAb（+）通常表示病毒已清除。但已有報道HBsAb出現(xiàn)后血清內(nèi)仍有DNA復(fù)制，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb與HBVDNA同時陽性，但通常HBVDNA檢出率逐步下降HBVDNA與HBeAg/HBeAb的關(guān)系

HBeAg陽性與HBVDNA有顯著相關(guān)。HBeAg陰轉(zhuǎn)往往是HBV病毒血癥的消失或炎癥的靜息。通常認為HBeAg轉(zhuǎn)陰繼而出現(xiàn)HBe抗體的轉(zhuǎn)化為乙型慢性肝炎好轉(zhuǎn)穩(wěn)定的標(biāo)志。事實上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg陰轉(zhuǎn)并不意味著炎癥活動的停止。HBeAg陰性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg的表達為主，感染起始即為HBeAg陰性。第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二病毒感染窗口期的NAT檢測第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二Lametal-Hepatol26:226,1997對病毒感染的藥物治療中，免疫學(xué)指標(biāo)的變化通常比較滯后出現(xiàn)，且受個體差異影響較大，從而對臨床判斷難以及時提供直接證據(jù)；而熒光定量PCR檢測可直接反映病原體滴度是否受藥物治療發(fā)生變化，從而為藥物療效觀察提供直接依據(jù)，以供治療方案參考。同時對不同治療時間的用藥劑量和用藥時間提供依據(jù)?？共《舅幬锆熜У挠^察、指導(dǎo)第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二如HBV：根據(jù)《2000年拉米夫定臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見》，中國慢性乙肝病人治療的主要目的就是降低血清HBVDNA，誘導(dǎo)HBeAg血清轉(zhuǎn)換等。HIV:

目前用于治療艾滋病的藥物中主要就是抗病毒類藥物，因此，HIVRNA滴度的定量測定與抗HIV藥物治療及療效有著直接的關(guān)系。第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二乙型肝炎患者抗病毒藥物治療前后的HBV滴度比較第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二新藥驗證

任何一種抗病毒藥物，以免疫標(biāo)志物來評價其療效均不夠敏感和及時，若以病毒復(fù)制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和動態(tài)變化來評價療效，則較為直接和理想。第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二拉米夫定抑制血清HBVDNA0-20-40-60-80-100治療周數(shù)拉米夫定安慰劑血清HBVDNA;中位%變化0481216202428323640444852n=192n=404n=171n=359III期臨床研究的綜合數(shù)據(jù)第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二病情評估和預(yù)后判斷

通過定量檢測病毒滴度可以間接評估受侵器官或組織的炎癥發(fā)生程度以及是否發(fā)生病變；長時間機體病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往預(yù)后不好。因此對病原體的定量PCR檢測對病情和預(yù)后評估均有參考意義。第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二遺傳疾病的早期診斷熒光PCR可實現(xiàn)對點突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測。對產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二母嬰傳播的監(jiān)控

熒光PCR可對病原體的母嬰傳播進行有效的監(jiān)控，為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺乳期感染等提供依據(jù)，為母嬰傳播的阻斷等提供參考。第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二腫瘤的診斷熒光PCR的作用：可對原癌基因的突變和易位等作出檢測。可對原癌基因的mRNA進行定量分析。有利于腫瘤的早期診斷，甚至癌前診斷。探索癌變發(fā)生機理的研究提供參考。區(qū)別腫瘤的良性和惡性以及炎癥反應(yīng)。第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二結(jié)核病及性病等核酸檢測意義病原體的檢測在臨床上通常采用鏡檢、培養(yǎng)等方法。鏡檢法操作簡便，易造成假陽性結(jié)果，同時靈敏度較低。培養(yǎng)方法要求高，耗時，不利于臨床上的及時診斷和用藥。熒光PCR方法具高靈敏度，速度快。不能培養(yǎng)PCR是唯一確診手段（例如HPV）第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二PCR污染及預(yù)防對策

第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二污染原因

標(biāo)本間交叉污染PCR試劑的污染PCR擴增產(chǎn)物污染氣溶膠污染實驗室中克隆質(zhì)粒的污染第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二污染的監(jiān)測

對照試驗

試劑空白對照

陽性對照

陰性對照

重復(fù)性試驗

第48頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二PCR防污染措施實驗環(huán)境的控制

PCR應(yīng)實行嚴格的分區(qū)操作：前準(zhǔn)備區(qū)；樣本處理區(qū)，其中DNA和RNA的處理也應(yīng)該分開；擴增區(qū)。各區(qū)專區(qū)使用，并盡量使用一次性消耗品，高壓消毒，實驗器械和臺面均應(yīng)進行定期消毒等。2．避免PCR后處理

熒光PCR不同于其他的PCR方法，無須對PCR擴增產(chǎn)物進行任何的檢測，實際就是對PCR污染的有力預(yù)防。3．dUTP防污染系統(tǒng)

反應(yīng)體系中常規(guī)的dNTPS中的dTTP替換為dUTP，在擴增過程中dU取代dT的位置摻入到PCR產(chǎn)物中，在尿嘧啶糖基酶（UNG）的作用下，發(fā)生U的糖苷鍵的水解，經(jīng)高溫處理后DNA鏈斷裂成碎片，從而無法成為下一輪的PCR的模板