基因組序列詮釋

基因組序列詮釋第一頁(yè)，共60頁(yè)。問(wèn)題基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個(gè)整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因、研究基因的功能？2第二頁(yè)，共60頁(yè)?；蚪M序列的詮釋研究基因組的最終目的--詮釋基因組所包含的信息和基因組功能。1.在基因組中搜尋基因根據(jù)序列分析搜尋基因?qū)嶒?yàn)分析確認(rèn)基因2.基因功能測(cè)定3第三頁(yè)，共60頁(yè)。

5.1在基因組中搜尋基因

ORF（openingreadingframes）掃描：人工或計(jì)算機(jī)序列篩選ORF：每個(gè)編碼蛋白的基因都含有ORF，由一系列密碼子組成，通常以ATG開(kāi)始，TAA、TGA、TAG結(jié)束。通過(guò)尋找起始密碼子和終止密碼子確定ORF序列，是尋找基因的一種重要的方法成功關(guān)鍵：終止子在DNA序列中出現(xiàn)的頻率。4第四頁(yè)，共60頁(yè)。5.1在基因組中搜尋基因高等真核生物DNA的ORF的閱讀障礙：基因間存在大量非編碼序列（人類基因組占70%）很多基因含有內(nèi)含子由于多數(shù)外顯子長(zhǎng)度<100個(gè)密碼子，當(dāng)讀碼進(jìn)入到內(nèi)含子時(shí)很快就遇到終止密碼，從而難以判斷讀碼的準(zhǔn)確性5第五頁(yè)，共60頁(yè)。A起始密碼子ATGB信號(hào)肽分析C終止密碼子D3’端的確認(rèn)E非編碼序列、內(nèi)含子F密碼子偏愛(ài)性G外顯子－內(nèi)含子邊界H上游調(diào)控序列I軟件預(yù)測(cè)

5.1在基因組中搜尋基因

根據(jù)序列分析搜尋基因6第六頁(yè)，共60頁(yè)。A起始密碼子ATG第一個(gè)ATG的確定(依據(jù)Kozak規(guī)則)Kozak規(guī)則--基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果第一個(gè)ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律根據(jù)開(kāi)放讀碼框(ORF)預(yù)測(cè)基因7第七頁(yè)，共60頁(yè)。Kozak規(guī)則:若將第一個(gè)ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1,2,3位，側(cè)翼堿基序列具有以下特征：第4位的偏好堿基為GATG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基8第八頁(yè)，共60頁(yè)。B信號(hào)肽分析信號(hào)肽分析軟件(SignalP)把預(yù)測(cè)過(guò)程中證實(shí)含完整mRNA5’端的序列翻譯為蛋白序列然后用SignalP軟件對(duì)前50個(gè)氨基酸序列(從第一個(gè)ATG對(duì)應(yīng)的甲硫氨酸Met開(kāi)始)進(jìn)行評(píng)估，如果SignalP分析給出正面結(jié)果，則測(cè)試序列有可能為信號(hào)肽

9第九頁(yè)，共60頁(yè)。C終止密碼子終止密碼子:TAA,TAG,TGAGC%=50%終止密碼子每64bp出現(xiàn)一次

GC%>50%終止密碼子每100－200bp出現(xiàn)一次由于多數(shù)基因ORF均多于50個(gè)密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是ORF不少于100個(gè)密碼子10第十頁(yè)，共60頁(yè)。D3’端的確認(rèn)Poly(A)尾序列若測(cè)試DNA片段不含Poly(A)序列，則根據(jù)加尾信號(hào)序列“AATAAA”，與BLAST同源性比較結(jié)果共同判斷11第十一頁(yè)，共60頁(yè)。E非編碼序列、內(nèi)含子

高等真核生物多數(shù)外顯子長(zhǎng)度少于100個(gè)密碼子，有的不到50個(gè)密碼子甚至更少12第十二頁(yè)，共60頁(yè)。F密碼子偏愛(ài)性同義密碼：編碼同一氨基酸的不同密碼子，差別在于密碼子的第3位堿基不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如人類基因中，丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA、GCC、GCT,GCG很少使用種屬特征性密碼子序列在編碼區(qū)出現(xiàn)，非編碼區(qū)只保持平均的堿基分布水平13第十三頁(yè)，共60頁(yè)。G外顯子－內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有明顯的特征內(nèi)含子的5‘端或稱供體位（donorsite）常見(jiàn)的順序?yàn)?’-AG↓GTTAAGT-3’3’端又稱受體位（acceptorsite)，多為5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(Py：嘧啶核苷酸，T或C)14第十四頁(yè)，共60頁(yè)。H上游調(diào)控序列幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達(dá)原核生物調(diào)控序列有明顯特點(diǎn)，參考真核生物基因上游控制序列差異較大通過(guò)同源性比較來(lái)預(yù)測(cè)mRNA的5’端真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)(TheTRADATProject,EukaryoticPromoterDatabase,EPD.)特定生物基因組的特有組成--

CpG島，脊椎動(dòng)物基因組許多基因的上游promotor都有，長(zhǎng)度1kb，GC比例高

15第十五頁(yè)，共60頁(yè)。I軟件預(yù)測(cè)采用NCBI的ORF預(yù)測(cè)軟件(ORFfinder:)判斷ORF的可能范圍16第十六頁(yè)，共60頁(yè)。

5.1在基因組中搜尋基因

適用于高等真核生物基因組的ORF掃描方法：上游調(diào)控序列（upstreamcontrolsequence）：上游調(diào)控序列和外顯子-內(nèi)含子邊界一樣具有顯著特征，這些特征是參與基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白的識(shí)別信號(hào)。但真核的變化也較大同源查詢（homologysearch）：利用已存入數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有基因序列與待查基因組序列進(jìn)行比較，從中查找可與之匹配的堿基順序及其比例用于界定基因的方法孤獨(dú)基因（orphangene）：在基因分類時(shí)缺少同源順序的ORF17第十七頁(yè)，共60頁(yè)。5.1在基因組中搜尋基因?qū)嶒?yàn)分析確認(rèn)基因分子雜交NorthernblottingZooblottingDNA序列中基因位置的確定cDNA文庫(kù)構(gòu)建RACE技術(shù)基因定位第十八頁(yè)，共60頁(yè)。

5.1在基因組中搜尋基因

分子雜交可確定DNA片段是否含有表達(dá)序列Northernblotting：指將待測(cè)DNA樣品標(biāo)記后與RNA雜交，以判斷RNA中是否含有DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Zooblotting：親緣關(guān)系相近的物種，其基因編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低。以某一物種的DNA序列與來(lái)自另一親緣種的DNA片段雜交，如產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，則該區(qū)段可能含有1或多個(gè)基因19第十九頁(yè)，共60頁(yè)。問(wèn)題解決方案多個(gè)雜交帶：某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行可變剪接或該基因?yàn)槟骋欢嗷蚣易宓某蓡T時(shí)，會(huì)出現(xiàn)設(shè)計(jì)其他實(shí)驗(yàn)區(qū)分基因的表達(dá)具有組織特異性及發(fā)育階段的差別，而選擇的RNA樣品中不一定含有該基因產(chǎn)物擴(kuò)大樣本量，收集各種不同發(fā)育時(shí)期及不同組織器官的RNA某些基因產(chǎn)物豐度極低或不易提取提高RNA上樣量，或以已知的DNA序列設(shè)計(jì)引物從mRNA中擴(kuò)增基因產(chǎn)物20第二十頁(yè)，共60頁(yè)。

5.1在基因組中搜尋基因

DNA序列中基因位置的確定分子雜交可以判斷DNA片段中是否含有基因，但不能給出基因定位信息cDNA測(cè)序：獲得基因定位信息的最容易的方法cDNA測(cè)序受兩個(gè)方面的影響：目標(biāo)cDNA在cDNA文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率cDNA的完整性21第二十一頁(yè)，共60頁(yè)。

5.1在基因組中搜尋基因

如何獲取基因全長(zhǎng)cDNA序列？確定其在基因組中的位置？AcDNA文庫(kù)構(gòu)建BRACE技術(shù)C通過(guò)對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列的測(cè)序、對(duì)比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；通過(guò)物種已建立遺傳圖和物理圖來(lái)確定基因的位置；22第二十二頁(yè)，共60頁(yè)。cDNA文庫(kù)中目標(biāo)cDNA的低頻率cDNA文庫(kù)分為亞群、亞群雜交初篩、選擇雜交信號(hào)強(qiáng)的亞群進(jìn)一步篩選cDNA均一化：抑制高拷貝cDNA，增加低拷貝cDNA數(shù)量。DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)合適條件下，多數(shù)高拷貝cDNA呈雙鏈，中低拷貝cDNA呈單鏈羥基磷灰石柱吸附雙鏈cDNA收集單鏈cDNA23第二十三頁(yè)，共60頁(yè)。5’RACE(CLONTECH)24第二十四頁(yè)，共60頁(yè)。3’RACE(CLONTECH)25第二十五頁(yè)，共60頁(yè)。一.利用計(jì)算機(jī)分析基因功能二.實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能5.2基因功能的測(cè)定26第二十六頁(yè)，共60頁(yè)。一.利用計(jì)算機(jī)分析基因功能

同源性確定基因功能

同源基因都擁有一個(gè)共同的祖先基因，有許多相似序列。同源基因可以分為2類：

種間同源基因或直系基因（orthologousgene）：不同物種之間的同源基因，來(lái)自物種分化以前的共同祖先

種內(nèi)同源基因或平行基因（paralogousgene）同一物種內(nèi)的同源基因，常常是多基因家族的不同成員。其共同祖先可能存在于物種形成以后，也可能存在于物種形成之前27第二十七頁(yè)，共60頁(yè)。同源基因通常不會(huì)有完全一致的核苷酸序列，因?yàn)椴煌幕蚧虿煌纳锒紩?huì)獨(dú)立地發(fā)生隨機(jī)突變，但它們有相似的序列，大部分未突變的核苷酸位置是相同的氨基酸序列與核苷酸序列28第二十八頁(yè)，共60頁(yè)。推測(cè)新基因的功能

確認(rèn)新基因序列后，根據(jù)進(jìn)化的相關(guān)性，

根據(jù)已知的同源基因推測(cè)新基因的功能

局部相似基因序列：無(wú)明顯親緣關(guān)系的基因之間會(huì)出現(xiàn)局部相似區(qū)段。相似的功能，相似的序列是核心功能區(qū)域。功能域有共同的起源。29第二十九頁(yè)，共60頁(yè)。30第三十頁(yè)，共60頁(yè)。同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用酵母基因組大約含有6000個(gè)基因，30％--通過(guò)傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析得到70％--通過(guò)同源性分析獲得back31第三十一頁(yè)，共60頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能基因失活

基因超表達(dá)噬菌體展示（phagedisplay）酵母雙雜交（yeasttwo-hybridization）5.2基因功能的測(cè)定32第三十二頁(yè)，共60頁(yè)?；虻墓δ軐?shí)現(xiàn)--一個(gè)過(guò)程，從基因到表型的一系列生理生化反應(yīng)過(guò)程正向遺傳學(xué)：傳統(tǒng)的遺傳分析，從表型出發(fā)最終到達(dá)基因反向遺傳學(xué)：現(xiàn)代基因功能研究方法，與傳統(tǒng)遺傳分析相反，從基因出發(fā)，最終到達(dá)表型基因組計(jì)劃中基因功能研究：基因到表型。通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)方法鑒別與目標(biāo)基因相關(guān)的表型基因失活是基因功能分析的主要手段1.基因失活33第三十三頁(yè)，共60頁(yè)。基因失活基因剔除（knock-out）反義RNA技術(shù)RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)座子插入突變34第三十四頁(yè)，共60頁(yè)。5.2基因功能的測(cè)定基因剔除（knock-out）

最簡(jiǎn)單的基因失活方法，用一段無(wú)關(guān)的DNA片段取代目標(biāo)基因。主要原理：用一段無(wú)關(guān)的核苷酸序列取代目標(biāo)基因的中間序列，導(dǎo)入生物體內(nèi)或目的細(xì)胞內(nèi)，如果該基因所控制的表型發(fā)生變化，即從反面驗(yàn)證了目標(biāo)基因的功能。35第三十五頁(yè)，共60頁(yè)。基因剔除(knock-out)基因敲除最簡(jiǎn)便的基因失活的方法.1987年建立，2007年獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)主要原理:

在一段無(wú)關(guān)DNA片段的兩側(cè)連接與代換基因兩側(cè)相同的序列,導(dǎo)入目的細(xì)胞,由于同源片段之間的重組,可使無(wú)關(guān)片段取代靶基因,整合到染色體中.

為了便于篩選,用于取代的外源DNA中含有報(bào)告基因

36第三十六頁(yè)，共60頁(yè)?；蚯贸静襟EES細(xì)胞的獲得基因載體的構(gòu)建目的基因?qū)牒Y選靶細(xì)胞觀察生物學(xué)性狀的改變第三十七頁(yè)，共60頁(yè)。tk胸苷激酶標(biāo)記基因←gangcyclovirneor新霉素抗性基因→G41838第三十八頁(yè)，共60頁(yè)。39第三十九頁(yè)，共60頁(yè)?；蚯贸夹g(shù)的應(yīng)用及前景：①建立生物模型?；蚬δ堋⒋x途徑等研究中模型生物的建立非常重要?；蚯贸夹g(shù)建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進(jìn)行相關(guān)的研究。這些模型可以是細(xì)胞，也可以是完整的動(dòng)植物或微生物個(gè)體。最常見(jiàn)的是小鼠，家兔、豬、線蟲(chóng)、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見(jiàn)于報(bào)道。②疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療。通過(guò)基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對(duì)機(jī)體的影響。對(duì)于了解疾病的根源、尋找基因治療的靶目標(biāo)都有重大意義。

第四十頁(yè)，共60頁(yè)。③.提供廉價(jià)的異種移植器官器官來(lái)源稀少是人體器官移植的最大制約因素，而大量廉價(jià)的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。異源生物的基因會(huì)產(chǎn)生能引起人體強(qiáng)烈免疫排斥的異源分子福音：將產(chǎn)生這些異源分子的基因敲除，那么動(dòng)物的器官將能用于人體的疾病治療PPLTherapeutics公司于1999年已成功地在豬的體細(xì)胞中用基因敲除技術(shù)敲除了α－1，3GT基因。使每只豬都缺乏產(chǎn)生a１－３半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的２個(gè)拷貝。這些酶在細(xì)胞表面產(chǎn)生一種糖分子，人體的免疫系統(tǒng)可以立即辨認(rèn)出這種糖分子為異源性，從而引發(fā)超急性免疫排斥反應(yīng)。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應(yīng)即不會(huì)再發(fā)生

第四十一頁(yè)，共60頁(yè)。④.免疫學(xué)中的應(yīng)用異源抗體用于人體時(shí)會(huì)有一定的免疫排斥，使得人用抗體類藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用受阻。將動(dòng)物免疫分子基因敲除，換以人的相應(yīng)基因，那么將產(chǎn)生人的抗體，從而解決人源抗體的生產(chǎn)問(wèn)題。

⑤改造生物、培育新的生物品種基因敲除技術(shù)是遺傳工程中的另一重大飛躍，為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術(shù)支持

第四十二頁(yè)，共60頁(yè)。基因敲除技術(shù)的缺陷

敲掉一個(gè)基因并不一定就能獲知該基因的功能許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個(gè)在功能上冗余的基因，并不能造成容易識(shí)別的表型，因?yàn)榛蚣易宓钠渌蓡T可以提供同樣的功能；對(duì)于某些必需基因，敲除后會(huì)造成細(xì)胞的致死性，也就無(wú)法對(duì)這些必需基因進(jìn)行相應(yīng)的研究。第四十三頁(yè)，共60頁(yè)。反義RNA技術(shù)

反義RNA由基因的負(fù)鏈（模板鏈的互補(bǔ)鏈）編碼，與正義RNA(senseRNA)或DNA編碼序列結(jié)合,干擾mRNA的轉(zhuǎn)錄、加工和轉(zhuǎn)運(yùn),干擾基因的表達(dá)

將全目的基因或部分目的基因反向插入表達(dá)載體→轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物→獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體或品系→分析轉(zhuǎn)基因個(gè)體在生理、生化、形態(tài)等方面的變異→判別目的基因的功能44第四十四頁(yè)，共60頁(yè)。正義表達(dá)載體反義表達(dá)載體45第四十五頁(yè)，共60頁(yè)。反義RNA作用機(jī)理：

A干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始序列及編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細(xì)胞降解。

B與mRNA的引導(dǎo)序列結(jié)合，阻止核糖體附著，使翻譯無(wú)法啟動(dòng)。

C反義RNA與mRNA形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板,轉(zhuǎn)錄終止。46第四十六頁(yè)，共60頁(yè)。RNAi干擾

轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制通過(guò)雙鏈RNA的介導(dǎo),特異性地降解相應(yīng)序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá).47第四十七頁(yè)，共60頁(yè)。RNAi作用機(jī)理AdsRNA核酸內(nèi)切酶Dicer被激活,將dsRNA加工成21-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA鏈;B這些小片段RNA(siRNA)作為另一個(gè)核糖核酸復(fù)合體RISC(RNA-inducesilencingcomplex,RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的指引物,結(jié)合到RISC上,使之識(shí)別并降解mRNA,從而導(dǎo)致與雙鏈RNA同源的基因沉默;48第四十八頁(yè)，共60頁(yè)。49第四十九頁(yè)，共60頁(yè)。RNAi設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用A

Fraser

合成與開(kāi)放讀碼框相對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA或利用細(xì)菌克隆表達(dá)雙鏈RNA→微量注射/喂食→干擾同源基因的表達(dá)BChuang等設(shè)計(jì)出嵌合體結(jié)構(gòu)→連接強(qiáng)啟動(dòng)子大量表達(dá)雙鏈mRNA→干擾同源基因的表達(dá)50第五十頁(yè)，共60頁(yè)。HbF基因的RNAi載體構(gòu)建51第五十一頁(yè)，共60頁(yè)。RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)最根本的特點(diǎn)--特異性RNAi具有特殊的穿越能力,如將雙鏈RNA注射在線蟲(chóng)性腺里,會(huì)干擾到體細(xì)胞里的基因表達(dá),而且干擾作用會(huì)傳給后代;對(duì)一些低水平表達(dá)的基因，RNAi現(xiàn)象并不明顯RNAi能同時(shí)作用于幾個(gè)有相同或相似序列的基因52第五十二頁(yè)，共60頁(yè)。轉(zhuǎn)座子插入突變

將轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入功能基因內(nèi)，使其失活，亦可用于基因功能研究。back53第五十三頁(yè)，共60頁(yè)。2.基因的超表達(dá)用于功能檢測(cè)

在正常情況下，基因產(chǎn)物的數(shù)量是有限制的，必須與其它基因的產(chǎn)物平衡，某一基因產(chǎn)物的過(guò)量和不足都會(huì)破壞這種平衡，造成生長(zhǎng)和發(fā)育的異常

基因過(guò)量表達(dá)策略：