生物化學(xué)002氨基酸與蛋白質(zhì)

生物化學(xué)002氨基酸與蛋白質(zhì)第1頁/共169頁2023/4/182蛋白質(zhì)是由20種L-型α氨基酸組成的長(zhǎng)鏈分子。第一節(jié)

蛋白質(zhì)概論一、

蛋白質(zhì)的化學(xué)組成與分類1、元素組成碳50%

氫7%

氧23%

氮16%

硫0-3%

微量的磷、鐵、銅、碘、鋅、鉬凱氏定氮：粗蛋白質(zhì)含量=蛋白氮×6.252、氨基酸組成第2頁/共169頁2023/4/183酶、運(yùn)輸?shù)鞍?、營養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、防御蛋白。3、分類（1）

按組成簡(jiǎn)單蛋白結(jié)合蛋白（2）按分子外形的對(duì)稱程度球狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)膜蛋白質(zhì)（3）按功能第3頁/共169頁2023/4/184蛋白質(zhì)分子量=氨基酸數(shù)目*110二、蛋白質(zhì)的大小與形狀

少于50個(gè)氨基酸的低分子量氨基酸多聚物稱為肽，寡肽或生物活性肽、多肽。多于50個(gè)氨基酸的稱為蛋白質(zhì)。110=氨基酸殘基的平均分子量（P160）第4頁/共169頁2023/4/185四級(jí)結(jié)構(gòu)：亞基之間的聚集形式三、蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象與結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)都有自己特有的天然空間結(jié)構(gòu)，稱為構(gòu)象。一級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸順序二級(jí)結(jié)構(gòu)：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角，無規(guī)卷曲三級(jí)結(jié)構(gòu)：整個(gè)肽鏈（亞基）的形狀第5頁/共169頁2023/4/1861．酶2．結(jié)構(gòu)成分（結(jié)締組織的膠原蛋白、血管和皮膚的彈性蛋白、膜蛋白）3．貯藏（卵清蛋白、種子蛋白）4．物質(zhì)運(yùn)輸（血紅蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖運(yùn)輸載體、脂蛋白、電子傳遞體）5．細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（肌肉收縮的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白）6．激素功能（胰島素）7．自我保護(hù)（抗體、皮膚的角蛋白、血凝蛋白8．接受、傳遞信息（受體蛋白，味覺蛋白）9．調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、和遺傳信息的表達(dá)（組蛋白、阻遏蛋白）四、

蛋白質(zhì)功能的多樣性第6頁/共169頁2023/4/187第二節(jié)

氨基酸

四大類生物分子中，蛋白質(zhì)是生物功能的主要載體，而氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。

自然界中存在的成千上萬種蛋白質(zhì)，在結(jié)構(gòu)和功能上的驚人的多樣性歸根結(jié)底是由20中常見的氨基酸的內(nèi)在性質(zhì)造成的。這些性質(zhì)包括：聚合能力酸堿性側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的多樣性化學(xué)功能的多樣性第7頁/共169頁2023/4/188一、蛋白質(zhì)的水解酸水解：色氨酸破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基堿水解：消旋，色氨酸穩(wěn)定酶水解：水解位點(diǎn)特異，用于一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，肽譜第8頁/共169頁2023/4/189非蛋白質(zhì)氨基酸：存在于生物體內(nèi)但不組成蛋白質(zhì)(約150種)二、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類基本氨基酸（編碼的蛋白質(zhì)氨基酸）：組成蛋白質(zhì)，20種稀有氨基酸：是多肽合成后由基本氨基酸經(jīng)酶促修飾而來重點(diǎn)第9頁/共169頁2023/4/1810α-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)α-氨基酸

與羧基相鄰的α-碳原子（Cα）上有一個(gè)氨基的氨基酸。COO--Cα-RH3N可變的側(cè)鏈H第10頁/共169頁2023/4/1811（1）R為脂肪烴基的氨基酸（5種）（一）基本氨基酸（編碼的蛋白質(zhì)氨基酸，20種）1、按照R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類第11頁/共169頁2023/4/1812Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性從Gly至Ile，R基團(tuán)疏水性增加

特點(diǎn)R基均為中性烷基，R基對(duì)分子酸堿性影響很小，它們幾乎有相同的等電點(diǎn)。（6.0±0.03）第12頁/共169頁2023/4/1813（2）R中含有羥基和硫的氨基酸（共4種）第13頁/共169頁2023/4/1814★Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理?xiàng)l件下不解離，但在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有Ser殘基存在?！颯er和Thr的-OH往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。

★Cys的R中含巰基（-SH），具有兩個(gè)重要性質(zhì)：（1）在較高pH值條件，巰基離解。（2）兩個(gè)Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸?！颩et在生物合成中是一種重要的甲基供體。特點(diǎn)第14頁/共169頁2023/4/1815（3）R中含有酰胺基團(tuán)（2種）酰胺基中氨基易發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)

第15頁/共169頁2023/4/1816（4）R中含有酸性基團(tuán)（2種）Asp、GluAsp側(cè)鏈羧基pKa為3.86，Glu側(cè)鏈羧基pKa為4.25它們是唯一在生理?xiàng)l件下帶有負(fù)電荷的的兩個(gè)

氨基酸第16頁/共169頁2023/4/1817（5）R中含堿性基團(tuán)（3種）第17頁/共169頁2023/4/1818★L(fēng)ys側(cè)鏈氨基的pKa為10.53，生理?xiàng)l件下，Lys側(cè)鏈帶有一個(gè)正電荷（—NH3+），側(cè)鏈的氨基反應(yīng)活性增大。

★

Arg是堿性最強(qiáng)的氨基酸，側(cè)鏈上的胍基是已知堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿，pKa值為12.48，生理?xiàng)l件下完全質(zhì)子化。

★

His是pKa值最接近生理pH值的一種（游離氨基酸中為6.00，在多肽鏈中為7.35），是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸?！?/p>

His在酶的酸堿催化機(jī)制中起重要作用特點(diǎn)第18頁/共169頁2023/4/1819在280nm處，Trp吸收最強(qiáng)，Tyr次之，Phe最弱。（6）芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）CH2H3N+-C-HCOO-CH2H3N+-C-HCOO-OHNHCHCCH2H3N+-C-HCOO-苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trp,W）第19頁/共169頁2023/4/1820（7）、雜環(huán)族氨基酸（2種）Pro的α-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結(jié)構(gòu)。一般出現(xiàn)在兩段α-螺旋之間的轉(zhuǎn)角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化，第20頁/共169頁2023/4/1821嬰兒期：Arg（精氨酸）和His（組氨酸）供給不足，屬半必需氨基酸。u必需氨基酸u成年人：Thr蘇氨酸Val纈氨酸

Leu亮氨酸Ile異亮氨酸

Phe苯丙氨酸Trp色氨酸

Lys賴氨酸Met甲硫氨酸攜（纈氨酸）一（異亮氨酸）兩（亮氨酸）本（苯丙氨酸）單（蛋氨酸，即甲硫氨酸）色（色氨酸）書（蘇氨酸）來（賴氨酸）。

攜（寫）一兩本單色書來；一兩色素本來淡些；假設(shè)來寫一兩本書第21頁/共169頁（一）

賴氨酸（Lysine

）：促進(jìn)大腦發(fā)育，是肝及膽的組成成分，能促進(jìn)脂肪代謝，調(diào)節(jié)松果腺、乳腺、黃體及卵巢，防止細(xì)胞退化；

（二）

色氨酸（Tryptophane）：促進(jìn)胃液及胰液的產(chǎn)生；

（三）

苯丙氨酸（Phenylalanine）：參與消除腎及膀胱功能的損耗；

（四）

蛋氨酸（又叫甲硫氨酸）（Methionine）；參與組成血紅蛋白、組織與血清，有促進(jìn)脾臟、胰臟及淋巴的功能；

（五）

蘇氨酸（Threonine）：有轉(zhuǎn)變某些氨基酸達(dá)到平衡的功能；

（六）

異亮氨酸（Isoleucine

）：參與胸腺、脾臟及腦下腺的調(diào)節(jié)以及代謝；腦下腺屬總司令部作用于甲狀腺、性腺；

（七）

亮氨酸（Leucine

）：作用平衡異亮氨酸；

（八）

纈氨酸（Viline）：作用于黃體、乳腺及卵巢。

（九）

組氨酸（Hlstidine）：作用于代謝的調(diào)節(jié)；

2023/4/1822第22頁/共169頁2023/4/1823

在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要（蛋白質(zhì)的疏水核心）。（1）非極性氨基酸9種這類氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水（2）不帶電何的極性氨基酸6種（3）帶負(fù)電荷的氨基酸(酸性氨基酸)2種（4）帶正電荷的氨基酸(堿性氨基酸)3種第23頁/共169頁2023/4/1824非極性氨基酸

在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要作用（蛋白質(zhì)的疏水核心）。第24頁/共169頁2023/4/1825第25頁/共169頁2023/4/1826不帶電荷的極性氨基酸這類氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水。第26頁/共169頁2023/4/1827帶負(fù)電荷的氨基酸(酸性氨基酸)第27頁/共169頁2023/4/1828帶正電荷的氨基酸(堿性氨基酸)第28頁/共169頁2023/4/1829

膠原蛋白中的Lys側(cè)鏈氧化時(shí)能形成很強(qiáng)的分子間(內(nèi))交聯(lián)。Arg的側(cè)鏈堿性很強(qiáng)，與NaOH相當(dāng)。His是一個(gè)弱堿，是天然的緩沖劑，往往存在于許多酶的活性中心。

非極性氨基酸一般形成蛋白質(zhì)的疏水核心，帶電荷的氨基酸和極性氨基酸位于表面。酶的活性中心：His、Ser、Cys第29頁/共169頁2023/4/1830（二）

非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸也稱修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成后，由基本氨基酸修飾而來。（1）4-羥脯氨酸

（2）5-羥賴氨酸

這兩種氨基酸主要存在于結(jié)締組織的纖維狀蛋白中。

（3）6-N-甲基賴氨酸存在于肌球蛋白中

（4）г-羧基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有結(jié)合Ca2+離子功能的蛋白質(zhì)中。

（5）Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲狀腺素存在于甲狀腺蛋白中（6）鎖鏈素由4個(gè)Lys組成存在于彈性蛋白中第30頁/共169頁2023/4/1831第31頁/共169頁2023/4/1832β-Ala（泛素的前體）、γ-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)）（三）

非蛋白質(zhì)氨基酸不組成蛋白質(zhì)，但有生理功能的氨基酸L-瓜氨酸、L-鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間物1、L-型α–氨基酸的衍生物2、D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）3、β-、γ-、δ-氨基酸第32頁/共169頁2023/4/1833第33頁/共169頁第34頁/共169頁2023/4/1835精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間物。三、氨基酸的功能1、組成蛋白質(zhì)2、一些氨基酸及其衍生物充當(dāng)化學(xué)信號(hào)分子-氨基丁酸，色氨酸衍生物：5-羥色胺、褪黑激素，都是神經(jīng)遞質(zhì)。甲狀腺素（Tyr衍生物），吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素3、氨基酸是許多含N分子的前體物核酸的含氮堿基、血紅素、葉綠素的合成都需要氨基酸。4、一些基本氨基酸和非基本氨基酸是代謝中間物第35頁/共169頁2023/4/1836Gly（甘氨酸）只有一種構(gòu)型,無旋光性Thr（蘇氨酸）和Ile（異亮氨酸）有四種光學(xué)異構(gòu)體。其余17種氨基酸有兩種光學(xué)異構(gòu)體：L型、D型。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型。

四、氨基酸的構(gòu)型、旋光性和光吸收1、

氨基酸的構(gòu)型第36頁/共169頁2023/4/1837第37頁/共169頁2023/4/1838

L-蘇氨酸和D-蘇氨酸組成消旋物。L-別一蘇氨酸和D-別-蘇氨酸組成消旋物2、

氨基酸的旋光性★氨基酸的旋光性（符號(hào)和大小）取決于它的R基的性質(zhì)，并與溶液的pH值有關(guān)?！锿庀铮篋-型和L-型的等摩爾混合物。第38頁/共169頁2023/4/1839胱氨酸有三種立體異構(gòu)體：

L-胱氨酸、D-胱氨酸、內(nèi)消旋胱氨酸。L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物★內(nèi)消旋物：分子內(nèi)消旋第39頁/共169頁2023/4/18403、氨基酸的光吸收性Tyr、Phe、Trp的R基含有共軛雙鍵，在220-300nm近紫外區(qū)有吸收。p145第40頁/共169頁2023/4/1841五、

氨基酸的酸堿性質(zhì)1、氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在2、氨基酸的兩性解離和酸堿滴定曲線（1）pKa/就是氨基酸50%解離（[堿]=[酸]）時(shí)溶液的pH值，Ka/就是此時(shí)溶液的[H+]（2）當(dāng)HA50%解離時(shí)，溶液的pH值等于pKa/（3）pH=pKa/時(shí)，[堿]=[酸]（50%解離）

pH>pKa/時(shí)，[堿]>[酸]（＞50%解離）

pH<pKa/時(shí)，[酸]>[堿]（＜50%解離）第41頁/共169頁2023/4/1842甘氨酸的滴定曲線（解離曲線）第42頁/共169頁2023/4/1843起點(diǎn)：100%G+

凈電荷：+1第一拐點(diǎn)：

50%G+

，50%G±

平均凈電荷：+0.5

pH=pK1+lg[G±]/[G+]=pK1=2.34第二拐點(diǎn)：0%G±

凈電荷：0

等電點(diǎn)pI=5.97第三拐點(diǎn)：50%G±

，50%G-

平均凈電荷：-0.5

pH=pK2+lg[G-]/[G±]=pK2=9.6終點(diǎn)：

100%G-

凈電荷：-1在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。第43頁/共169頁2023/4/1844第44頁/共169頁2023/4/1845Gly等電點(diǎn)的計(jì)算第45頁/共169頁2023/4/184622)3()3()(RNHNHCOOHpKpKpIpKpKpI+=+=---a2)(RCOOHpKpKpI+=-aaa中性氨基酸堿性氨基酸酸性氨基酸氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算第46頁/共169頁2023/4/1847★pH<pI時(shí)，-NH2解離成-NH3+，氨基酸帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。★pH>pI時(shí)，-COOH解離成-COO-，氨基酸帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下向正極移動(dòng)?！飌H=pI時(shí)，氨基酸凈電荷為零，在電場(chǎng)中不移動(dòng)第47頁/共169頁2023/4/1848六、

氨基酸的化學(xué)性質(zhì)+HNO2+N2↑

收集反應(yīng)放出的氮?dú)猓捎脕頊y(cè)定氨基酸的含量，這種測(cè)定氨基酸含量的方法稱為范斯萊克（Vanslyke）氨基測(cè)定法。1、與亞硝酸反應(yīng)（一）α-NH2參加的反應(yīng)第48頁/共169頁2023/4/1849

芐氧甲酰氯（carbobenzyloxychloride,Cbz-Cl)

叔丁氧甲酰氯對(duì)-甲苯磺酰氯鄰苯二甲酸酐2、與?；噭┓磻?yīng)氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時(shí)，氨基即被酰基化。?；噭秕；噭┰诙嚯牡娜斯ず铣芍斜挥米靼被Ｗo(hù)劑。P136第49頁/共169頁2023/4/1850（DNS-氨基酸，黃色熒光）★丹磺酰氯（DNS-Cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽鏈—NH2末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測(cè)定。第50頁/共169頁2023/4/1851★Sanger

反應(yīng)

（2，4一二硝基氟苯，DNFB）

DNP-氨基酸被Sanger用來測(cè)定多肽的NH2末端氨基酸3、

烴基化反應(yīng)（弱堿）（黃色）

氨基酸氨基的一個(gè)H原子可被烴基（包括環(huán)烴及其衍生物）取代。第51頁/共169頁2023/4/1852苯異硫氰酸酯，PITC

苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-多肽）苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），無色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸

（弱堿）（CH3NO2/H+）★Edman反應(yīng)第52頁/共169頁2023/4/1853甲醛甲醛西佛堿是某些酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物（如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間產(chǎn)物）。4、生成西佛堿的反應(yīng)（Schiff）氨基酸的α-氨基能與醛類化合物反應(yīng)生成弱堿（Schiff’sbase）第53頁/共169頁2023/4/18545、脫氨基反應(yīng)

氨基酸在生物體內(nèi)經(jīng)氨基酸氧化酶催化即脫去α-氨基而轉(zhuǎn)變成酮酸。CH3CCOOHO氨基酸氧化酶第54頁/共169頁2023/4/1855（二）α-羧基參加的反應(yīng)1、成鹽、成酯反應(yīng)可以屏蔽羧基活化氨基RCHCOOHNH2+C2H5OH干燥，HCl回流RCHCOOC2O5NH3Cl-++H2O成酯反應(yīng)RCHCOOHNH2+NaOHRCHCOONaNH2+H2O第55頁/共169頁2023/4/1856

氨基被保護(hù)后，羧基可與二氯亞砜或五氯化磷反應(yīng)，生成酰氯，使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。

2、成酰氯的反應(yīng)HN-保護(hù)基R-CH-COOH+PCl5HN-保護(hù)基R-CH-COOCl+POCl3+HCl第56頁/共169頁2023/4/18573、疊氮反應(yīng)活化羧基，可用于肽的人工合成。YNHOR-CH-C-OCH3?；被峒柞ィ╕=酰基）YNHOR-CH-C-NHNH2?；被狨ｋ翹H2NH2YNHOR-CH-C-N-N=N+H2O?；被岑B氮第57頁/共169頁2023/4/1858將-氨基酸加熱時(shí)，可脫去CO2得到胺。Ba(OH)2△尸胺4、脫羧基反應(yīng)第58頁/共169頁2023/4/1859

茚三酮在弱酸中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨，脫羧反應(yīng)，最后，茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物——氨和還原茚三酮反應(yīng)，生成紫色物質(zhì)（λmax=570nm）。（三）α-NH2和α-COOH共同參加的反應(yīng)1、與茚三酮反應(yīng)第59頁/共169頁++NH3CO2RCHOH+

++CCCOHOCCCOON藍(lán)紫色復(fù)合物Pro、Hy-Pro與直接形成黃色化合物（λmax=440nm）茚三酮還原茚三酮還原茚三酮茚三酮（λmax=570nm）第60頁/共169頁2023/4/18612、成肽反應(yīng)

一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基可以縮合成肽，形成的鍵稱肽鍵。肽鍵第61頁/共169頁2023/4/1862（四）

側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)

——用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾略第62頁/共169頁2023/4/1863（一）基于電荷性質(zhì)差異的分離方法七、

氨基酸的分離和分析Glu、Leu、His、Lys，4種混合樣，在pH6.0時(shí)，泳動(dòng)方向1、電泳分離電泳的基本原理GluLeuHisLyspI3.225.987.599.74+-第63頁/共169頁2023/4/18642、

離子交換柱層析磺酸型陽離子交換樹脂氨基酸與樹脂上解離基團(tuán)之間的靜電引力氨基酸與樹脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水作用NH3-CH-COOHR+第64頁/共169頁2023/4/1865第65頁/共169頁2023/4/1866第66頁/共169頁2023/4/18671、紙層析流動(dòng)相：丁醇、醋酸、水★基本步驟：點(diǎn)樣、展層、現(xiàn)色、定性（定量）（二）基于分配系數(shù)（極性）差異的分離方法

——分配層析分配系數(shù)：在流動(dòng)相中分配系數(shù)越大，移動(dòng)越快。固定相：吸附的水逆流分溶原理第67頁/共169頁2023/4/18682、薄層層析★基本步驟：鋪板、點(diǎn)樣、展層、現(xiàn)色、定性（定量）★支持劑：纖維素粉、硅膠、氧化鋁粉第68頁/共169頁2023/4/18693、分配柱層析支持劑：纖維素、淀粉、硅膠固定相：吸附水流動(dòng)相；苯酚、正丁醇第69頁/共169頁2023/4/1870固定相：涂有薄層液體的惰性顆粒流動(dòng)相：H2、N2、CO2★前提：樣品能汽化、熱穩(wěn)定（三）氣液層析（氣相層析、氣相色譜）第70頁/共169頁2023/4/1871分配層析離子交換層析吸附層析凝膠過濾層析（四）高效液相層析（HPLC）第71頁/共169頁2023/4/1872第三節(jié)

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

（共價(jià)結(jié)構(gòu)）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次第72頁/共169頁2023/4/1873蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序(含二硫鍵)一級(jí)結(jié)構(gòu)（共價(jià)結(jié)構(gòu)）二級(jí)結(jié)構(gòu)

多肽主鏈中各個(gè)肽段借助于相鄰氨基酸之間的氫鍵形成的構(gòu)象。主要有α-螺旋、β折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲。超二級(jí)結(jié)構(gòu)

由兩個(gè)以上二級(jí)結(jié)構(gòu)單元相互聚集形成的有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合體如αα、βαβ、βββ。第73頁/共169頁2023/4/1874第74頁/共169頁2023/4/1875第75頁/共169頁2023/4/1876第76頁/共169頁2023/4/1877第77頁/共169頁2023/4/1878

大的球蛋白分子中，多肽鏈形成幾個(gè)緊密的球狀構(gòu)象，彼此以松散的肽鏈相連，此球狀構(gòu)象是結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域是多肽鏈的獨(dú)立折疊單位，一般由100-200個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。結(jié)構(gòu)域第78頁/共169頁2023/4/1879單鏈蛋白質(zhì)只有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，無四級(jí)結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)

整條多肽鏈或亞基通過盤旋、折疊，形成緊密的、借各種次級(jí)鍵維持的球狀構(gòu)象。四級(jí)結(jié)構(gòu)寡聚蛋白中亞基種類、數(shù)目、空間排布及亞基間相互作用力。第79頁/共169頁2023/4/1880第80頁/共169頁2023/4/1881第81頁/共169頁2023/4/1882酰胺平面，肽單位間以α-C原子相隔，構(gòu)成肽鏈。一、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽

一個(gè)氨基酸的羧基和另一個(gè)氨基酸的氨基脫水縮合而成的化合物。其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。肽鍵氨基酸間脫水后形成的共價(jià)鍵稱肽鍵（酰氨鍵）。肽單位第82頁/共169頁2023/4/1883五肽

名稱：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸寫法：ＮSer-Gly--Try-AlaLeu或ＳＧＹＡＬ，第83頁/共169頁2023/4/1884肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵具有平面性，組成肽鍵的4個(gè)原子和2個(gè)Cα幾乎處在同一平面內(nèi)（酰氨平面）。肽鍵亞氨基在pH014內(nèi)不解離?！镫逆I的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)第84頁/共169頁2023/4/1885★多肽鏈可以看成由Cα串聯(lián)起來的無數(shù)個(gè)酰胺平面組成第85頁/共169頁2023/4/1886

短肽在晶體和水溶液中也是以偶極離子形式存在。

肽的酸堿性質(zhì)主要取決于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及側(cè)鏈Ｒ上可解離的基團(tuán)。在長(zhǎng)肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)。二、肽的重要性質(zhì)1、旋光性一般短肽的旋光度等于其各個(gè)氨基酸的旋光度的總和。2、肽的酸堿性質(zhì)第86頁/共169頁2023/4/1887雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，游離氨基酸無此反應(yīng)。3、肽的化學(xué)反應(yīng)

肽的α-羧基，α-氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)?！镫p縮脲反應(yīng)

凡是有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，可用于定量分析。H2N-CO-NH-CO-NH2雙縮脲CuSO4-NaOH紫紅色化合物第87頁/共169頁2023/4/1888★紅細(xì)胞中的巰基緩沖劑。☆參與氧化還原過程，清除內(nèi)源性過氧化物和自由基，維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心的巰基處于還原狀態(tài)。

三、天然存在的活性肽1、谷胱甘肽Glu—Cys—Gly第88頁/共169頁2023/4/1889

由短桿菌產(chǎn)生的10肽環(huán)?？垢锾m氏陽性細(xì)菌，臨床用于治療化濃性病癥。

2、

短桿菌肽（抗生素）第89頁/共169頁2023/4/1890①合成蛋白質(zhì)的剪切、修飾②酶專一性逐步合成（如谷胱甘肽）、③動(dòng)物腸道可吸收寡肽3、

腦啡肽（5肽）

Met腦啡肽：

Tyr—Gly—Gly—Phe—Met

Leu腦啡肽：

Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu

具有鎮(zhèn)痛作用。生物體內(nèi)寡肽的來源第90頁/共169頁2023/4/18914、肽類激素第91頁/共169頁2023/4/1892四、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定（一）蛋白質(zhì)測(cè)序的基本策略

對(duì)于一個(gè)純蛋白質(zhì)，理想方法是從N端直接測(cè)至C端，但目前只能測(cè)60個(gè)N端氨基酸。1、直接法（測(cè)蛋白質(zhì)的序列）2、間接法（測(cè)核酸序列推斷氨基酸序列）第92頁/共169頁2023/4/1893（1）

測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目（2）

拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。（3）

斷裂鏈內(nèi)二硫鍵。（4）分析多肽鏈的N末端和C末端。（5）

測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成。（6）

多肽鏈部分裂解成肽段。（7）

測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序（8）

確定肽段在多肽鏈中的順序。（9）

確定多肽鏈中二硫鍵的位置。（二）蛋白質(zhì)測(cè)序的一般步驟第93頁/共169頁2023/4/1894估算氨基酸殘基數(shù)，確定肽鏈數(shù) 方法：SDS

凝膠過濾法沉降系數(shù)法（三）測(cè)序前的準(zhǔn)備工作1、

蛋白質(zhì)的純度鑒定要求：純度97%以上，均一。鑒定方法：

⑴聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)要求一條帶。

⑵DNS—Cl（二甲氨基萘磺酰氯）法測(cè)N端氨基酸。2、測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量第94頁/共169頁2023/4/1895酸水解的同時(shí)輔以堿水解。確定肽鏈中各種氨基酸出現(xiàn)的頻率,便于選擇裂解方法及試劑。3、

確定亞基種類及數(shù)目根據(jù)分子量和N末端數(shù)4、拆分多肽鏈，分別分離純化⑴非共價(jià)鍵結(jié)合：

8mol/L尿素，SDS⑵二硫鍵結(jié)合：過甲酸氧化：—S—S—+HCOOOH→SO3Hβ巰基乙醇還原5、

測(cè)定氨基酸組成第95頁/共169頁2023/4/18966、端基分析N端分析★DNS-Cl法最常用，黃色熒光，靈敏度極高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取?！顳NFB法Sanger試劑，DNP-多肽，酸水解，黃色DNP-氨基酸，有機(jī)溶劑（乙酸乙酯）抽提分離，紙層析、薄層層析、液相等★PITC法Edman法，逐步切下。無色PTH-氨基酸，有機(jī)溶劑抽提，層析第96頁/共169頁2023/4/1897無水肼NH2NH2100℃5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游離氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。C端分析★肼解法第97頁/共169頁2023/4/1898羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端氨基酸羧肽酶B：只水解Arg、Lys羧肽酶法測(cè)C末端★羧肽酶法（Pro不能測(cè)）第98頁/共169頁2023/4/1899①溴化氰

—Met—X—

產(chǎn)率85%②亞碘?；郊姿?/p>

—Trp—X—

產(chǎn)率70-100%

③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）

—X—Cys—④羥胺NH2OH

—Asn—Gly—

約150個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次（四）肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化1、化學(xué)裂解法第99頁/共169頁2023/4/18100胰蛋白酶

Lys——X(X≠Pro)Arg——X

胰凝乳蛋白酶

Tyr——X(X≠Pro)Trp——X

Phe——X胃蛋白酶

Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)Glu蛋白酶

Glu——X（Vs蛋白酶）Arg蛋白酶

Arg——XLys蛋白酶

X——LysPro蛋白酶

Pro——X2、酶法裂解第100頁/共169頁2023/4/18101①電泳法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根據(jù)分子量大小分離②離子交換層析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根據(jù)肽段的電荷特性分離③反相ＨＰＬＣ法根據(jù)肽段的極性分離凝膠過濾根據(jù)肽段的大小分離3、肽段的分離純化要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ單帶ＨＰＬＣ單峰Ｎ端單一（常用ＤＮＳ－Cl法）第101頁/共169頁2023/4/18102（1）耦聯(lián)PITC＋H２N—A-B-C-DpH8—9，40℃PTC——A-B-C-D（2）裂解無水三氟乙酸（TFA）

ATZ—A+H2N—B-C-D（3）轉(zhuǎn)化PTH—A

PTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸）

（五）肽段序列測(cè)定及肽鏈的拼接1、Edman法第102頁/共169頁2023/4/18103熒光基-團(tuán)或有色試劑標(biāo)記的PITC試劑。4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4’異硫氰酸酯。2、DNS-Edman法用DNS法測(cè)N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。3、有色Edman法第103頁/共169頁2023/4/18104儀器原理：Edman法。1967液相測(cè)序儀自旋反應(yīng)器，適于大肽段。1971固相測(cè)序儀表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的Ｃ端。1981氣相測(cè)序儀用Polybrene反應(yīng)器。（聚陽離子）四級(jí)銨鹽聚合物液相：5nmol20-40肽97%

氣相：5pmol60肽98%4、用自動(dòng)序列分析儀測(cè)序第104頁/共169頁2023/4/1810516肽，Ｎ端HＣ端ＳＡ法裂解：ONSPSEOVERLAHOWT

Ｂ法裂解：SEOWTONVERLAPSHO重疊法確定序列：HOWTONSEOVERLAPS5、肽段拼接成肽鏈第105頁/共169頁2023/4/18106第106頁/共169頁2023/4/18107第107頁/共169頁2023/4/18108①碘乙酰胺封閉-SH②胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì)③第一向電泳④過甲酸氧化—S—S—生成-SO3H⑤第二向電泳⑥分離出含二硫鍵的兩條短肽，測(cè)序⑦與拼接出的肽鏈比較，定出二硫鍵的位置。（六）二硫鍵、酰胺及其他修飾基團(tuán)的確定1、二硫鍵的確定（對(duì)角線電泳法）方法第108頁/共169頁2023/4/18109★Asp–Asn、Glu-Gln

酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個(gè)Asx或Glx的肽，用電泳法確定是Asp還是Asn★L(fēng)eu-Glx-Pro-Val肽

在pH=6.0時(shí)，電荷量是Leu+Pro0Val-

此肽除Glx外，凈電荷為0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是Glu或是Gln。2、酰胺的確定舉例第109頁/共169頁2023/4/18110Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg)–Ala-Ser(PO4)3、糖、脂、磷酸基位置的確定糖類通過Asn、Ser與蛋白質(zhì)連接，-N-糖苷-0-糖苷脂類Ser、Thr、Cys磷酸Ser、Thr、His經(jīng)驗(yàn)性序列第110頁/共169頁2023/4/18111★牛胰RNase變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn)五、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能（一）蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能

用(8M尿素+β硫基乙醇)變性、失活透析后構(gòu)象恢復(fù)，活性恢復(fù)95%以上。牛胰RNase共有124個(gè)氨基酸殘基

4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。

分子量：12600p181第111頁/共169頁2023/4/18112第112頁/共169頁2023/4/18113血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。（二）同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。例第113頁/共169頁2023/4/18114①同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性（序列同源性）②有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。③多肽鏈長(zhǎng)度相同或相近同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)第114頁/共169頁2023/4/18115親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。

通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。第115頁/共169頁2023/4/18116分子量：12,500左右氨基酸殘基：100個(gè)左右，單鏈。25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。人與黑猩猩0人與猴1人與狗10人與酵母441、細(xì)胞色素C第116頁/共169頁2023/4/18117●有24個(gè)氨基酸殘基位置始終不變：A．B鏈上6個(gè)Cys不變，其余18個(gè)氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用?！衿渌勺儼被釋?duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對(duì)免疫反應(yīng)起作用?！褙i與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。2、胰島素第117頁/共169頁2023/4/18118第118頁/共169頁2023/4/18119

鐮刀形紅細(xì)胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的鏈第6位的aa線基由正常的Glu變成了疏水性的Val。

正常人血紅蛋白β.NGlu6鐮刀型貧血β.NVal6生理?xiàng)l件下電荷：Glu-Va10

親水疏水（三）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變分子病分子病基因突變引起的某個(gè)功能蛋白的某一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能部分或全部喪失。例第119頁/共169頁2023/4/18120第120頁/共169頁2023/4/18121第121頁/共169頁2023/4/18122（四）一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活1、

血液凝固的機(jī)理凝血因子（凝血酶原致活因子）凝血酶原凝血酶血纖維蛋白原血纖維蛋白血纖維蛋白凝塊第122頁/共169頁2023/4/18123（1）凝血酶原在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275、Arg323—Ile324斷裂，產(chǎn)生活性凝血酶。

A鏈49氨基酸

B鏈259氨基酸第123頁/共169頁2023/4/18124（2）血纖維蛋白原

從二條α鏈和二條β鏈的N端各斷裂一個(gè)特定的肽鍵-Arg—Gly-，釋放出二個(gè)纖維肽A（19個(gè)氨基酸）和二個(gè)纖維肽B（21個(gè)氨基酸），它們含有較多的酸性氨基酸殘基。第124頁/共169頁2023/4/18125A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)分子間聚集，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

在凝血因子XIIIa（纖維蛋白穩(wěn)定因子）催化下，纖維蛋白質(zhì)單體間形成共價(jià)?。℅ln-Lys結(jié)合），生成交聯(lián)的纖維蛋白。第125頁/共169頁2023/4/181262、胰島素原的激活前胰島素原（含信號(hào)肽）胰島素原活性胰島素（在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除）（在高爾基體上切除C肽）第126頁/共169頁2023/4/18127胰島素原活性胰島素第127頁/共169頁2023/4/18128第128頁/共169頁2023/4/18129從理論上講，一個(gè)多肽主鏈能有無限多種構(gòu)象。但是，只有一種或很少幾種天然構(gòu)象，且相當(dāng)穩(wěn)定。因?yàn)椋禾烊坏鞍踪|(zhì)主鏈上的單鍵并不能自由旋轉(zhuǎn)。第四節(jié)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和纖維狀蛋白質(zhì)一、多肽主鏈折疊的空間限制第129頁/共169頁2023/4/181301、

肽鏈的二面角

★環(huán)繞Cα—N鍵旋轉(zhuǎn)的角度為Φ環(huán)繞Cα—C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱Ψ★只有α碳原子連接的兩個(gè)鍵（Cα—N和Cα-C）是單鍵，能自由旋轉(zhuǎn)。第130頁/共169頁2023/4/18131★從Cα沿鍵軸方向看，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)的Φ(Ψ)角為正值，反之為負(fù)值。★當(dāng)Φ(Ψ)旋轉(zhuǎn)鍵兩側(cè)的主鏈呈順式時(shí)，規(guī)定Φ(Ψ)=0°第131頁/共169頁2023/4/18132Φ和Ψ同時(shí)為0的構(gòu)象實(shí)際不存在二面角（Φ、Ψ）所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個(gè)相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無阻礙。Cα上的R基的大小與帶電性影響Φ和Ψ2、拉氏構(gòu)象圖：可允許的Φ和Ψ值拉氏構(gòu)象圖Ramachandran根據(jù)蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離，確定了哪些成對(duì)二面角（Φ、Ψ）所規(guī)定的兩個(gè)相鄰肽單位的構(gòu)象是允許的，哪些是不允許的，并且以Φ為橫坐標(biāo)，以Ψ為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)圖上標(biāo)出，該坐標(biāo)圖稱拉氏構(gòu)象圖。p206第132頁/共169頁2023/4/18133第133頁/共169頁2023/4/18134⑴實(shí)線封閉區(qū)域一般允許區(qū)，非鍵合原子間的距離大于一般允許距離，此區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的構(gòu)象都是允許的，且構(gòu)象穩(wěn)定。⑵虛線封閉區(qū)域是最大允許區(qū)，非鍵合原子間的距離介于最小允許距離和一般允許距離之間，立體化學(xué)允許，但構(gòu)象不夠穩(wěn)定。⑶虛線外區(qū)域是不允許區(qū)，該區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的肽鏈構(gòu)象，都是不允許的，此構(gòu)象中非鍵合原子間距離小于最小允許距離，斥力大，構(gòu)象極不穩(wěn)定。對(duì)非Gly氨基酸殘基，一般允許區(qū)占全平面的7.7%，最大允許區(qū)占全平面20.3％第134頁/共169頁2023/4/18135第135頁/共169頁2023/4/18136Thecrystalstructureofpyruvatekinase第136頁/共169頁2023/4/18137★多肽主鏈按右手或左手方向盤繞，形成右手螺旋或左手螺旋，★相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵★構(gòu)成螺旋的每個(gè)Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。二、

二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類型1、α螺旋α螺旋的一般特征第137頁/共169頁2023/4/18138第138頁/共169頁2023/4/18139第139頁/共169頁2023/4/18140第140頁/共169頁2023/4/18141①二面角：Φ=-57°,Ψ=-48°，是一種右手螺旋②每圈螺旋：3.6個(gè)a.a殘基，高度：0.54nm③每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100°，沿軸上升0.15nm④氨基酸殘基側(cè)鏈向外⑤相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鏈，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。⑥肽鍵上C=O氧與它后面（C端）第四個(gè)殘基上的N-H氫間形成氫鍵。典型的α螺旋有如下特征第141頁/共169頁2023/4/18142①多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸殘基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成穩(wěn)定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。②Gly在肽中連續(xù)存在時(shí)，不易形成α—螺旋。③R基大（如Ile）不易形成α—螺旋④Pro、脯氨酸中止α—螺旋。⑤R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成α—螺旋。R側(cè)鏈對(duì)α—螺旋的影響第142頁/共169頁2023/4/18143pH對(duì)α—螺旋的影響第143頁/共169頁2023/4/18144右手螺旋比左手螺旋穩(wěn)定。

蛋白質(zhì)中的α—螺旋幾乎都是右手，但在嗜熱菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋。右手α-螺旋與左手α-螺旋第144頁/共169頁2023/4/18145α-螺旋結(jié)構(gòu)是一種不對(duì)稱的分子結(jié)構(gòu)：★α碳原子的不對(duì)稱性，★構(gòu)象本身的不對(duì)稱性。天然α—螺旋能引起偏振光右旋α-螺旋的比旋不等于構(gòu)成其本身的氨基酸比旋的加和，而無規(guī)卷曲的肽鏈比旋則等于所有氨基酸比旋的加和。α-螺旋結(jié)構(gòu)的旋光性第145頁/共169頁2023/4/18146平行式：所有參與β-折疊的肽鏈的N端在同一方向。反平行式：肽鏈的極性一順一倒，N端間隔相同反平β-折疊比平行的更