基因診斷與測(cè)序技術(shù)在其中應(yīng)用-陳然-2015-03-20

基因診斷與測(cè)序技術(shù)在其中應(yīng)用_陳然_2015-03-20第一頁(yè)，共75頁(yè)。內(nèi)容第二頁(yè)，共75頁(yè)?；蛟\斷的概念內(nèi)容-1第三頁(yè)，共75頁(yè)?；蛟\斷≠基因預(yù)測(cè)基因檢測(cè)基因預(yù)測(cè)基因診斷即分子診斷，應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化等而做出的或輔助臨床診斷的技術(shù)。又稱基因體檢，通過(guò)檢測(cè)基因判斷未來(lái)患某種疾病的可能性（風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)），進(jìn)而加強(qiáng)健康管理?；蛟\斷≠基因治療基因診斷的概念第四頁(yè)，共75頁(yè)。正常人不會(huì)發(fā)生融合基因或基因突變。某些疾病的患者會(huì)檢測(cè)出融合基因或基因突變。分子實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的診斷類檢測(cè)-1第五頁(yè)，共75頁(yè)。正常人和某些疾病的患者間基因表達(dá)量不同。正常人之間的基因分型不同。分子實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的診斷類檢測(cè)-2第六頁(yè)，共75頁(yè)?；驕y(cè)序技術(shù)及發(fā)展沿革內(nèi)容-2第七頁(yè)，共75頁(yè)。DNA測(cè)序技術(shù)，即基因測(cè)序技術(shù)，是指測(cè)定DNA堿基序列的技術(shù)。人類基因組約有30億個(gè)堿基對(duì)。大部分DNA測(cè)序的目的是得到特定基因的特定區(qū)域上序列信息——A、T、G、C四種堿基的排列順序，即靶向基因測(cè)序/目標(biāo)區(qū)域測(cè)序。通過(guò)對(duì)比被檢者的堿基排列順序是否與正常人一致，以此作為疾病診斷的依據(jù)。測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究，各類疾病的檢測(cè)和篩查，物種鑒定，農(nóng)作物篩選，基因工程……基因測(cè)序技術(shù)第八頁(yè)，共75頁(yè)。為什么使用測(cè)序技術(shù)進(jìn)行診斷既能檢測(cè)已知突變、也能檢測(cè)未知突變。二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得基因診斷的深度和廣度得到極大擴(kuò)展，使得多基因參與的復(fù)雜疾病檢測(cè)，及高靈敏度檢測(cè)成為可能。能夠檢測(cè)一段區(qū)域內(nèi)的所有點(diǎn)突變。——具備成本和可操作性上的優(yōu)勢(shì)。第九頁(yè)，共75頁(yè)。ThermoLife/ABI3500xLBeckmanCoulterGenomeLabGeXPRoche/454GenomeSequenserFLXIllunimaHiSeq2500Life/IonTorrentPGMPacBioRSSystem一代測(cè)序二代測(cè)序三代測(cè)序1977起2005起2011起ThermoLife/ABISolid5500測(cè)序技術(shù)的發(fā)展第十頁(yè)，共75頁(yè)。一代測(cè)序二代測(cè)序(NGS)三代測(cè)序(3GS)技術(shù)原理雙脫氧末端終止法（Sanger法）+毛細(xì)管電泳（CE）；Roche454：高通量焦磷酸測(cè)序；Illumina：橋接PCR+邊合成邊測(cè)序；ABISolid：寡聚物連接檢測(cè)測(cè)序；IonTorrent：H+電位信號(hào)檢測(cè)+半導(dǎo)體芯片；——大規(guī)模平行測(cè)序（massivelyparallelDNAsequencing），生物信息技術(shù)處理產(chǎn)出數(shù)據(jù)；單分子實(shí)時(shí)測(cè)序；特點(diǎn)高讀長(zhǎng)；檢測(cè)通量中等；檢測(cè)靈敏度低；單孔成本低，適用于少數(shù)基因的少量位點(diǎn)測(cè)序；檢測(cè)通量高；檢測(cè)靈敏度高；開(kāi)機(jī)運(yùn)行成本高，但平攤到每樣本、每堿基的成本低；適用于多基因，多位點(diǎn)的測(cè)序；可自動(dòng)完成數(shù)據(jù)分析；高讀長(zhǎng)，特別適合于denovo測(cè)序；檢測(cè)通量高；準(zhǔn)確性低（81-83%）；開(kāi)機(jī)運(yùn)行成本很高；應(yīng)用范圍研究和臨床檢測(cè)；研究和臨床檢測(cè)；目前只用于研究；三代測(cè)序技術(shù)的比較第十一頁(yè)，共75頁(yè)。一代測(cè)序及片段分析檢測(cè)流程內(nèi)容-3第十二頁(yè)，共75頁(yè)。一代測(cè)序檢測(cè)流程第十三頁(yè)，共75頁(yè)。醫(yī)院前處理錄入Lis系統(tǒng)分子實(shí)驗(yàn)室分揀、登記物流標(biāo)本（血液）DNARNA提取核酸過(guò)程標(biāo)本收取&處理第十四頁(yè)，共75頁(yè)。PCR：PolymeraseChainReaction（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的簡(jiǎn)稱。PCR是一個(gè)在體外特異性的復(fù)制一段DNA片段的過(guò)程。1985年由美國(guó)科學(xué)家Mullis發(fā)明。分子生物學(xué)最常用的體外擴(kuò)增DNA的方法，使人們很快的獲得大量拷貝的特異DNA片段，利于繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)的分析。DNA模板；4種脫氧單核苷酸dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）；耐熱性聚合酶(如Taq)；一對(duì)特異性引物；適量的反應(yīng)緩沖液；基因擴(kuò)增儀（PCR儀）PCR擴(kuò)展目的基因片段第十五頁(yè)，共75頁(yè)。時(shí)間溫度延伸3變性1退火21個(gè)PCR循環(huán)包括變性、退火、延伸3步重復(fù)1~3步30-35輪目的DNA片段擴(kuò)增百萬(wàn)至億倍以上，能夠被電泳等后續(xù)方法檢測(cè)到。DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR程序第十六頁(yè)，共75頁(yè)。模板DNA95℃第十七頁(yè)，共75頁(yè)。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)56℃引物1引物2DNA引物第十八頁(yè)，共75頁(yè)。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃引物1引物2DNA引物TaqTaqdATPdGTPdTTPdCTP第十九頁(yè)，共75頁(yè)。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃第1輪循環(huán)結(jié)束第2輪循環(huán)開(kāi)始第二十頁(yè)，共75頁(yè)。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)TaqTaqTaqTaqdATPdGTPdTTPdCTP56℃72℃95℃第二十一頁(yè)，共75頁(yè)。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪循環(huán)結(jié)束第3輪、第4輪……第二十二頁(yè)，共75頁(yè)。No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824經(jīng)多次循環(huán)后靶片段擴(kuò)增的數(shù)量第二十三頁(yè)，共75頁(yè)。SAP：ShrimpAlkalinePhosphatase，蝦堿性磷酸酶，催化降解體系里多余的dNTP。ExoI：ExonucleaseI，核酸外切酶I，催化分解體系里多余的單鏈DNA（即引物）。同時(shí)向PCR產(chǎn)物中加入一定的SAP和ExoI，去除多余的dNTP和引物，只保留擴(kuò)增產(chǎn)物，達(dá)到純化的效果。酶解消化第二十四頁(yè)，共75頁(yè)。FrederickSanger,1918-2013。1958年和1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主。1977年提出雙脫氧末端終止法。在反應(yīng)體系中加入已經(jīng)過(guò)酶解消化的PCR產(chǎn)物、耐熱性聚合酶、4種脫氧單核苷酸dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、4種帶熒光標(biāo)記的雙脫氧單核苷酸ddNTP（包括ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）、單條特異性引物、適量的緩沖液。測(cè)序反應(yīng)：雙脫氧末端終止法（Sanger法）第二十五頁(yè)，共75頁(yè)。#由于雙脫氧單核苷酸缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，一旦摻入到DNA鏈中，此DNA鏈就不能進(jìn)一步延長(zhǎng)。#每當(dāng)DNA聚合酶需要dNTP參入到正常延長(zhǎng)的DNA鏈中時(shí)，就有兩種可能性，一是摻入ddNTP，結(jié)果導(dǎo)致DNA鏈延長(zhǎng)的終止；二是摻入dNTP，使DNA鏈仍可繼續(xù)延長(zhǎng)，直至摻入下一個(gè)ddNTP。#根據(jù)這一方法，就可得到一組長(zhǎng)短不一的鏈終止產(chǎn)物，彼此只相差一個(gè)堿基。它們有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的熒光標(biāo)記的ddNTP上。#通過(guò)高分辨電泳對(duì)這一組產(chǎn)物進(jìn)行分離，光學(xué)系統(tǒng)捕捉到ddNTP的熒光信號(hào)，以峰的形式展現(xiàn)成圖譜，并按順序排列。從電泳圖譜上可讀得DNA堿基序列。測(cè)序反應(yīng)：雙脫氧末端終止法（Sanger法）-2第二十六頁(yè)，共75頁(yè)。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化目的：去除多余熒光ddNTP對(duì)激光檢測(cè)器的干擾；方法：乙醇沉淀法。加入Hi-Di甲酰胺并變性：將DNA雙鏈打開(kāi)，維持其處于單鏈狀態(tài)。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化及變性第二十七頁(yè)，共75頁(yè)。基因分析儀工作原理基因分析儀是進(jìn)行毛細(xì)管電泳的儀器，而不是測(cè)序反應(yīng)發(fā)生的場(chǎng)所。毛細(xì)管電泳（CapillaryElectrophoresis，CE）：以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間的淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。毛細(xì)管電泳的分辨率比PAGE電泳更高，能夠分辨出1個(gè)堿基的DNA片段差異。經(jīng)雙脫氧末端終止法擴(kuò)增出來(lái)的以ddNTP結(jié)尾的長(zhǎng)短不一的DNA片段通過(guò)毛細(xì)管電泳分離，再經(jīng)激光系統(tǒng)對(duì)ddNTP上的熒光信號(hào)檢測(cè)，就能得到DNA的序列信息?；蚍治鰞x上機(jī)第二十八頁(yè)，共75頁(yè)。參考序列樣本序列報(bào)出與參考序列不一致的地方測(cè)序結(jié)果分析第二十九頁(yè)，共75頁(yè)。毛細(xì)管電泳分離Sanger法測(cè)序產(chǎn)物——一代測(cè)序分離PCR產(chǎn)物——片段分析片段分析（FragmentAnalysis）：用帶熒光標(biāo)記的引物擴(kuò)增目的DNA片段（可實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增），產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分離后得到熒光峰圖譜，再經(jīng)軟件處理得出產(chǎn)物的片段大小，從而得到基因型等結(jié)果。基因分析儀——不僅僅用于測(cè)序第三十頁(yè)，共75頁(yè)。測(cè)序：檢測(cè)DNA片段中的堿基序列。片段分析：分離熒光標(biāo)記的片段并檢測(cè)其大小。流程短；靈敏度高；多重?cái)U(kuò)增增加了檢測(cè)通量；應(yīng)用及衍生技術(shù)多；不能檢測(cè)點(diǎn)突變，不能檢測(cè)未知突變。測(cè)序vs片段分析第三十一頁(yè)，共75頁(yè)。片段分析的應(yīng)用第三十二頁(yè)，共75頁(yè)。片段分析的檢測(cè)流程第三十三頁(yè)，共75頁(yè)。PCR→上樣準(zhǔn)備→上機(jī)第三十四頁(yè)，共75頁(yè)。片段結(jié)果示例第三十五頁(yè)，共75頁(yè)。MLPA：MultiplexLigation-dependentProbeAmplification（多重連接依賴式探針擴(kuò)增）的簡(jiǎn)稱，由MRC-Holland公司于2002年首創(chuàng)。該技術(shù)利用雜交、連接和PCR擴(kuò)增反應(yīng)三個(gè)基本步驟，在單個(gè)反應(yīng)管內(nèi)可進(jìn)行最高達(dá)50種的核苷酸片段相對(duì)定量檢測(cè)。優(yōu)勢(shì)：通量高；靈敏度高；操作簡(jiǎn)單；特別適于檢測(cè)DNA缺失/重復(fù)突變（Indel），CNV（CopyNumberVariation）突變。局限：不能用于檢測(cè)STR（短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性）；不能用于檢測(cè)染色體平衡易位；不能用于單個(gè)細(xì)胞檢測(cè)；開(kāi)發(fā)新MLPA試劑盒很困難；只集中于人DNA分析；定量PCR不能達(dá)到SouthernBlot費(fèi)時(shí)費(fèi)力測(cè)序不能檢測(cè)中~大片段Indel和CNVMLPA技術(shù)第三十六頁(yè)，共75頁(yè)。MLPA技術(shù)流程第三十七頁(yè)，共75頁(yè)。缺失突變CNV突變MLPA舉例第三十八頁(yè)，共75頁(yè)。MLPA的量化結(jié)果第三十九頁(yè)，共75頁(yè)。ThermoFisherScientificLifeTechnologiesIonTorrent二代測(cè)序平臺(tái)內(nèi)容-4.1第四十頁(yè)，共75頁(yè)。IonTorrent公司簡(jiǎn)介IonTorrent公司，由Dr.JonathanRothberg創(chuàng)辦。創(chuàng)立454生命科學(xué)公司，推出第一臺(tái)NGS測(cè)序儀。2007年以1.4億美元被羅氏公司收購(gòu)。創(chuàng)立IonTorrent公司，推出第一臺(tái)半導(dǎo)體測(cè)序儀PGM。2010年以3.5億美元被LifeTechnologies收購(gòu)。創(chuàng)立RainDance公司，開(kāi)拓出第三代PCR——數(shù)字PCR技術(shù)。第四十一頁(yè)，共75頁(yè)。IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)-1成本低：設(shè)備價(jià)格實(shí)惠，無(wú)光學(xué)系統(tǒng)。通量靈活：選擇合適的芯片，無(wú)論樣本多少都能開(kāi)機(jī)。小型化：為臨床檢測(cè)而設(shè)計(jì)的臺(tái)式測(cè)序儀，改變了NGS的發(fā)展方向。快速性：無(wú)熒光檢測(cè)，測(cè)序步驟耗時(shí)短。IonPGM——首款半導(dǎo)體測(cè)序儀，全球銷售速度、普及速度最快的測(cè)序儀。第四十二頁(yè)，共75頁(yè)。IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)的原理第四十三頁(yè)，共75頁(yè)。IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序核心技術(shù)第四十四頁(yè)，共75頁(yè)。IonTorrent技術(shù)流程文庫(kù)制備手工完成模板制備手工完成上機(jī)測(cè)序自動(dòng)化完成數(shù)據(jù)分析自動(dòng)化完成核酸提取PCR擴(kuò)增目的片段第四十五頁(yè)，共75頁(yè)。文庫(kù)制備的目的第四十六頁(yè)，共75頁(yè)。模板制備的目的使ISP珠子上富集同一克隆的DNA片段。第四十七頁(yè)，共75頁(yè)。芯片上樣和測(cè)序儀測(cè)序

PGM的清洗PGM的初始化模板上芯片ISP珠子的Loading

第四十八頁(yè)，共75頁(yè)。PGM測(cè)序結(jié)果第四十九頁(yè)，共75頁(yè)。數(shù)據(jù)分析通過(guò)專用服務(wù)器的插件分析。插件平臺(tái)開(kāi)放，便于升級(jí)、共享。第五十頁(yè)，共75頁(yè)。VariantCaller插件分析結(jié)果第五十一頁(yè)，共75頁(yè)。Illumina二代測(cè)序平臺(tái)內(nèi)容-4.2第五十二頁(yè)，共75頁(yè)。Illumina公司，成立于1998年，原專注于BeadArray芯片分型技術(shù)。2006年收購(gòu)Solexa，不斷改良GenomeAnalyzerNGS平臺(tái)，目前成為高通量測(cè)序的行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者。Illumina公司簡(jiǎn)介第五十三頁(yè)，共75頁(yè)。Illumina二代測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)準(zhǔn)確性高：唯一在Q30上表現(xiàn)出色的二代測(cè)序平臺(tái)。世界上第一臺(tái)獲得FDA認(rèn)證的測(cè)序平臺(tái)。數(shù)據(jù)產(chǎn)出量巨大：大規(guī)模樣本一起測(cè)序時(shí)，每樣本平攤成本低。市場(chǎng)占有率高：眾多科研文章均是基于Illumina平臺(tái)發(fā)表。集成自動(dòng)化：Miseq可承擔(dān)簇生成、測(cè)序與數(shù)據(jù)分析。第五十四頁(yè)，共75頁(yè)。Illumina二代測(cè)序核心技術(shù)SequencingBySynthesis(SBS,邊合成邊測(cè)序)雜交的測(cè)序引物第一個(gè)堿基被合成，檢測(cè)熒光信號(hào)切掉阻遏基團(tuán)和熒光基團(tuán)第五十五頁(yè)，共75頁(yè)。Illumina二代測(cè)序技術(shù)流程-1第五十六頁(yè)，共75頁(yè)。Illumina二代測(cè)序技術(shù)流程-2決定了測(cè)序通量第五十七頁(yè)，共75頁(yè)。Illumina二代測(cè)序技術(shù)流程-3LibraryPreparation1ClusterGeneration2MiSeqcBotSequencing3MiSeqHiSeqDataAnalysis4MSRCASAVA手工完成自動(dòng)完成自動(dòng)完成自動(dòng)完成第五十八頁(yè)，共75頁(yè)。Illumina二代測(cè)序平臺(tái)的分工第五十九頁(yè)，共75頁(yè)。Vcf.out數(shù)據(jù)結(jié)果第六十頁(yè)，共75頁(yè)。測(cè)序結(jié)果的分類測(cè)序策略的選擇內(nèi)容-5第六十一頁(yè)，共75頁(yè)。測(cè)序結(jié)果報(bào)告&注釋-致病性突變第六十二頁(yè)，共75頁(yè)。測(cè)序結(jié)果報(bào)告&注釋-