生物化學第36章課件

第36章RNA的生物合成和加工(BiosynthesisandprocessingofRNA)一、DNA指導下RNA的合成二、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工三、在RNA指導下RNA和DNA的合成遺傳信息的流向轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的加工

貯存于DNA中的遺傳信息須通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而得到表達。在轉(zhuǎn)錄過程中，以DNA的一條鏈作模板，在RNA聚合酶的催化下，利用4種NTP為原料，合成與模板鏈互補的RNA分子。與DNA模板鏈互補的另一條DNA單鏈為意義鏈。

細胞內(nèi)的各種RNA都是通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的（某些RNA病毒除外，它們有RNA的復制），轉(zhuǎn)錄出的RNA通常需要經(jīng)過各種加工才能成為成熟的、有功能的RNA產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄的方向與模板鏈在一個DNA分子長鏈上有許多基因，若將DNA分子的兩條鏈分別稱為A鏈和B鏈，有些基因的模板鏈位于A鏈上，有些基因的模板鏈位于B鏈上，這兩類基因的轉(zhuǎn)錄方向剛好相反。注意：我們在描述一個基因的序列時，描述的是它的意義鏈。RNA一、DNA指導下RNA的合成

轉(zhuǎn)錄單位

在DNA指導下合成RNA稱為轉(zhuǎn)錄。在DNA長鏈上有許多基因，也有許多轉(zhuǎn)錄起始點和轉(zhuǎn)錄終止點，形成相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄單位。一個轉(zhuǎn)錄單位可以只含一個基因，稱為單順反子；也可以含多個基因，稱為多順反子。在每一個轉(zhuǎn)錄起始點附近都有特殊的序列，只有具有這種序列才能在此處起始轉(zhuǎn)錄，這種特殊的序列叫啟動子（promoter）。轉(zhuǎn)錄受到嚴格的調(diào)控

基因的轉(zhuǎn)錄是一種有選擇的過程，隨著不同的細胞類型、生長發(fā)育的不同階段、外界環(huán)境條件的變化而轉(zhuǎn)錄不同的基因。轉(zhuǎn)錄是基因表達調(diào)控中最重要的層次。（一）DNA指導的RNA聚合酶

DNA指導的RNA聚合酶簡稱RNA聚合酶，它以4種NTP為底物，需要DNA模板，RNA鏈的合成方向也是5’→3’，第一個核苷酸帶有3個磷酸，其后每加入一個核苷酸脫去一個焦磷酸，形成磷酸二酯鍵。RNA鏈合成的起始不需要引物。RNA聚合酶沒有校對功能。大腸桿菌RNA聚合酶

細菌的mRNA、rRNA和tRNA都由同一種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄速度在37℃約為50個核苷酸/s，與多肽鏈的合成速度（15個氨基酸/s）大致相當。

大腸桿菌RNA聚合酶由5種6個亞基組成，α2ββ’σω，其中α2ββ’是核心酶。σ因子的功能σ因子的功能在于引導RNA聚合酶穩(wěn)定地結(jié)合到DNA啟動子上，σ因子有多種，不同類型的啟動子由不同的σ因子識別。σ因子的存在對核心酶的構(gòu)象有較大影響，它導致RNA聚合酶與DNA的一般序列及啟動子序列的親和力有很大不同，極大地降低了酶與DNA一般序列的結(jié)合常數(shù)和停留時間，同時又大大增加了酶與啟動子的結(jié)合常數(shù)和停留時間。RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合

全酶可通過擴散與DNA任意部位結(jié)合，這種結(jié)合是疏松的，隨后酶結(jié)合的DNA部位迅速被置換，也可以說是酶在DNA上不斷地變換結(jié)合位點，直到遇上啟動子序列，隨即由疏松結(jié)合變成牢固結(jié)合。此處DNA雙鏈被局部解開，轉(zhuǎn)錄開始。轉(zhuǎn)錄開始后σ因子脫落，轉(zhuǎn)錄進入延伸階段。

大腸桿菌RNA聚合酶與DNA的相互作用σ因子與核心酶全酶全酶與DNA復合物核心酶鉗住DNAσ因子脫落真核生物RNA聚合酶的種類和性質(zhì)酶的種類功能對抑制劑的敏感性RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄45SrRNA前體，經(jīng)加工產(chǎn)生5.8S、18S和28SrRNA對α－鵝膏蕈堿不敏感RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄所有編碼蛋白質(zhì)的基因和大多數(shù)snRNA對α－鵝膏蕈堿敏感RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄小RNA的基因，包括tRNA、5SrRNA、U6snRNA和scRNA對α－鵝膏蕈堿中等敏感Back1

Back2真核生物細胞器RNA聚合酶

真核細胞的線粒體和葉綠體中也有自己的RNA聚合酶，它們分別轉(zhuǎn)錄線粒體和葉綠體中的基因。線粒體和葉綠體RNA聚合酶不同于細胞核RNA聚合酶，它們的結(jié)構(gòu)較簡單，類似于原核生物的RNA聚合酶，能催化線粒體中和葉綠體中各種RNA的轉(zhuǎn)錄，并被原核生物RNA聚合酶的抑制劑利福平等抑制。（二）啟動子和轉(zhuǎn)錄因子利用足跡法（footprint）和DNA測序法可以確定啟動子的序列結(jié)構(gòu)。DNA-proteincomplexNakedDNAprotein（↑ArrowsindicateDNaseⅠcleavagesites）RNA聚合酶與DNA的結(jié)合習慣上DNA的序列按其意義鏈來描述。從左到右相當于5’→3’方向。轉(zhuǎn)錄單位的起點核苷酸編號為+1，往右依次為+2,+3,·

·

·

·

·

·從+1往5’上游編號依次為-1,-2,·

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·

·

·

·當RNA聚合酶全酶最初與DNA結(jié)合時，它覆蓋的長度為75～80bp，從啟動子的-

55

～

+20。在轉(zhuǎn)錄起始階段結(jié)束時，σ因子被釋放，核心酶覆蓋的長度約為60bp。到核心酶再向前移動若干核苷酸后，核心酶進入延伸階段，只覆蓋30～40bp。大腸桿菌RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄的起始階段縮短覆蓋DNA的長度原核生物啟動子

在原核基因啟動子中，有一個位于-10的pribnowbox（TATAAT）和位于-35的sextamabox（TTGACA）。這兩個序列是決定啟動子強度的重要因素。Pribnowbox是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點及解鏈位點，sextamabox是RNA聚合酶的識別位點。在-10區(qū)和-35區(qū)之間的序列并不重要，然而這兩個區(qū)之間的距離卻十分重要。天然啟動子中這段距離大多為15~20bp，實驗表明這段距離為17bp時轉(zhuǎn)錄效率最高。大腸桿菌不同σ因子識別具有不同共有序列的啟動子基因因子用途-35序列間隔-10序列rpoDσ70通用TTGACA16~18bpTATAATrpoHσ32熱休克CCCTTGAA13~15bpCCCGATNTrpoEσE熱休克未知未知未知rpoNσ54氮源CTGGNA6bpTTGCAfliAσF鞭毛CTAAA15bpGCCGATAA真核生物啟動子真核生物啟動子有3類，分別由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ轉(zhuǎn)錄，起始轉(zhuǎn)錄需要許多轉(zhuǎn)錄因子的參與，啟動子的識別也是靠轉(zhuǎn)錄因子的作用。類別Ⅰ啟動子控制的基因有許多拷貝，往往成簇存在。這類啟動子由兩部分保守序列組成，核心啟動子（corepromoter）位于轉(zhuǎn)錄起點附近，從-45~+20；上游控制元件（upstreamcontrolelement）位于-180~-107。兩部分都有富含GC的區(qū)域。RNA聚合酶Ⅰ對其轉(zhuǎn)錄需要兩種轉(zhuǎn)錄因子的參與?；締幼宇悇eⅡ啟動子中的基本啟動子序列為中心在-25

~-30左右的7bp保守區(qū)，其堿基頻率為T82A97T93A85A82A63A50T37T37根據(jù)基本啟動子中保守序列的特點，也將其稱為TATABOX。幾種真核基因的基本啟動子RNA聚合酶Ⅱ和轉(zhuǎn)錄因子在啟動子上的裝配轉(zhuǎn)錄起始復合物的裝配起始子起始子是轉(zhuǎn)錄起始點處的一個保守序列，其共有序列如下PyPyANPyPy+1

T

A上游元件和應(yīng)答元件見P463表36-4真核生物類別Ⅲ啟動子

類別Ⅲ啟動子涉及一些小分子RNA的轉(zhuǎn)錄。5SrRNA、tRNA以及scRNA基因的啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始點的下游，即在基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)部。snRNA基因的啟動子在轉(zhuǎn)錄起始點的上游，與通常的啟動子類似。爪蟾5SrRNA基因的啟動子位于+55

~

+80。類別Ⅲ啟動子的結(jié)構(gòu)特點下游啟動子snRNA基因的上游啟動子（三）終止子和終止因子提供轉(zhuǎn)錄停止信號的DNA序列稱為終止子（terminator），協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的蛋白輔助因子稱為終止因子（terminationfactor）。有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使酶越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，這稱為通讀。這類能夠抗終止的蛋白質(zhì)因子稱為抗終止因子（antiterminationfactor）。原核生物終止子的結(jié)構(gòu)特點大腸桿菌有兩類終止子：一類稱為不依賴于ρ因子的終止子，或簡單終止子；另一類稱為依賴于ρ因子的終止子。簡單終止子有一段回文結(jié)構(gòu)，其后還有一系列U（約有6個），回文結(jié)構(gòu)中通常有一段富含GC的序列，寡聚U序列可能提供信號使RNA聚合酶脫離模板。依賴于ρ因子的終止子其回文結(jié)構(gòu)不含富有GC區(qū)，回文結(jié)構(gòu)之后也無寡聚U。依賴于ρ因子的終止子在細菌染色體中少見，而在噬菌體中廣泛存在。原核生物的兩類終止子不依賴與ρ因子的終止子依賴于ρ因子的終止子不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止機制在轉(zhuǎn)錄過程中，RNA聚合酶沿著模板鏈向前移動，它感受的終止信號來自剛轉(zhuǎn)錄出的RNA中，而不是感受DNA模板上的信號。在轉(zhuǎn)錄出終止子序列后，RNA上的終止序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在轉(zhuǎn)錄出不依賴于ρ因子的終止子序列后，RNA聚合酶感受到終止信號（發(fā)夾結(jié)構(gòu)和寡聚U），與模板脫離，新生RNA鏈也與模板DNA分開。依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止機制ρ因子以六聚體的形式存在，在有RNA存在時它能水解NTP，最近發(fā)現(xiàn)ρ因子有RNA-DNA解旋酶的活性?？菇K止作用抗終止作用主要見于某些噬菌體基因表達的時序控制。在早期基因轉(zhuǎn)錄表達出抗終止蛋白后，使得轉(zhuǎn)錄通讀，進入晚期基因表達。這種方式可使一個啟動子控制后面基因的時序表達。真核生物基因的轉(zhuǎn)錄終止真核生物轉(zhuǎn)錄的終止信號和終止過程還不清楚。實驗表明，RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在3’末端切斷，然后加上腺苷酸尾（polyA）。真核生物基因的轉(zhuǎn)錄終止mRNA在此處被切斷polyA加到3’末端加尾信號（五）RNA生物合成的抑制劑1.嘌呤和嘧啶類似物

它們抑制核苷酸合成酶類，或形成相應(yīng)的核苷酸后摻入到核酸中，影響RNA轉(zhuǎn)錄，也能影響DNA復制，從而可以用于癌癥治療。嘌呤和嘧啶類似物6-巰基嘌呤硫鳥嘌呤5-氟尿嘧啶8-氮鳥嘌呤2,6-二氨基嘌呤6-氮尿嘧啶（五）RNA生物合成的抑制劑2.DNA模板功能的抑制物烷化劑：修飾堿基，引起細胞突變和致癌。放線菌素：與DNA形成非共價復合物，低濃度可抑制RNA轉(zhuǎn)錄，高濃度抑制DNA復制。嵌入染料：可插入雙鏈DNA的相鄰堿基對之間，導致移碼突變，也能抑制轉(zhuǎn)錄和復制。堿基的烷化劑苯丁酸氮芥環(huán)磷酰胺放線菌素D嵌入染料吖啶黃原黃素吖啶橙溴乙錠（五）RNA生物合成的抑制劑3.RNA聚合酶的抑制劑利福霉素：抑制細菌RNA聚合酶的活性。利鏈菌素：抑制細菌RNA聚合酶的活性。α-鵝膏蕈堿：抑制真核生物RNA聚合酶活性。二、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工（一）原核生物中RNA的加工切割甲基化原核生物tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工原核生物tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA3’末端CCA的產(chǎn)生所有成熟tRNA分子的3’端都有CCA結(jié)構(gòu)，它對于接受氨?；潜匾?。細菌tRNA前體存在兩類不同的3’端序列。一類其自身具有CCA的結(jié)構(gòu)，將3’端多余的序列切除后剛好暴露出CCA序列；另一類是當切除3’端多余序列后，通過tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶加上CCA。

tRNA的加工還包括堿基的修飾。原核生物mRNA前體的加工細菌中的mRNA大多不需要加工，一經(jīng)轉(zhuǎn)錄即可直接進行翻譯。甚至在轉(zhuǎn)錄出部分mRNA序列時就已經(jīng)開始了翻譯，也就是一邊轉(zhuǎn)錄一邊翻譯，翻譯滯后一些。但也有少數(shù)多順反子mRNA須通過核酸內(nèi)切酶切割成較小的單位，然后再翻譯。這些較小的單位可以是單個基因，也可以是多個基因序列的組合。原核生物中的邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯（二）真核生物中RNA的一般加工真核生物rRNA和tRNA前體的加工過程與原核生物相似，但mRNA前體必須經(jīng)過復雜的加工，才能成為成熟的mRNA。真核生物rRNA前體的加工哺乳類動物的18S、5.8S和28SrRNA基因構(gòu)成一個轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生45SrRNA前體，然后通過剪切加工成各個成熟的rRNA。真核生物rRNA的修飾

rRNA在成熟過程中可被甲基化，主要的甲基化位點也在核糖2’羥基上。還有尿嘧啶轉(zhuǎn)變成假尿嘧啶的修飾。這些修飾和切割是由核仁小RNA（smallnucleolarRNA,snoRNA）指導的。snoRNA指導rRNA位點特異的修飾snoRNAsnoRNA

C/DsnoRNAH/ACAsnoRNA指導2’-O-甲基化指導假尿苷酸化

真核生物tRNA前體的加工真核生物tRNA的加工與原核生物類似，只是真核生物tRNA3’端的CCA都是后加的。真核生物mRNA前體的加工

mRNA的前體稱為核內(nèi)不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA），因為一個細胞中有許多種不同的mRNA，也就有許多種不同的前體。hnRNA在加工成熟的過程中有5’端加帽、3’端加尾、去除內(nèi)含子等過程。5’端加帽(m7Gppp)

大約轉(zhuǎn)錄出30個核苷酸時，在鳥苷轉(zhuǎn)移酶催化下，GTP與新生RNA鏈的5’端的三磷酸發(fā)生縮合反應(yīng)，在RNA的5’端加上G殘基的帽子，在帽子上再進行甲基化，通常甲基化的位點是堿基上的7位，核糖的2’位也可以甲基化。帽子結(jié)構(gòu)將在其后的翻譯中發(fā)揮重要作用；另一個作用可能是保護新生的RNA，避免其在合成過程中被降解。mRNA5’端的帽子結(jié)構(gòu)存在于所有類型帽子中在Ⅰ類型帽子中，此位點也可被甲基化G通過5’－5’鍵加入存在于Ⅰ類型帽子中存在于Ⅱ類型帽子中初級轉(zhuǎn)錄物3’端加多聚腺苷酸尾真核生物mRNA的3’端通常都有20～200個腺苷酸，但也有例外，如組蛋白、呼腸孤病毒和不少植物病毒的mRNA沒有多聚腺苷酸尾。加尾過程是在細胞核內(nèi)完成的，通過多聚腺苷酸聚合酶催化反應(yīng)完成。

polyA尾的存在可以提高mRNA的穩(wěn)定性。（三）RNA的拼接、編輯和再編碼大多數(shù)真核基因都是斷裂基因，但也有少數(shù)編碼蛋白質(zhì)的基以及一些tRNA和rRNA基因是連續(xù)的。斷裂基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物須通過拼接，去除插入部分（intron，內(nèi)含子）使保留部分（exon，外顯子）成為連續(xù)序列。典型的真核生物基因結(jié)構(gòu)各種RNA前體的剪接類型Ⅰ類型Ⅱ核mRNA的核tRNA的自我剪接自我剪接剪接體剪接酶促剪接各種剪接類型的分布類型Ⅰ自我剪接的內(nèi)含子分布很廣，存在于真核生物的線粒體和葉綠體基因、低等真核生物核的rRNA基因、細菌和噬菌體的個別基因中。

類型Ⅱ內(nèi)含子也具有自我催化功能，它與類型Ⅰ內(nèi)含子自我剪接的差別在于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無需游離鳥苷酸（或鳥苷）發(fā)動。類型Ⅱ內(nèi)含子只見于某些真菌線粒體和植物葉綠體基因。有些Ⅰ和Ⅱ型內(nèi)含子中也編碼有核酸內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或成熟酶等。反式剪接反式剪接是分子間剪接，從兩個不同的轉(zhuǎn)錄本中各取一段連接起來。存在于錐蟲的從多mRNA,其5’端有一共同的35個核苷酸長的前導序列。該前導序列來自一些重復單位的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中剪下前導序列再連接到其他mRNA的5’端。反式剪接示意圖選擇性剪接一個基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，通過不同的剪接方式，可以產(chǎn)生不同的mRNA，從而翻譯出不同的蛋白質(zhì)。一個基因轉(zhuǎn)錄本通過選擇性剪接產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)稱為同源體（isoform）。選擇性剪接示意圖RNA編輯

RNA編輯是指修飾或輕微改變mRNA的核苷酸序列，使它們與對應(yīng)的模板DNA序列有所不同的預定過程。迄今發(fā)現(xiàn)真核生物線粒體中存在的RNA編輯類型有：核苷酸的轉(zhuǎn)錄后插入和缺失；轉(zhuǎn)錄物在C轉(zhuǎn)換成U時創(chuàng)造終止密碼子UAA；堿基間的轉(zhuǎn)換。

常見的RNA編輯是C→U的轉(zhuǎn)換。RNA編輯的發(fā)現(xiàn)

1986年BenneR等在研究錐蟲線粒體DNA時發(fā)現(xiàn)，其細胞色素氧化酶亞基Ⅱ（coⅡ）基因與酵母或人的相應(yīng)基因?qū)Ρ却嬖谝粋€-1的移碼突變，然而酶的功能又是正常的。進一步比較coⅡ基因與其轉(zhuǎn)錄物的序列，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物在移碼突變位點附近有4個不被基因DNA編碼的額外尿苷酸，正好糾正了基因的移碼突變。由于影響分子雜交技術(shù)在線粒體內(nèi)找不到第二個coⅡ基因，所以認為這些尿苷酸是在轉(zhuǎn)錄中或轉(zhuǎn)錄后插進去的。錐蟲coⅡ基因與其表達產(chǎn)物的序列比較DNA正鏈序列GA

GAAmRNA序列

GAUUGUAUA

蛋白質(zhì)序列AspCysIleRNA編輯的生物學意義可以糾正基因突變造成的損害增加基因產(chǎn)物的多樣性與生物發(fā)育和分化有關(guān)有利于生物進化RNA的降解

RNA降解是涉及基因表達的一個重要環(huán)節(jié)。rRNA和tRNA是穩(wěn)定的RNA,其更新率較低。mRNA是不穩(wěn)定的RNA,其更新率非常高。

細胞內(nèi)有各種能夠降解RNA的酶，如5’→3’外切核酸酶、3’→5’外切核酸酶、核酸內(nèi)切酶等。

不同的RNA其穩(wěn)定性不同，穩(wěn)定性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，mRNA的5’帽子、polyA尾、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等都有穩(wěn)定RNA的作用。三、在RNA指導下RNA和DNA的合成（一）RNA的復