衛(wèi)生微生物檢測方法

衛(wèi)生微生物檢測方法2第一節(jié)

衛(wèi)生微生物學(xué)檢測的特點(diǎn)與基本原則檢測特點(diǎn)：檢測對象：致病、非致病、條件致病微生物標(biāo)本來源：人體、環(huán)境環(huán)境中致病微生物數(shù)量少，需要特異的檢測方法，并且多依靠衛(wèi)生指示微生物檢測原則：樣品的采集原則樣品的運(yùn)送原則實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則3一、樣品的采集原則（一）樣品必須要有代表性:采樣量：滿足檢測要求采樣部位：均勻采樣采樣時間：便于分析微生物的動態(tài)變化采樣批號：盡量檢測每個批號4（二）避免對樣品的污染器材滅菌、無菌操作（三）避免對樣品中微生物的殺滅和抑制避免有毒物質(zhì)的殘留和高溫影響（四）對樣品進(jìn)行詳細(xì)的標(biāo)記這是基本要求（1）所有盛樣容器必須有和樣品一致的標(biāo)記。在標(biāo)記上應(yīng)記明產(chǎn)品標(biāo)志與號碼和樣品順序號以及其他需要說明的情況。標(biāo)記應(yīng)牢固，具防水性，字跡不會被擦掉或脫色。（2）當(dāng)樣品需要托運(yùn)或由非專職抽樣人員運(yùn)送時，必須封識樣品容器。5二、樣品的運(yùn)送原則盡快送檢一般3-4h內(nèi)送檢，減少細(xì)菌死亡和進(jìn)一步繁殖帶來的影響。如不能及時運(yùn)送，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)采取常溫冷暗、0-4℃冰箱、-15℃以下冰箱或冷藏庫內(nèi)保存。注意保護(hù)待檢的微生物一定的溫度加保護(hù)劑或去除不利因素運(yùn)送培養(yǎng)基（運(yùn)輸緩沖液）：如病毒、厭氧菌等6根據(jù)生物安全規(guī)定，妥善包裝待運(yùn)輸?shù)臉?biāo)本進(jìn)行完善的樣品交接必須有樣品送檢單，與實(shí)驗(yàn)室人員逐項(xiàng)核對后交接7三、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則

1.具有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室硬件設(shè)施

WHO對微生物危害性的分級

生物安全等級（biosafetylevel,BSL）BSL-1（P1實(shí)驗(yàn)室）：檢驗(yàn)非致病微生物。BSL-2（P2實(shí)驗(yàn)室）：檢驗(yàn)一般致病微生物。BSL-3（P3實(shí)驗(yàn)室）：可檢驗(yàn)特殊危險致病微生物。BSL-4（P4實(shí)驗(yàn)室）：可檢驗(yàn)危害性最嚴(yán)重的病原體。世衛(wèi)組織感染性微生物的危險度等級分類危險度等級一級無或極低的個體和群體危險不太可能引起人或動物致病的微生物危險度等級二級個體危險中等，群體危險低病原體能引起人或動物的疾病，但不太可能對實(shí)驗(yàn)室工作人員、社區(qū)、牲畜或環(huán)境造成嚴(yán)重危害。實(shí)驗(yàn)室暴露也許會引起嚴(yán)重感染，但是對感染有有效的預(yù)防和治療措施感染傳播的危險有限世衛(wèi)組織感染性微生物的危險度等級分類危險度等級三級個體危險高，群體危險低病原體通常能引起人或動物的嚴(yán)重疾病，但一般不會發(fā)生感染個體向其他個體的傳播對感染有有效的預(yù)防和治療措施危險度等級四級個體和群體的危險均高病原體通常能引起人或動物的嚴(yán)重疾病，并且很容易發(fā)生個體之間的直接或間接傳播一般沒有有效的預(yù)防和治療措施BSL-1不太可能引起人類疾病或獸醫(yī)學(xué)意義的無疾病安全措施：參照標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)安全操作（=標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防措施）。預(yù)期的安全設(shè)備：不需要，所以也不需要生物安全柜實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求：需要開放實(shí)驗(yàn)臺和水槽。BSL-2對群體中出現(xiàn)的中等危險和人類疾病有關(guān)系的的微生物。危險性在于皮膚損傷、攝食、黏膜暴露。這一防護(hù)級別代表的微生物為：金黃色葡萄球菌、沙門菌、輪狀病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒等。安全措施：參照一級生物安全實(shí)驗(yàn)室操作，+進(jìn)入受限生物危害警告標(biāo)志“銳器”防范措施清除污染生物安全手冊預(yù)期的安全設(shè)備：在操作產(chǎn)生噴濺或氣溶膠的感染微生物時，使用驗(yàn)收過的物理防護(hù)設(shè)備，如I級或II級生物安全柜。BSL-2PPE（個體防護(hù)裝備）：根據(jù)需要穿戴實(shí)驗(yàn)室大褂、手套和面部保護(hù)用具。實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求：需要開放實(shí)驗(yàn)臺、水槽和高壓滅菌器。BSL-2高壓滅菌器洗眼器BSL-2對本地或外來的呼吸傳播微生物（氣溶膠）以及可能引起嚴(yán)重的或潛在致命感染的微生物。這一防護(hù)級別代表的微生物為：結(jié)核桿菌、炭疽桿菌、霍亂弧菌、高致病性禽流感病毒、黃熱病病毒、艾滋病病毒等。重視環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室人員的保護(hù)屏障。BSL-3安全措施：參照二級生物安全實(shí)驗(yàn)室操作，+進(jìn)入控制全部廢棄物均清除污染實(shí)驗(yàn)室服裝在洗熨前須清除污染免疫血清基線預(yù)期的安全設(shè)備：對于所有開放性微生物操作使用I級或II級生物安全柜。BSL-3PPE（個體防護(hù)裝備）：根據(jù)需要穿戴實(shí)驗(yàn)室大褂、手套和呼吸器。實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求：二級生物安全實(shí)驗(yàn)室要求+實(shí)驗(yàn)室與公共走廊通道在物理上分開門自動關(guān)閉，雙門入口排出廢氣不可再循環(huán)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)負(fù)壓BSL-3對于危險的或外來的微生物，它們是危及生命的很高個體危險，通過氣溶膠或未知傳播風(fēng)險的微生物進(jìn)行傳播，而且目前尚無疫苗或治療。這一防護(hù)級別代表的微生物為：天花病毒、埃博拉病毒。危險性在于呼吸暴露接觸到傳染性的氣溶膠、黏膜，或是暴露的損傷皮膚接觸到傳染唾沫。BSL-4安全措施：參照三級生物安全實(shí)驗(yàn)室操作，+進(jìn)入前更換衣服出口處淋浴離開實(shí)驗(yàn)室時，全部物品都要清除污染預(yù)期的安全設(shè)備：全部操作程序均在III級生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，或者穿正壓供氣的的連體防護(hù)服（Hazmat套服）并I級和II級生物安全柜。BSL-4實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求：三級生物安全實(shí)驗(yàn)室要求+獨(dú)立的建筑或明確劃分出的隔離區(qū)域?qū)Ｓ眠M(jìn)排氣、真空和清除污染系統(tǒng)安全文件明確規(guī)定的其他附加要求重點(diǎn)防止活性微生物污染環(huán)境BSL-4微生物危險度等級與生物安全水平、操作和設(shè)備的關(guān)系危險度等級生物安全水平實(shí)驗(yàn)室類型實(shí)驗(yàn)室操作安全設(shè)施1基礎(chǔ)–一級生物安全水平基礎(chǔ)的教學(xué)、研究GMT不需要；開放實(shí)驗(yàn)臺2基礎(chǔ)–二級生物安全水平初級衛(wèi)生服務(wù)；診斷、研究GMT+加防護(hù)服、生物危害標(biāo)志開放實(shí)驗(yàn)臺，此外需生物安全柜用于防護(hù)可能生成的氣溶膠GMT=微生物學(xué)操作技術(shù)規(guī)范微生物危險度等級與生物安全水平、操作和設(shè)備的關(guān)系危險度等級生物安全水平實(shí)驗(yàn)室類型實(shí)驗(yàn)室操作安全設(shè)施3防護(hù)–三級生物安全水平特殊的診斷、研究在二級生物安全防護(hù)水平上增加特殊防護(hù)服、進(jìn)入制度、定向氣流生物安全柜和／或其他所有實(shí)驗(yàn)室工作所需要的基本設(shè)備4最高防護(hù)–四級生物安全水平危險病原體在三級生物安全防護(hù)水平上增加氣鎖入口、出口淋浴、污染物品的特殊處理Ⅲ級生物安全柜或Ⅱ級生物安全柜并穿著正壓防護(hù)服、雙開高壓滅菌器（穿過墻體）、經(jīng)過濾的空氣232.具有合格的人員和標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法人員要有資質(zhì)，并經(jīng)常接受培訓(xùn)采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法或公認(rèn)方法（WHO、EPA等）3.加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制儀器、設(shè)備、試劑：定期檢定和校準(zhǔn)注意記錄和核查：如GLP實(shí)驗(yàn)室報告規(guī)范：數(shù)據(jù)規(guī)范，完整簽名蓋章三、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則244.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有應(yīng)急措施應(yīng)對突發(fā)事件能力需做多種檢驗(yàn)時，微生物優(yōu)先恰當(dāng)?shù)臉悠诽幚砼c檢驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則25第二節(jié)

衛(wèi)生檢驗(yàn)中的指示微生物指示微生物（indicatormicroorganism）定義：在常規(guī)衛(wèi)生監(jiān)測中，用以指示檢品衛(wèi)生狀況及安全性的（非致病）微生物（或細(xì)菌）。設(shè)定指示微生物的原因微生物（包括致病和非致病的）種類繁多，不可能一一檢測環(huán)境中致病微生物往往數(shù)量少，檢測困難，需要用相對易于檢測的微生物來間接反映。26一、指示微生物的選擇選擇原則數(shù)量大、易于檢出，方法簡單，有代表性。指示微生物的種類：反映微生物綜合污染：細(xì)菌、霉菌和酵母菌落總數(shù)反映微生物污染來源：糞便污染指示菌（大腸菌群、糞大腸菌群等）；空氣污染指示菌（溶血性鏈球菌等）不得檢出的致病微生物間接反映致病微生物：如反映腸道病毒的噬菌體等消毒效果指示菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌（壓力蒸汽滅菌）；短小芽孢桿菌（電離輻射滅菌）；枯草桿菌黑色變種芽孢（環(huán)氧乙烷滅菌）27二、常用的指示微生物（一）綜合污染指標(biāo)——菌落總數(shù)定義：單位量的被檢樣品(g、ml、cm2、

m3)內(nèi)，所含有的能在某種培養(yǎng)基上經(jīng)一定條件、一定時間培養(yǎng)后生成的菌落數(shù)量。表述：細(xì)菌菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌菌落總數(shù)。cfu/g、cfu/ml。(cfu，colonyformingunit)意義：綜合判定檢樣被微生物污染程度。方法：標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法、表面涂布法28（二）來源污染指標(biāo)——糞便、空氣污染指示菌

糞便污染指示菌的選擇標(biāo)準(zhǔn)是人及溫血動物腸道正常菌群的組成部分，且數(shù)量大。在糞便污染的樣品中易檢出，未被污染的樣品中無此菌存在。排出體外后，在外環(huán)境存活時間與腸道致病菌大致相似或稍長。在外環(huán)境中不繁殖。如作為飲用水的指示菌，對氯、臭氧等抵抗力應(yīng)不低于腸道致病菌或略強(qiáng)。檢驗(yàn)方法簡便，易于檢出和計數(shù)。29常見糞便污染指示菌1.大腸菌群（coliformgroup）概念：指一群需氧的或兼性厭氧的，在35-37℃24h培養(yǎng)能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的G-無芽孢桿菌。種類：大腸埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、沙雷菌屬、變形桿菌屬某些種等。衛(wèi)生學(xué)意義評價檢樣衛(wèi)生質(zhì)量，推斷有無腸道致病菌污染?？偞竽c菌群（totalcoliform）—37℃培養(yǎng)生長的大腸菌群。糞大腸菌群（fecalcoliform）（耐熱大腸菌群）—44-45℃能發(fā)酵乳糖的大腸菌群。方法：發(fā)酵法，濾膜法，紙片法30大腸菌群作為指示菌的一些新問題大腸菌群“受損”對細(xì)菌計數(shù)的影響大腸埃希菌的致病性大腸菌群中某些細(xì)菌可以在外界繁殖大腸菌群的檢測范圍有限水中大腸菌群>200cfu/100ml小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽性率6.4%水中大腸菌群<200cfu/100ml小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽性率8.9%312大腸埃希菌(Escherichaecoli)檢出意義最大鑒定方法較復(fù)雜藥品行業(yè)使用較多近年應(yīng)用較多作為糞便污染指示菌，大腸埃希菌檢出意義最大，其次是耐熱大腸菌群，總大腸菌群再次323.腸球菌(Enterococcus)（糞鏈球菌)人及動物腸道正常菌群。在人糞數(shù)量僅次于大腸菌群細(xì)菌，動物糞便中所占比例高。對惡劣環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，營養(yǎng)水體繁殖力低于大腸菌群。單獨(dú)檢查不能作為糞便污染的決定性指標(biāo)，但可提供有價值的補(bǔ)充材料。判斷污染來源。

方法：耐熱大腸菌群與腸球菌之比＞4.1污染來源人耐熱大腸菌群與腸球菌之比＜0.7污染來源動物耐熱大腸菌群與腸球菌之比4.1～0.7混合來源334產(chǎn)氣莢膜梭菌(Costirdia)G+有芽孢，還原亞硫酸鹽的厭氧桿菌。外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)。不適合作為主要指標(biāo)，但可提供有價值的補(bǔ)充材料。特別適合水樣不能及時送檢，或在含有有毒物質(zhì)（氯）的環(huán)境中檢測是否有過糞便污染。產(chǎn)氣莢膜梭菌（＋）大腸菌群（＋）新近污染產(chǎn)氣莢膜梭菌（＋）大腸菌群（－）陳舊污染34常見空氣污染指示菌：口腔和鼻腔的鏈球菌（無人居住的房屋空氣中沒有鏈球菌，房屋內(nèi)住人越多，鏈球菌的含量亦越高）。一般用草綠色鏈球菌與溶血性鏈球菌合起來計算。35（三）不得檢出的致病菌微生物主要危害主要指示作用沙門菌腸道致病菌口服藥、食品不得檢出志賀菌菌痢食品不得檢出金葡菌局部化膿、食物中毒食品、化妝品、外用藥不得檢出；游泳池水指標(biāo)菌銅綠假單胞菌條件致病菌外傷、眼科用藥、化妝品不得檢出，游泳池水指標(biāo)菌破傷風(fēng)梭菌外傷皮膚感染外用藥不得檢出36（四）間接反映致病微生物存在的指示菌腸道病毒指示微生物的條件：檢驗(yàn)方法簡單操作安全在被人腸道病毒污染的環(huán)境中一定存在，數(shù)量等于或大于腸道病毒的數(shù)目對于消毒劑和外環(huán)境的抵抗力應(yīng)與腸道病毒一致或稍強(qiáng)。

37腸道病毒的指示微生物

指示物優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)應(yīng)用大腸桿菌噬菌體f2與腸道病毒耐受性相似；存在于人糞中；檢測較簡便糞便中數(shù)量少；可能在環(huán)境中繁殖；檢測結(jié)果受大腸桿菌DNA噬菌體影響水中病毒消毒效果評價指標(biāo)脊髓灰質(zhì)炎病毒減毒疫苗株Ⅰ操作安全非所有糞便有；檢測困難應(yīng)用于消毒學(xué)和水中病毒研究38第三節(jié)

衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法（一）樣品的處理（二）損傷菌的復(fù)蘇（三）選擇性增菌與分離（四）定量計數(shù)方法（五）分型鑒定的方法（六）其他分子生物學(xué)方法39混勻樣品（非常重要）液體：電動混勻、手搖混勻、敲打混勻固體：攪碎混勻、研磨混勻、勻漿混勻樣品濃縮沉淀法過濾法吸附沉淀法一、樣品的處理40環(huán)境樣品微生物，在采樣送檢等過程中，受各種不利因素作用，可發(fā)生亞致死性損傷。用普通培養(yǎng)方法不容易培養(yǎng)。需預(yù)先進(jìn)行復(fù)蘇（