生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)10凝膠過濾層析3課件

實(shí)驗(yàn)十凝膠過濾柱層析純化堿性磷酸酶

一、目的要求1.學(xué)習(xí)和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)的原理與方法。2.通過凝膠過濾柱層析對(duì)堿性磷酸酶進(jìn)行純化二、原理凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離。內(nèi)水體積Vi外水體積Vo柱床體積Vt洗脫體積VeVt=Vo+Vi+VgVe=Vo+KdViKd=(Ve-Vo)/ViKd=0Kd=10<Kd<1Kd>1優(yōu)點(diǎn)：a.條件溫和b.操作簡(jiǎn)便c.損失少回收率高d.層析柱可反復(fù)使用凝膠的類型：Sephadex:交聯(lián)葡聚糖Sepharose：瓊脂糖凝膠Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝膠分子篩Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)的葡聚糖凝膠G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝膠）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范圍（肽與蛋白）D<700<1500<50001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000凝膠的處理及裝柱凝膠干粉的溶脹（熱溶脹）、浮選、抽氣、裝柱、藍(lán)色葡聚糖檢查、平衡裝柱時(shí)要注意操作壓。裝柱的兩種方法：a.手工操作1/3床體積水→加入少許凝膠積起1-2厘米凝膠床→打開出水口→連續(xù)緩慢加入凝膠b.電動(dòng)攪拌下的裝柱法

（如圖4-9）樣品上柱分析用量：柱床體積的1—2%制備用量：柱床體積的10—20%洗脫收集部分收集器、核酸蛋白檢測(cè)儀凝膠的保存方法0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰三、儀器的使用－核酸蛋白檢測(cè)儀及部分收集器的操作方法

核酸蛋白檢測(cè)儀及記錄儀操作方法1、在儀器使用前，首先檢查檢測(cè)器，電源和記錄儀三部份電路連接是否正確，插上電源插頭。2、接通記錄儀電源開關(guān)，使電源開關(guān)拔到“通”指示燈亮?？筛鶕?jù)需要調(diào)換不同的走紙速度。記錄儀量程調(diào)在10mV檔上。3、將檢測(cè)儀波長(zhǎng)旋鈕旋到所需波長(zhǎng)刻度上，把量程旋鈕拔到100％T檔。4、按下檢測(cè)儀電源箱面板上的電源開關(guān)，此時(shí)記錄儀指針從零點(diǎn)開始向右移動(dòng)某一刻度，調(diào)節(jié)“光量”旋鈕使指針停留在記錄儀大約中間位置5mV左右數(shù)字顯示為50左右。儀器開機(jī)穩(wěn)定時(shí)間大約在1小時(shí)左右，待基線平直后，可加樣測(cè)試。5、把檢測(cè)器進(jìn)樣口塑料管接到部份收集器上，使層析柱中的洗脫液通過。透光率為“0”廠家巳調(diào)好，光密度A要調(diào)零，量程開關(guān)拔到100％T，調(diào)節(jié)光量旋鈕，使記錄儀指針在10mV數(shù)字顯示為100，即透光率為100%。把量程開關(guān)拔到“A”擋，緩慢調(diào)節(jié)A調(diào)零旋鈕，使檢測(cè)儀數(shù)字顯示為“0”，同時(shí)調(diào)節(jié)記錄儀零位旋紐使記錄儀指示在"0"位。6、上述5個(gè)步驟結(jié)束后，就可以在層析柱上加樣。當(dāng)樣品經(jīng)層析柱分離，通過檢測(cè)后，就能通過記錄儀給出所需樣品吸收的圖譜。7、測(cè)試完畢，必須切斷電源，并用蒸餾水清洗樣品池和尼龍管。部分收集器的操作方法

1．將“手/自”框內(nèi)的鍵置于自動(dòng)狀態(tài)，按“定”和“停”;使定時(shí)時(shí)間為零，放開“?！卑础翱臁被颉奥?“定”仍按著)至所需的定時(shí)時(shí)間，放開"慢"和“定”，再按一下"停"設(shè)定定時(shí)時(shí)間工作就完畢。若要查看設(shè)置時(shí)間，則只需按一下“定”鍵，就能顯示上一次所設(shè)時(shí)間，若要以秒顯示走時(shí)時(shí)刻，則需按下“秒”鍵。

2．定位，將“順/逆”鍵置于“順”或“逆”狀態(tài)，按“手動(dòng)”鍵，使試管架轉(zhuǎn)至終點(diǎn)，這時(shí)報(bào)警器工作，報(bào)警指示燈亮，然后將“順/逆”鍵置于“逆”或“順”狀態(tài)，本儀器就會(huì)自動(dòng)地對(duì)準(zhǔn)第一個(gè)試管(在“順”狀態(tài)，第一臂試臂為最外的那根。在“逆”狀態(tài)，第一臂試管為最內(nèi)的那根)。如滴管口沒對(duì)準(zhǔn)第一根試管只要松開換節(jié)臂調(diào)整螺釘，使滴臂口對(duì)準(zhǔn)第一根試管即可。移液器（俗稱“槍”）的使用：四、操作方法（一）凝膠的選擇與處理1.凝膠及柱的選擇選擇SephadexG100和1.5cm×60cm的柱子。2.凝膠的處理凝膠型號(hào)選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。（四）加樣1.準(zhǔn)備好部分收集器、核酸蛋白檢測(cè)儀及記錄儀。柱出水口與核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀比色池進(jìn)液口相連，比色池出液口再與自動(dòng)部分收集器相連。核酸蛋白檢測(cè)儀的量程置于2A，記錄儀量程置于10mV，走紙速度設(shè)定0.5mm/min。2.打開柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切。沿管壁將堿性磷酸酶樣品溶液2mL小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免將柱床面凝膠沖起，打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時(shí)收集流出液，當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時(shí)，夾緊下口夾子。按加樣操作，用1mL洗脫液沖洗管壁2次。最后凝膠上方加滿洗脫液，旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通洗脫瓶。上樣和洗脫的流速為0.3mL/min左右。（五）洗脫洗脫時(shí)，打開上、下進(jìn)出口夾子，用0.01mol/LTris-HCl洗脫，用自動(dòng)部分收集器收集流出液，每管2mL。(六）堿性磷酸酶活力峰收集對(duì)部分收集器收集的洗脫液進(jìn)行堿性磷酸酶活力測(cè)定，收集堿性磷酸酶活力峰，即為經(jīng)凝膠過濾柱層析純化的洗脫液。對(duì)合并后的堿性磷酸酶活