食品衛(wèi)生微生物學檢驗

食品衛(wèi)生微生物學檢驗第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二1、總則

食品安全關系到每一個消費者的健康和利益，對國家的經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定具有重大意義。特別是近年來，伴隨著經(jīng)濟全球化的進程，全球性食品貿(mào)易的快速增長及世界各國人民的飲食習慣各有不同，因此在相互貿(mào)易中，易產(chǎn)生認識上的差異，致使國際間的貿(mào)易，常常發(fā)生摩擦。為了改善這種情況近年來世界各國政府、國際組織等積極創(chuàng)造條件，提出各種建議，進行交流，以期達到漸趨一致的目的。相關體系國際微生物學會（IAMS）國際食品微生物規(guī)格委員會(ICMSF)世界糧農(nóng)組織(FAO)美國食品藥品管理局（FDA）1范圍本標準規(guī)定了食品衛(wèi)生微生物學檢驗總則。本標準適用于各類食品樣品的采樣。第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二2、菌落總數(shù)測定

1、范圍本標準規(guī)定了食品中菌落總數(shù)的測定方法。本標準適用于各類食品中菌落總數(shù)的測定。2、規(guī)范性引用文件。第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二2、菌落總數(shù)測定3術語和定義菌落總數(shù)食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、PH、需氧性質(zhì)等）所得1ml（g）檢樣中所含菌落的總數(shù)。本方法規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在營養(yǎng)瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫需氧的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據(jù)。

cfu：colony-formingunits菌落形成單位，一個細菌在平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上生長形成肉眼可見的菌落。第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二2、菌落總數(shù)測定4、設備和材料第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二2、菌落總數(shù)測定8菌落總數(shù)測定中的一些要求和規(guī)定（1）檢驗中所用器皿滅菌前徹底洗滌干凈。（2）稀釋液可用滅菌生理鹽水、蒸餾水或磷酸鹽緩沖稀釋液。（3）樣品處理

A、液體樣品要充分混勻。含二氧化碳的酒類和飲料，要打開待氣體全部逸出后方可檢驗。酸性樣品用1mol/LNaoH,堿性樣品用1mol/LHcl調(diào)節(jié)PH7.0-7.2。

B、固體樣品，含鹽分高的食品用無鹽稀釋液，魚、肉類樣品用菌質(zhì)器研磨均勻（4）空白對照

A、樣品所用的稀釋液，每批都要有空白對照。

B、有顆粒的食品（特別是10-1的稀釋液）可同時作一塊平皿4℃環(huán)境放置，計數(shù)時用作對照。

C、做樣品的同時凈化室或凈化臺空氣暴露時間作一塊平皿對照。（5）培養(yǎng)溫度、時間樣品加入營養(yǎng)瓊脂凝固后，一定要翻轉(zhuǎn)平皿放36℃培養(yǎng)48小時，魚、蝦類水產(chǎn)品生活環(huán)境水溫較低，多采用30℃培養(yǎng)72小時。（6）菌落計數(shù)選取30-300之間作為測定標準，1個稀釋度取2個平板取平均數(shù)，如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，一條鏈為一個菌落，來源不同的幾條鏈每條為一菌落。如乳酸桿菌和酵母菌應排除不計。

(7)稀釋度的選擇a選取30-300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告b2個稀釋度都在30-300之間的視二者之比報告，比值＞2報告其中較小的數(shù)，比值≤2報告其平均數(shù)。c所有的稀釋度平均數(shù)都＜30，按稀釋度最低的報告。d所有的稀釋度均無細菌生長，結(jié)果＜1，乘以稀釋倍數(shù)報告。e如果幾個稀釋度都多不可計，按稀釋度最高的乘以稀釋倍數(shù)報告。(8)菌落數(shù)的報告（見表）

第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二大腸菌群大腸菌群測定GB/T4789.3-20031范圍2規(guī)范性引用文件3術語與定義4設備和材料5培養(yǎng)基和試劑6檢驗程序7操作步驟8大腸菌群測定中的一些要求和規(guī)定第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二大腸菌群

1、范圍本標準規(guī)定了食品中大腸菌群的測定方法。本標準適用于各類食品中大腸菌群的測定。2、規(guī)范性引用文件3、術語與定義下列術語和定義適用于本標準大腸菌群：一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以100ml(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二大腸菌群測定7操作步驟（1）樣品稀釋（2）乳糖發(fā)酵試驗（3）分離培養(yǎng)（4）證實試驗（5）結(jié)果報告第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二大腸菌群測定

8大腸菌群測定中的一些要求和規(guī)定（1）檢驗步驟（2）抑菌劑（3）挑選菌落（4）產(chǎn)氣量（5）MPN檢索表第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二大腸菌群

菌落色澤與檢出率的關系培養(yǎng)基

黑紫色有金屬光澤無金屬光澤

粉紅色粉色EMB平板30/30(100)133/153(86.9)53/95(55.8)37/69(53.6)第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二糞大腸菌群測定

定義：系指一群在44.5℃條件下能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二糞大腸菌群測定

操作程序：乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)氣→轉(zhuǎn)種EC肉湯44.5℃24±2h→產(chǎn)氣管劃線轉(zhuǎn)種EMB平皿36℃18~24h→有典型菌落者，證實為糞大腸菌群陽性。第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二大腸桿菌大腸桿菌測定1初發(fā)酵2復發(fā)酵3平板分離4營養(yǎng)瓊脂斜面5生化實驗6結(jié)果報告第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二大腸桿菌

革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動物腸道中的正常棲居菌，若在水和食品中檢出此菌，可認為是被糞便污染的指標，從而可能有腸道病原菌的存在。

第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二染色法、培養(yǎng)基和試劑細菌的染色常用染料人工合成含苯的化合物，帶有染色基團及助色基團。染色基團可使細菌著色，助色基團增加兩者之間的親和力決定染料的酸堿性。

堿性染料：結(jié)晶紫、美蘭、堿性復紅。酸性染料：伊紅、剛果紅。中性染料：姬母薩、瑞氏。第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二常用染色方法簡單染色第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二常用染色方法復合染色第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二特殊染色第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二①革蘭氏染色法：革蘭氏染色法是細菌細胞的復合染色法，由丹麥醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立的染色方法，它包括初染、媒染、脫色、復染較復雜的鑒別染色?；静襟E：涂片固定——結(jié)晶紫初染1min——碘液媒染1min——95%乙醇脫色0.5min——沙黃復染1min結(jié)果:

革蘭氏陽性菌——紫色；

革蘭氏陰性菌——紅色。第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二

影響革蘭氏染色因素操作技術因素染液的因素細菌自身因素第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二

革蘭氏染色的結(jié)果，可受許多因素影響，造成錯誤的染色反映，導致錯誤的鑒定結(jié)果。(1)操作技術因素

涂片不要過厚，應保持細菌分散均勻，固定時應避免菌體過分受熱，脫色時間應反復實踐積累經(jīng)驗，根據(jù)標本性質(zhì)而靈活掌握。一般以流下的脫色劑不帶有顏色即可。(2)染液的因素

所用染液均應防止水分蒸發(fā)而影響濃度，特別是碘液存放太久或受光的作用而形成碘酸，而失去媒染的作用，故應保存于棕色磨口滴瓶中，若發(fā)現(xiàn)碘色已淡則應棄取。脫色酒精濃度95%為好，如果濃度不夠或涂片上積水過多均可影響脫色不好。(3)細菌本身因素

注意菌齡，一般以18-24h培養(yǎng)效果較好，如細菌過于衰老或死亡，G+菌結(jié)果可呈G-菌反應。

影響革蘭氏染色因素第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基

根據(jù)各種微生物生長的需要，用人工的方法將多種營養(yǎng)物質(zhì)配合制成的一種混合營養(yǎng)料。第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二

配制培養(yǎng)基的原則

根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基，如自型微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應該）由簡單的無機物質(zhì)組成。異養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機物質(zhì)。按微生物的主要類群來說，又有細菌、放線菌、酵母菌和霉菌之分。它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同，分別稱為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基，麥芽汁培養(yǎng)基等。第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二營養(yǎng)物質(zhì)的濃度與配比

營養(yǎng)物的濃度：在一般情況下，濃度合適的營養(yǎng)物質(zhì)才對微生物表現(xiàn)出良好作用，濃度大時對微生物生長起抑制作用，濃度小時不能滿足微生物生長的需要。各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度比：培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度比直接影響微生物的生長與繁殖和（或）代謝產(chǎn)物的形成與積累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培養(yǎng)基中元素碳與元素氮的比值，有時也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白兩種成分含量之比）的影響更為明顯。例如在微生物的谷氨酸發(fā)酵中，培養(yǎng)基的C／N為4：l時，菌體大量繁殖，谷氨酸積累少；當C／N為3：1時，菌體繁殖受到抑制，而谷氨酸大量增加。第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二控制培養(yǎng)基的PH值各類微生物生長的最適pH各不相同，細菌與放線菌生長的pH在7—7.5之間，酵母菌與霉菌生長的pH值在4-5之間。在微生物的生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，常會改變培養(yǎng)基的pH值，為了維持培養(yǎng)基pH值的相對恒定，通常采用下列兩種方式：內(nèi)源調(diào)節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。外源調(diào)節(jié)：按實際需要加酸或加堿。第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基的種類按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類按培養(yǎng)基的功能分類按培養(yǎng)基的組成成分分類第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基的物理狀態(tài)

液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基不含任何凝固劑，它常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)以及在實驗室進行微生物生理代謝等基本理論的研究工作。半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2-0.7％的瓊脂構(gòu)成的培養(yǎng)基。常用來觀察細菌運動的特征，以進行菌種鑒定和噬菌體效價滴定等方面的實驗工作。

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入1.5-2.0%的凝固劑制成的呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。常用于微生物的分離、純化、計數(shù)等方面的研究?？蒲信c生產(chǎn)中常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠三種，除在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑之外，一些由天然的固體基質(zhì)制成的培養(yǎng)基也屬于固體培養(yǎng)基第28頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基的用途及功能1、基礎培養(yǎng)基:含有細菌生長的基本營養(yǎng)成分，碳源、氮源及生長素，最常用的是肉浸液。

2、營養(yǎng)培養(yǎng)基：營養(yǎng)培養(yǎng)基是指在基礎培養(yǎng)基里加過葡萄糖、血液和生長因子等一些特殊成分，常用是血瓊脂平板。3、鑒別培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入特定的作用底物指示劑，利用細菌分解糖類和蛋白質(zhì)的能力及代謝產(chǎn)物的不同來鑒別細菌。4、選擇培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)及抗生素，抑制一些細菌生長，有助于需要的細菌種類的生長。5、特殊培養(yǎng)基：包括厭氧菌培養(yǎng)和細菌L型培養(yǎng)，加入合適的營養(yǎng)成分及還原劑等。第29頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基組成成分

合成培養(yǎng)基：由化學成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基，該類培養(yǎng)基的組成成分精確、重復性強，但微生物生長較慢，且價格昂貴，故一般適于在實驗室范圍內(nèi)，研究生物營養(yǎng)需要、代謝、分類鑒定、生物測定以及菌種選育、遺傳分析等方面的研究工作。天然培養(yǎng)基：利用化學成分還不清楚或化學成分不恒定的天然有機物質(zhì)(豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等）制成的培養(yǎng)基，天然培養(yǎng)基比較經(jīng)濟，除實驗室經(jīng)常使用外，更適宜于在生產(chǎn)上用來大規(guī)模地培養(yǎng)微生物和生產(chǎn)微生物產(chǎn)品。第30頁，共31頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基的基本成分1、1，營養(yǎng)物質(zhì)（1）蛋白胨氮源，是動物或植物的蛋白質(zhì)（2）肉浸液