細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)介紹

/細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性概述細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)是機(jī)體新陳代謝與基本生命特征之一。在低等生物中，原始細(xì)胞通過(guò)變形和偽足活動(dòng)趨近食物和遠(yuǎn)離傷害。在高級(jí)生物體的生命活動(dòng)中,細(xì)胞的定向遷移與胚胎形成、神經(jīng)發(fā)育、免疫應(yīng)答、器官成熟等密切相關(guān)。人類的許多重大疾病及其治療，如腫瘤轉(zhuǎn)移，神經(jīng)修復(fù)、干細(xì)胞功能再生等等都與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)息息相關(guān)。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)依賴于細(xì)胞骨架（Ｃｙｔoskeleｔon)，細(xì)胞骨架除了承擔(dān)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸之外，也是構(gòu)成細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的物質(zhì)基礎(chǔ)，例如肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)偽足中最主要的結(jié)構(gòu)單位。當(dāng)細(xì)胞感受到外界的刺激信息（如食物信號(hào)等）,會(huì)伸出扁平的片層偽足，通過(guò)其前沿的不斷延展和基部的收縮,以及細(xì)胞與支撐物之間的吸附、解吸附的動(dòng)態(tài)循環(huán),朝向刺激源運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)還具有粘附性（Adhｅｓiｏｎ）與趨向性（Polarｉzaｔｉｏｎ）的特點(diǎn)，不同的粘附因子與細(xì)胞外基質(zhì)(ExtracｅllｕlarＭatrix）相互作用一方面決定了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的分子信號(hào)調(diào)控，同時(shí)與大量的趨化因子共同決定了不同細(xì)胞的特定組織轉(zhuǎn)移與偏好。圖1：細(xì)胞的定向遷移運(yùn)動(dòng)圖2：細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性與細(xì)胞骨架蛋白圖3:神經(jīng)干細(xì)胞分化與神經(jīng)元的定向遷移圖4:原生癌細(xì)胞的遷移與侵襲圖５:一個(gè)正在穿孔的腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)圖6：惡性黑色素瘤細(xì)胞侵入機(jī)體正常組織圖7：上皮細(xì)胞在傷口部位增殖，運(yùn)動(dòng)遷移,進(jìn)行組織修復(fù)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性常用檢測(cè)方法細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性研究在發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、癌癥與干細(xì)胞生物學(xué)等諸多前沿科學(xué)領(lǐng)域具有重大研究意義.然而長(zhǎng)期以來(lái)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，目前常規(guī)可用于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性評(píng)估的主要方法有：基于顯微鏡的形態(tài)觀察（含熒光標(biāo)記）、體外組織移植、細(xì)胞集落劃痕和BｏydenChaｍｂer法,這些方法各有千秋，但都無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)細(xì)胞定向遷移、癌細(xì)胞侵襲性以及細(xì)胞粘附性等，最近羅氏公司推出的基于BoyｄenChａmber原理的微電子細(xì)胞芯片檢測(cè)技術(shù)（xCELLｉgence)實(shí)現(xiàn)了定量、動(dòng)態(tài)、無(wú)標(biāo)記對(duì)于大規(guī)模細(xì)胞遷移、侵襲、粘附性的檢測(cè)，同時(shí)還可同步檢測(cè)包括細(xì)胞增殖、凋亡等多項(xiàng)細(xì)胞生理學(xué)功能.基于顯微鏡的形態(tài)觀察(可免疫熒光標(biāo)記)基于顯微鏡直接觀察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性一般依賴活細(xì)胞工作站記錄單一細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡,如果通過(guò)染色標(biāo)記可以觀察細(xì)胞骨架的改變。該方案對(duì)顯微系統(tǒng)要求高,難以同步觀察細(xì)胞群落的整體狀態(tài)，染色侵入式標(biāo)記對(duì)細(xì)胞損傷大.活細(xì)胞工作站觀察非小細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光標(biāo)記運(yùn)動(dòng)中的細(xì)胞肺癌（Ａ549)的體外運(yùn)動(dòng)體外組織移植（可免疫熒光標(biāo)記）通過(guò)原代組織，建立短期的移植物離體培養(yǎng)，經(jīng)染色可直接觀察遷移能力。適用于少數(shù)特定組織如神經(jīng)元，應(yīng)用范圍有限，技術(shù)難度大。小鼠嗅球神經(jīng)干細(xì)胞體外移植物遷移小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞體外移植物定向遷移（無(wú)趨化因子誘導(dǎo)）（SＤF—1趨化因子定向誘導(dǎo)）細(xì)胞集落劃痕建立細(xì)胞培養(yǎng)劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察人為劃痕的愈合狀態(tài)來(lái)間接評(píng)估細(xì)胞遷移率，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，但誤差大，重復(fù)性低，干擾因素多。細(xì)胞傷痕愈合試驗(yàn)單細(xì)胞層刮出條狀“傷口”０小時(shí)，18小時(shí)后，細(xì)胞層的愈合狀況。Ｉ：誘導(dǎo)表達(dá)14-3-3蛋白的3Ｔ3細(xì)胞;U:未誘導(dǎo)表達(dá)1４—ＢoyｄenCｈaｍｂer法BoydeｎChａmbeｒ法又稱Ｔranswelｌ技術(shù)，是目前最常用的檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性方法，通過(guò)將細(xì)胞加入上孔室,在下孔室加入血清或其它趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞遷移到下室。利用染色人工計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目用于評(píng)估細(xì)胞的遷移.該方法無(wú)法滿足動(dòng)態(tài)同步監(jiān)控，人為計(jì)數(shù)誤差較大,重復(fù)率低。顯微鏡觀察遷移到微孔膜底部的細(xì)胞（染色后）基于BoyｄenChamber原理的微電子細(xì)胞芯片檢測(cè)技術(shù)(ｘＣELLｉｇenｃe—ＲTＣIＭ）xCＥＬLiｇence-ＲＴCIＭ是Ｒoche與ＡcｅaBｉo公司聯(lián)合開(kāi)發(fā)出來(lái)最新一代細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，將微電子傳感技術(shù)與BoydenＣhambeｒ原理相結(jié)合,將電子芯片植入上孔底部膜表面，從而實(shí)現(xiàn)了動(dòng)態(tài)、非標(biāo)記的實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞遷移.同理在上孔基部膜上側(cè)包被不同的基質(zhì)層，可用于檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲。該xCELLigeｎce包含６Ｘ１6的檢測(cè)孔，可同步檢測(cè)多達(dá)96組樣品，與xCELLigenc-RTCES系統(tǒng)結(jié)合還可同步檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡等多項(xiàng)細(xì)胞生理學(xué)指標(biāo)。AＢC圖:xCELLigence(RＴ－ＣIM）對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株Ａ549遷移運(yùn)動(dòng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)A:用于檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)xＣＥLLigｅncｅ(ＲT—CIM)Ｂ：基于BoydenChaｍber原理的整合細(xì)胞阻抗傳感技術(shù)的檢測(cè)板。上室板中的細(xì)胞向含趨化因子的下室板定向遷移過(guò)程中,內(nèi)置的阻抗傳感器實(shí)時(shí)紀(jì)錄細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過(guò)程。C：A549細(xì)胞的細(xì)胞遷移動(dòng)態(tài)曲線綠色:無(wú)血清誘導(dǎo)對(duì)照；紅色:血清成分誘導(dǎo)對(duì)照組表:幾種細(xì)胞運(yùn)動(dòng)檢測(cè)方法的比較運(yùn)動(dòng)形態(tài)觀察體外組織移植劃痕法BoydｅnChaｍberxCELＬigeｎce檢測(cè)原理顯微觀察組織移植、顯微觀察傷痕愈合細(xì)胞穿孔遷移細(xì)胞穿孔遷移微電子傳感檢測(cè)標(biāo)記染色可染色觀察需染色觀察無(wú)需染色觀察無(wú)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目單一或少數(shù)細(xì)胞集落細(xì)胞集落細(xì)胞集落細(xì)胞群落(數(shù)量可控）特點(diǎn)定性研究，多靜態(tài)觀察動(dòng)態(tài)觀察需活細(xì)胞工作站簡(jiǎn)單定量誤差大實(shí)驗(yàn)繁瑣組織采集技術(shù)要求高方法簡(jiǎn)易誤差大方法簡(jiǎn)易誤差大全自動(dòng)實(shí)時(shí)監(jiān)控動(dòng)態(tài)觀察非標(biāo)記、非侵入式檢測(cè)重復(fù)性高人為干擾小細(xì)胞微電子芯片檢測(cè)技術(shù)(xCELＬIigｅｎce）原理簡(jiǎn)述xCELLigeｎce細(xì)胞實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)是基于檢測(cè)電子傳感器阻抗變化以反映細(xì)胞生理狀態(tài)的新型細(xì)胞分析系統(tǒng),其系統(tǒng)的核心是把微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞貼附與生長(zhǎng)的細(xì)胞檢測(cè)板的底部或細(xì)胞浸潤(rùn)遷移板的微孔膜。微電子芯片測(cè)定的電阻抗即反映了細(xì)胞生長(zhǎng)、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態(tài)。圖：基于電子阻抗原理的高通量細(xì)胞芯片技術(shù)示意圖Ａ:細(xì)胞檢測(cè)板底部的微電子細(xì)胞傳感器用于檢測(cè)阻抗變化B：基線阻抗紀(jì)錄了檢測(cè)板加入細(xì)胞之前的狀況C:阻抗的變化放映了細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移等生理狀態(tài)細(xì)胞指數(shù)(CI)）是基于阻抗和細(xì)胞狀態(tài)（包括貼壁細(xì)胞數(shù)量和貼壁狀態(tài))之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，轉(zhuǎn)化的一個(gè)指數(shù)參數(shù)，用以定量和比較細(xì)胞的真實(shí)狀態(tài)。ＣI值具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：當(dāng)不存在細(xì)胞或者細(xì)胞沒(méi)有很好貼壁在電極上，細(xì)胞指數(shù)為零。在相同的生理?xiàng)l件下，貼附在此孔電極表面的細(xì)胞越多細(xì)胞指數(shù)越大。細(xì)胞指數(shù)可以用來(lái)定量檢測(cè)孔里存在的細(xì)胞數(shù)量.細(xì)胞狀態(tài)的變化，比如細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞貼附或者細(xì)胞生長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞指數(shù)的變化?；谖㈦娮幼杩箓鞲屑夹g(shù)的xCELLiｇence細(xì)胞實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)具有免標(biāo)記、實(shí)時(shí)、定量、自動(dòng)化等諸多優(yōu)勢(shì)。具體表現(xiàn)為:高信息量：可連續(xù)檢測(cè)生物反應(yīng)的全過(guò)程,提供大量重要的動(dòng)態(tài)反應(yīng)信息。無(wú)標(biāo)記:分析無(wú)需昂貴的標(biāo)記或報(bào)告。無(wú)創(chuàng)傷:電子檢測(cè)不會(huì)干擾細(xì)胞生長(zhǎng)和分析。高準(zhǔn)確度和精確度：定量衡量細(xì)胞生長(zhǎng)，提供高于2個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍，孔對(duì)孔ＣV通常低于５％。自動(dòng)實(shí)時(shí)檢測(cè)：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程自動(dòng)收集數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)分析,大大改善僅僅在最終點(diǎn)分析的結(jié)果。靈活性:獨(dú)特的設(shè)計(jì)允許自定義分析項(xiàng)目，提高實(shí)驗(yàn)室的效率。易操作：用戶友好的軟件，簡(jiǎn)單直接的安裝，簡(jiǎn)化培訓(xùn)和操作.系統(tǒng)整合：微孔感應(yīng)設(shè)備可與已有的滴定板設(shè)備配套使用?；罴?xì)胞品質(zhì)控制：在培養(yǎng)孔中檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)量。ｘＣELLiｇｅnce細(xì)胞實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)包括RＴ－CIM?和RT－ＣEＳ?兩個(gè)系列：細(xì)胞遷移與侵襲性監(jiān)控分析系統(tǒng)，動(dòng)態(tài)細(xì)胞高通量功能檢測(cè)系統(tǒng)細(xì)胞遷移與侵襲性監(jiān)控分析系統(tǒng)ｘCELLIigｅnce／RT-ＣIMxCELLIigｅｎce/RT-CIM的檢測(cè)板由上室板和下室板組成。上室板微孔底部具微孔膜，其下表面整合了微電子生物傳感器。下室板則作為細(xì)胞培養(yǎng)基的容器。當(dāng)上室板中的細(xì)胞通過(guò)微孔發(fā)生遷移時(shí)就可被生物傳感器檢測(cè)到。通過(guò)系統(tǒng)測(cè)量的阻抗得到的指數(shù)，反映遷移細(xì)胞的數(shù)量.圖：裝配一體的上室板和下室板以及上、下室之間的帶電極的微孔（8um)膜動(dòng)態(tài)細(xì)胞高通量功能檢測(cè)系統(tǒng)xCEＬＬIｉgｅnｃe／RT－CES圖：動(dòng)態(tài)細(xì)胞高通量功能檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)板:１６孔板，96孔板以及微孔底部金電極ｘCELＬＩｉgence應(yīng)用領(lǐng)域與已發(fā)表論文目錄細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞增殖細(xì)胞質(zhì)控化合物介導(dǎo)的細(xì)胞毒性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性細(xì)胞貼壁和伸展受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)功能性監(jiān)測(cè)GPCR信號(hào)的功能監(jiān)測(cè)IgE受體功能屏障功能病毒定量已發(fā)表的參考論文（略）應(yīng)用實(shí)例乳腺癌細(xì)胞株（MCＦ７）的遷移力動(dòng)力學(xué)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞株（MCF7)上室孔含５000個(gè)細(xì)胞/孔,無(wú)血清饑餓6小時(shí),下室孔含１0％血清。某種趨化因子不同的濃度梯度對(duì)破骨細(xì)胞遷移的影響上室孔含成骨細(xì)胞１000０個(gè)細(xì)胞/孔；底部微孔膜包被2小時(shí)，下室孔培養(yǎng)液含不同濃度的ＢMP趨化因子，無(wú)血清誘導(dǎo)。小鼠某種腫瘤細(xì)胞遷移能力Conｔrol為野生型小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞；Mｕtaｎt為某基因敲除缺陷型乳腺腫瘤細(xì)胞上室孔含乳腺腫瘤100０0個(gè)細(xì)胞／孔;底部微孔膜Fibｒoneｃtin包被２小時(shí)，下室孔培養(yǎng)液含不同濃度的BMP趨化因子,無(wú)血清誘導(dǎo)。某種細(xì)胞的分化功能檢測(cè)Contrｏl為野生型小鼠神經(jīng)干細(xì)胞;Mutanｔ為某基因敲除缺陷型神經(jīng)干細(xì)胞檢測(cè)芯片預(yù)先PDL+Ｌaminin雙層包被處理，神經(jīng)元分化2４小時(shí)后加入２%血清誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞分化。某抗腫瘤藥物抑制乳腺癌細(xì)胞（MCF７）的動(dòng)力學(xué)分析低，中，高三種濃度長(zhǎng)春瑞濱（NVB）作用于乳腺癌細(xì)胞(ＭCＦ7)的動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞增殖的動(dòng)力學(xué)圖譜指導(dǎo)天然藥物活性成分分離的運(yùn)用AnionicAnionicfractionNon-polarcationicfractionAnion-exchangecolumnANon-polar,cation(DEAEchromatography)lower3Kd(Superfiltration)HerbC.S.DAnionicfractionSerum-freefraction(DEAEchromatography)BCOver3KdfractionSerum-freefraction(Superfiltration)A：某天然藥物經(jīng)陰離子交換柱分離獲得的非極性,陽(yáng)離子混合組分與陰離子組;Ｂ,C：陰離子組分(B）與經(jīng)超濾分離的大于3KD組分（C)均不能呈現(xiàn)特征性細(xì)胞指紋圖譜；D：非極性，陽(yáng)離子混合組分與超濾小于3ＫD組分呈現(xiàn)與天然藥物類似的特征性“細(xì)胞指紋圖譜細(xì)胞增殖的動(dòng)力學(xué)圖譜預(yù)測(cè)天然藥物細(xì)胞學(xué)功能AABA:前期研究篩選的某天然藥材特征性細(xì)胞圖譜;Ｂ:抗細(xì)胞有絲分裂的6種已知小分子化合物呈現(xiàn)的特征性圖譜（即該類化合物的細(xì)胞功能標(biāo)識(shí)圖譜）技術(shù)服務(wù)服務(wù)內(nèi)容細(xì)胞趨化和遷移檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)細(xì)胞功能檢測(cè)(增殖、凋亡、粘附等）天然藥物生物活性成份篩選與功能預(yù)測(cè)與評(píng)估試驗(yàn)流程客戶提供服務(wù)要求與實(shí)驗(yàn)預(yù)約；與客戶溝通后確定試驗(yàn)方案;方案實(shí)施與實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，提供檢測(cè)報(bào)告。服務(wù)價(jià)格項(xiàng)目名稱ｘCEＬＬIgenｃe檢測(cè)系統(tǒng)項(xiàng)目?jī)?nèi)涵計(jì)價(jià)單位校外單價(jià)（元）細(xì)胞趨化與遷移動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)RTCIM細(xì)胞遷移監(jiān)測(cè)芯片、試劑和耗材16孔.次3000人工費(fèi)與數(shù)據(jù)處理１6孔。次100０儀器占用費(fèi)板.小時(shí)15４000+15＊小時(shí)數(shù)細(xì)胞生理學(xué)功能動(dòng)態(tài)檢測(cè)RTCES細(xì)胞生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)芯片、試劑和耗材16孔.次1５0０人工費(fèi)與數(shù)據(jù)處理１６孔．次50０儀器占用費(fèi)板.小時(shí)15２0０0＋15＊小時(shí)數(shù)備注腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)性動(dòng)態(tài)檢測(cè)另加收芯片預(yù)處理費(fèi)3０0元受檢樣品與細(xì)胞質(zhì)控要求客戶提供測(cè)試樣品如化合物、趨化因子、生長(zhǎng)因子、天然藥物等，并不提供測(cè)試樣品的理化性質(zhì),如質(zhì)量、濃度、分子量、溶解度等。目前可以提供已驗(yàn)證合格用于遷移、侵襲和細(xì)胞功能分析的細(xì)胞株包括:細(xì)胞名稱種類A549人非小細(xì)胞肺癌株MCＦ７人乳腺癌細(xì)胞株Helａ人宮頸癌細(xì)胞株ＨＴ108０人纖維肉瘤細(xì)胞株ＭＤＡ—MＢ-２３１人乳腺癌細(xì)胞株MDA－MB—435Ｓ人乳腺癌細(xì)胞株ＨepG2人肝