細(xì)胞生物學(xué)實驗教程：細(xì)胞運動性檢測實驗詳細(xì)介紹

/細(xì)胞運動性概述細(xì)胞的運動是機體新陳代謝與基本生命特征之一。在低等生物中，原始細(xì)胞通過變形和偽足活動趨近食物和遠(yuǎn)離傷害。在高級生物體的生命活動中,細(xì)胞的定向遷移與胚胎形成、神經(jīng)發(fā)育、免疫應(yīng)答、器官成熟等密切相關(guān)。人類的許多重大疾病及其治療，如腫瘤轉(zhuǎn)移，神經(jīng)修復(fù)、干細(xì)胞功能再生等等都與細(xì)胞運動息息相關(guān)。細(xì)胞的運動依賴于細(xì)胞骨架（Ｃｙｔoskeleｔon)，細(xì)胞骨架除了承擔(dān)胞內(nèi)的物質(zhì)運輸之外，也是構(gòu)成細(xì)胞運動性的物質(zhì)基礎(chǔ)，例如肌動蛋白是細(xì)胞運動偽足中最主要的結(jié)構(gòu)單位。當(dāng)細(xì)胞感受到外界的刺激信息（如食物信號等）,會伸出扁平的片層偽足，通過其前沿的不斷延展和基部的收縮,以及細(xì)胞與支撐物之間的吸附、解吸附的動態(tài)循環(huán),朝向刺激源運動。細(xì)胞的運動還具有粘附性（Adhｅｓiｏｎ）與趨向性（Polarｉzaｔｉｏｎ）的特點，不同的粘附因子與細(xì)胞外基質(zhì)(ExtracｅllｕlarＭatrix）相互作用一方面決定了細(xì)胞運動的分子信號調(diào)控，同時與大量的趨化因子共同決定了不同細(xì)胞的特定組織轉(zhuǎn)移與偏好。圖1：細(xì)胞的定向遷移運動圖2：細(xì)胞的運動性與細(xì)胞骨架蛋白圖3:神經(jīng)干細(xì)胞分化與神經(jīng)元的定向遷移圖4:原生癌細(xì)胞的遷移與侵襲圖５:一個正在穿孔的腫瘤細(xì)胞的運動圖6：惡性黑色素瘤細(xì)胞侵入機體正常組織圖7：上皮細(xì)胞在傷口部位增殖，運動遷移,進(jìn)行組織修復(fù)細(xì)胞運動性常用檢測方法細(xì)胞運動性研究在發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、癌癥與干細(xì)胞生物學(xué)等諸多前沿科學(xué)領(lǐng)域具有重大研究意義.然而長期以來細(xì)胞運動性檢測是一個技術(shù)難點，目前常規(guī)可用于細(xì)胞運動性評估的主要方法有：基于顯微鏡的形態(tài)觀察（含熒光標(biāo)記）、體外組織移植、細(xì)胞集落劃痕和BｏydenChaｍｂer法,這些方法各有千秋，但都無法實現(xiàn)定量檢測細(xì)胞定向遷移、癌細(xì)胞侵襲性以及細(xì)胞粘附性等，最近羅氏公司推出的基于BoyｄenChａmber原理的微電子細(xì)胞芯片檢測技術(shù)（xCELLｉgence)實現(xiàn)了定量、動態(tài)、無標(biāo)記對于大規(guī)模細(xì)胞遷移、侵襲、粘附性的檢測，同時還可同步檢測包括細(xì)胞增殖、凋亡等多項細(xì)胞生理學(xué)功能.基于顯微鏡的形態(tài)觀察(可免疫熒光標(biāo)記)基于顯微鏡直接觀察細(xì)胞運動性一般依賴活細(xì)胞工作站記錄單一細(xì)胞的運動軌跡,如果通過染色標(biāo)記可以觀察細(xì)胞骨架的改變。該方案對顯微系統(tǒng)要求高,難以同步觀察細(xì)胞群落的整體狀態(tài)，染色侵入式標(biāo)記對細(xì)胞損傷大.活細(xì)胞工作站觀察非小細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光標(biāo)記運動中的細(xì)胞肺癌（Ａ549)的體外運動體外組織移植（可免疫熒光標(biāo)記）通過原代組織，建立短期的移植物離體培養(yǎng)，經(jīng)染色可直接觀察遷移能力。適用于少數(shù)特定組織如神經(jīng)元，應(yīng)用范圍有限，技術(shù)難度大。小鼠嗅球神經(jīng)干細(xì)胞體外移植物遷移小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞體外移植物定向遷移（無趨化因子誘導(dǎo)）（SＤF—1趨化因子定向誘導(dǎo)）細(xì)胞集落劃痕建立細(xì)胞培養(yǎng)劃痕實驗，觀察人為劃痕的愈合狀態(tài)來間接評估細(xì)胞遷移率，實驗簡單，但誤差大，重復(fù)性低，干擾因素多。細(xì)胞傷痕愈合試驗單細(xì)胞層刮出條狀“傷口”０小時，18小時后，細(xì)胞層的愈合狀況。Ｉ：誘導(dǎo)表達(dá)14-3-3蛋白的3Ｔ3細(xì)胞;U:未誘導(dǎo)表達(dá)1４—ＢoyｄenCｈaｍｂer法BoydeｎChａmbeｒ法又稱Ｔranswelｌ技術(shù)，是目前最常用的檢測細(xì)胞運動性方法，通過將細(xì)胞加入上孔室,在下孔室加入血清或其它趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞遷移到下室。利用染色人工計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目用于評估細(xì)胞的遷移.該方法無法滿足動態(tài)同步監(jiān)控，人為計數(shù)誤差較大,重復(fù)率低。顯微鏡觀察遷移到微孔膜底部的細(xì)胞（染色后）基于BoyｄenChamber原理的微電子細(xì)胞芯片檢測技術(shù)(ｘＣELLｉｇenｃe—ＲTＣIＭ）xCＥＬLiｇence-ＲＴCIＭ是Ｒoche與ＡcｅaBｉo公司聯(lián)合開發(fā)出來最新一代細(xì)胞檢測技術(shù)，將微電子傳感技術(shù)與BoydenＣhambeｒ原理相結(jié)合,將電子芯片植入上孔底部膜表面，從而實現(xiàn)了動態(tài)、非標(biāo)記的實時監(jiān)控細(xì)胞遷移.同理在上孔基部膜上側(cè)包被不同的基質(zhì)層，可用于檢測癌細(xì)胞侵襲。該xCELLigeｎce包含６Ｘ１6的檢測孔，可同步檢測多達(dá)96組樣品，與xCELLigenc-RTCES系統(tǒng)結(jié)合還可同步檢測細(xì)胞增殖、凋亡等多項細(xì)胞生理學(xué)指標(biāo)。AＢC圖:xCELLigence(RＴ－ＣIM）對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株Ａ549遷移運動的實時監(jiān)測A:用于檢測細(xì)胞遷移與侵襲的實時細(xì)胞分析系統(tǒng)xＣＥLLigｅncｅ(ＲT—CIM)Ｂ：基于BoydenChaｍber原理的整合細(xì)胞阻抗傳感技術(shù)的檢測板。上室板中的細(xì)胞向含趨化因子的下室板定向遷移過程中,內(nèi)置的阻抗傳感器實時紀(jì)錄細(xì)胞的運動過程。C：A549細(xì)胞的細(xì)胞遷移動態(tài)曲線綠色:無血清誘導(dǎo)對照；紅色:血清成分誘導(dǎo)對照組表:幾種細(xì)胞運動檢測方法的比較運動形態(tài)觀察體外組織移植劃痕法BoydｅnChaｍberxCELＬigeｎce檢測原理顯微觀察組織移植、顯微觀察傷痕愈合細(xì)胞穿孔遷移細(xì)胞穿孔遷移微電子傳感檢測標(biāo)記染色可染色觀察需染色觀察無需染色觀察無檢測細(xì)胞數(shù)目單一或少數(shù)細(xì)胞集落細(xì)胞集落細(xì)胞集落細(xì)胞群落(數(shù)量可控）特點定性研究，多靜態(tài)觀察動態(tài)觀察需活細(xì)胞工作站簡單定量誤差大實驗繁瑣組織采集技術(shù)要求高方法簡易誤差大方法簡易誤差大全自動實時監(jiān)控動態(tài)觀察非標(biāo)記、非侵入式檢測重復(fù)性高人為干擾小細(xì)胞微電子芯片檢測技術(shù)(xCELＬIigｅｎce）原理簡述xCELLigeｎce細(xì)胞實時分析系統(tǒng)是基于檢測電子傳感器阻抗變化以反映細(xì)胞生理狀態(tài)的新型細(xì)胞分析系統(tǒng),其系統(tǒng)的核心是把微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞貼附與生長的細(xì)胞檢測板的底部或細(xì)胞浸潤遷移板的微孔膜。微電子芯片測定的電阻抗即反映了細(xì)胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態(tài)。圖：基于電子阻抗原理的高通量細(xì)胞芯片技術(shù)示意圖Ａ:細(xì)胞檢測板底部的微電子細(xì)胞傳感器用于檢測阻抗變化B：基線阻抗紀(jì)錄了檢測板加入細(xì)胞之前的狀況C:阻抗的變化放映了細(xì)胞生長、增殖、遷移等生理狀態(tài)細(xì)胞指數(shù)(CI)）是基于阻抗和細(xì)胞狀態(tài)（包括貼壁細(xì)胞數(shù)量和貼壁狀態(tài))之間的對應(yīng)關(guān)系，轉(zhuǎn)化的一個指數(shù)參數(shù)，用以定量和比較細(xì)胞的真實狀態(tài)。ＣI值具有以下幾個特點：當(dāng)不存在細(xì)胞或者細(xì)胞沒有很好貼壁在電極上，細(xì)胞指數(shù)為零。在相同的生理條件下，貼附在此孔電極表面的細(xì)胞越多細(xì)胞指數(shù)越大。細(xì)胞指數(shù)可以用來定量檢測孔里存在的細(xì)胞數(shù)量.細(xì)胞狀態(tài)的變化，比如細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞貼附或者細(xì)胞生長都會導(dǎo)致細(xì)胞指數(shù)的變化。基于微電子阻抗傳感技術(shù)的xCELLiｇence細(xì)胞實時分析系統(tǒng)具有免標(biāo)記、實時、定量、自動化等諸多優(yōu)勢。具體表現(xiàn)為:高信息量：可連續(xù)檢測生物反應(yīng)的全過程,提供大量重要的動態(tài)反應(yīng)信息。無標(biāo)記:分析無需昂貴的標(biāo)記或報告。無創(chuàng)傷:電子檢測不會干擾細(xì)胞生長和分析。高準(zhǔn)確度和精確度：定量衡量細(xì)胞生長，提供高于2個數(shù)量級的動態(tài)范圍，孔對孔ＣV通常低于５％。自動實時檢測：整個實驗過程自動收集數(shù)據(jù)，實時分析,大大改善僅僅在最終點分析的結(jié)果。靈活性:獨特的設(shè)計允許自定義分析項目，提高實驗室的效率。易操作：用戶友好的軟件，簡單直接的安裝，簡化培訓(xùn)和操作.系統(tǒng)整合：微孔感應(yīng)設(shè)備可與已有的滴定板設(shè)備配套使用?；罴?xì)胞品質(zhì)控制：在培養(yǎng)孔中檢測細(xì)胞質(zhì)量。ｘＣELLiｇｅnce細(xì)胞實時分析系統(tǒng)包括RＴ－CIM?和RT－ＣEＳ?兩個系列：細(xì)胞遷移與侵襲性監(jiān)控分析系統(tǒng)，動態(tài)細(xì)胞高通量功能檢測系統(tǒng)細(xì)胞遷移與侵襲性監(jiān)控分析系統(tǒng)ｘCELLIigｅnce／RT-ＣIMxCELLIigｅｎce/RT-CIM的檢測板由上室板和下室板組成。上室板微孔底部具微孔膜，其下表面整合了微電子生物傳感器。下室板則作為細(xì)胞培養(yǎng)基的容器。當(dāng)上室板中的細(xì)胞通過微孔發(fā)生遷移時就可被生物傳感器檢測到。通過系統(tǒng)測量的阻抗得到的指數(shù)，反映遷移細(xì)胞的數(shù)量.圖：裝配一體的上室板和下室板以及上、下室之間的帶電極的微孔（8um)膜動態(tài)細(xì)胞高通量功能檢測系統(tǒng)xCEＬＬIｉgｅnｃe／RT－CES圖：動態(tài)細(xì)胞高通量功能檢測系統(tǒng)的檢測板:１６孔板，96孔板以及微孔底部金電極ｘCELＬＩｉgence應(yīng)用領(lǐng)域與已發(fā)表論文目錄細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞增殖細(xì)胞質(zhì)控化合物介導(dǎo)的細(xì)胞毒性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性細(xì)胞貼壁和伸展受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)功能性監(jiān)測GPCR信號的功能監(jiān)測IgE受體功能屏障功能病毒定量已發(fā)表的參考論文（略）應(yīng)用實例乳腺癌細(xì)胞株（MCＦ７）的遷移力動力學(xué)檢測乳腺癌細(xì)胞株（MCF7)上室孔含５000個細(xì)胞/孔,無血清饑餓6小時,下室孔含１0％血清。某種趨化因子不同的濃度梯度對破骨細(xì)胞遷移的影響上室孔含成骨細(xì)胞１000０個細(xì)胞/孔；底部微孔膜包被2小時，下室孔培養(yǎng)液含不同濃度的ＢMP趨化因子，無血清誘導(dǎo)。小鼠某種腫瘤細(xì)胞遷移能力Conｔrol為野生型小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞；Mｕtaｎt為某基因敲除缺陷型乳腺腫瘤細(xì)胞上室孔含乳腺腫瘤100０0個細(xì)胞／孔;底部微孔膜Fibｒoneｃtin包被２小時，下室孔培養(yǎng)液含不同濃度的BMP趨化因子,無血清誘導(dǎo)。某種細(xì)胞的分化功能檢測Contrｏl為野生型小鼠神經(jīng)干細(xì)胞;Mutanｔ為某基因敲除缺陷型神經(jīng)干細(xì)胞檢測芯片預(yù)先PDL+Ｌaminin雙層包被處理，神經(jīng)元分化2４小時后加入２%血清誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞分化。某抗腫瘤藥物抑制乳腺癌細(xì)胞（MCF７）的動力學(xué)分析低，中，高三種濃度長春瑞濱（NVB）作用于乳腺癌細(xì)胞(ＭCＦ7)的動力學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞增殖的動力學(xué)圖譜指導(dǎo)天然藥物活性成分分離的運用AnionicAnionicfractionNon-polarcationicfractionAnion-exchangecolumnANon-polar,cation(DEAEchromatography)lower3Kd(Superfiltration)HerbC.S.DAnionicfractionSerum-freefraction(DEAEchromatography)BCOver3KdfractionSerum-freefraction(Superfiltration)A：某天然藥物經(jīng)陰離子交換柱分離獲得的非極性,陽離子混合組分與陰離子組;Ｂ,C：陰離子組分(B）與經(jīng)超濾分離的大于3KD組分（C)均不能呈現(xiàn)特征性細(xì)胞指紋圖譜；D：非極性，陽離子混合組分與超濾小于3ＫD組分呈現(xiàn)與天然藥物類似的特征性“細(xì)胞指紋圖譜細(xì)胞增殖的動力學(xué)圖譜預(yù)測天然藥物細(xì)胞學(xué)功能AABA:前期研究篩選的某天然藥材特征性細(xì)胞圖譜;Ｂ:抗細(xì)胞有絲分裂的6種已知小分子化合物呈現(xiàn)的特征性圖譜（即該類化合物的細(xì)胞功能標(biāo)識圖譜）技術(shù)服務(wù)服務(wù)內(nèi)容細(xì)胞趨化和遷移檢測腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選實時動態(tài)細(xì)胞功能檢測(增殖、凋亡、粘附等）天然藥物生物活性成份篩選與功能預(yù)測與評估試驗流程客戶提供服務(wù)要求與實驗預(yù)約；與客戶溝通后確定試驗方案;方案實施與實驗操作實驗結(jié)果分析，提供檢測報告。服務(wù)價格項目名稱ｘCEＬＬIgenｃe檢測系統(tǒng)項目內(nèi)涵計價單位校外單價（元）細(xì)胞趨化與遷移動態(tài)監(jiān)測RTCIM細(xì)胞遷移監(jiān)測芯片、試劑和耗材16孔.次3000人工費與數(shù)據(jù)處理１6孔。次100０儀器占用費板.小時15４000+15＊小時數(shù)細(xì)胞生理學(xué)功能動態(tài)檢測RTCES細(xì)胞生長監(jiān)測芯片、試劑和耗材16孔.次1５0０人工費與數(shù)據(jù)處理１６孔．次50０儀器占用費板.小時15２0０0＋15＊小時數(shù)備注腫瘤細(xì)胞浸潤性動態(tài)檢測另加收芯片預(yù)處理費3０0元受檢樣品與細(xì)胞質(zhì)控要求客戶提供測試樣品如化合物、趨化因子、生長因子、天然藥物等，并不提供測試樣品的理化性質(zhì),如質(zhì)量、濃度、分子量、溶解度等。目前可以提供已驗證合格用于遷移、侵襲和細(xì)胞功能分析的細(xì)胞株包括:細(xì)胞名稱種類A549人非小細(xì)胞肺癌株MCＦ７人乳腺癌細(xì)胞株Helａ人宮頸癌細(xì)胞株ＨＴ108０人纖維肉瘤細(xì)胞株ＭＤＡ—MＢ-２３１人乳腺癌細(xì)胞株MDA－MB—435Ｓ人乳腺癌細(xì)胞株ＨepG2人肝