外周血DNA的提取

外周血DNA的提取試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)掌握人全血DNA提取原理和操作步驟。了解DNA基本理化性質(zhì)。3.初步了解DNA瓊脂糖電泳判定方法。外周血DNA的提取2/15試驗(yàn)原理1確保DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)完整性；2其它生物分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類等分子污染應(yīng)盡可能降低到最低；3盡可能去除對(duì)后續(xù)分子試驗(yàn)有抑制作用有機(jī)溶劑和重金屬離子；4其它核酸分子RNA，應(yīng)依據(jù)實(shí)際需要處理。DNA提取總標(biāo)準(zhǔn)外周血DNA的提取3/15試驗(yàn)原理理論上全部真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、病毒等都能夠提取DNA。樣本選擇取決于試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。全血是基因組提取中最常見(jiàn)樣本之一。樣本起源外周血DNA的提取4/15理化性質(zhì)核酸是由堿基、戊糖及磷酸組成生物大分子，分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）兩類。1.酸堿性核酸分子中有酸性磷酸基和堿性含氮堿基，屬于兩性化合物，不過(guò)磷酸基酸性較強(qiáng)，所以核酸總體上表現(xiàn)為酸性，帶負(fù)電荷。2.溶解度與粘度核酸是極性化合物，微溶于水，其鈉易鹽溶于水，而不溶于乙醇、苯酚、氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑。核酸是高分子化合物，粘度很大。3.紫外吸收核酸有強(qiáng)烈紫外吸收，其最大吸收峰在260nm處，常以A260表示。外周血DNA的提取5/15試驗(yàn)原理

生物大部分或幾乎全部DNA都集中在細(xì)胞核或核質(zhì)體中，人與動(dòng)物DNA主要存在于細(xì)胞核中，并與蛋白質(zhì)結(jié)合組成大小不一染色體。所以蛋白質(zhì)是DNA提取過(guò)程中常見(jiàn)污染之一，而且蛋白質(zhì)污染經(jīng)常影響到以后DNA操作過(guò)程，所以提取過(guò)程中要把蛋白質(zhì)去除。外周血DNA的提取6/15試驗(yàn)原理

本試驗(yàn)中DNA提取采取是苯酚/氯仿抽提方法?；驹砭褪潜椒印⒙确聦?duì)蛋白質(zhì)有極強(qiáng)變性作用，而對(duì)DNA卻沒(méi)有影響。經(jīng)苯酚/氯仿抽提后，酚/氯仿相與水相完全分層，蛋白質(zhì)變性而被離心沉降到酚/氯仿相和水相界面，DNA則留在水相。標(biāo)本中脂類雜質(zhì)溶解于酚/氯仿相，從而與水相分離得以去除。外周血DNA的提取7/15試驗(yàn)原理

此方法提取得到DNA可能會(huì)有RNA雜質(zhì)，不過(guò)RNA極易降解。而且少許RNA對(duì)DNA后續(xù)操作沒(méi)有大影響，如有必要能夠加入不含DNA酶RNA酶去除RNA污染。外周血DNA的提取8/15試驗(yàn)步驟1.首先取EDTA抗凝人外周血2mL,按照1:5～1:10百分比加入去離子水裂解8min，然后1700rpm/min離心，去掉含有紅細(xì)胞碎片上清液，重復(fù)裂解一次，留取白細(xì)胞沉淀。外周血DNA的提取9/15試驗(yàn)步驟DNA細(xì)胞裂解液(pH8.0)：150mmol/LNaCl、10mmol/LTris-HCl、10mmol/LEDTA、0.5%SDSDNA細(xì)胞裂解液中SDS是表面活性劑，主要作用裂解細(xì)胞膜、核膜，使核膜里與蛋白質(zhì)結(jié)合核酸釋放到溶液里面。另外，Tris鹽作用是使抽提出來(lái)DNA輕易進(jìn)入水相，降低在蛋白質(zhì)層滯留。2.加入0.5mLDNA細(xì)胞裂解液來(lái)懸浮白細(xì)胞沉淀。外周血DNA的提取10/15試驗(yàn)步驟3.懸浮后溶液中添加蛋白酶K20μL，65℃水浴0.5h，期間輕緩地倒轉(zhuǎn)幾次。

4.室溫下，添加0.5mL苯酚/氯仿/異戊醇混合抽提液，猛烈地震蕩混合10min，然后8000rpm/min離心10分鐘，然后將水相移至新離心管中。細(xì)胞膜裂解以后，細(xì)胞中含有蛋白質(zhì)和DNA酶等釋放到溶液中，而蛋白酶K含有水解蛋白質(zhì)和DNA酶作用，而且在EDTA和SDS存在條件下仍保持較高活性。在苯酚/氯仿加入少許異戊醇，能夠降低試驗(yàn)中氣泡產(chǎn)生，而且有利于分層，保持分層穩(wěn)定性。外周血DNA的提取11/15試驗(yàn)步驟5.添加1mL預(yù)冷無(wú)水乙醇到水相中，混勻，8000rpm/min離心3分鐘。加入無(wú)水乙醇能夠吸收水相中水分，使得DNA沉淀析出。6.沉淀用70%預(yù)冷乙醇洗滌兩次，然后干燥，最終用50μL去離子水懸浮。70%冰乙醇能夠去除可溶性多糖、金屬離子等雜質(zhì)以及殘留苯酚/氯仿等。外周血DNA的提取12/15試驗(yàn)步驟7.用1%瓊脂糖電泳判定所提取DNA。8.剩下DNA貯存在4℃冰箱中,備用。外周血DNA的提取13/15注意事項(xiàng)一.提取染色體DNA最根本要求就是保持核酸完整性。所以操作過(guò)程中要注意：1物理原因高分子量DNA長(zhǎng)而彎曲，僅有極微側(cè)向穩(wěn)定性，機(jī)械張力和高溫很輕易使DNA分子發(fā)生斷裂。所以，實(shí)際操作過(guò)程中盡可能輕緩，盡可能防止過(guò)分溶液吹打轉(zhuǎn)移，以及過(guò)高溫度。2化學(xué)原因在過(guò)酸條件下，因?yàn)镈NA脫嘌呤而造成DNA不穩(wěn)定，輕易在堿基脫落地方發(fā)生斷裂。所以防止使用過(guò)酸條件。二.步驟3轉(zhuǎn)移水相時(shí)，此時(shí)水相可能比較粘稠，必須非常