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實驗七細(xì)胞器的分級分離第1頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六實驗?zāi)康?/p>
學(xué)習(xí)分離細(xì)胞器的一般原理及方法第2頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六實驗原理
細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器的比重和大小都不相同,在均勻密度介質(zhì)中不同離心力下沉降的細(xì)胞器組成不同或在梯度介質(zhì)中離心后分布于不同密度層,根據(jù)這一原理,差速離心法或密度梯度離心法就可將細(xì)胞內(nèi)各種組分分離出來。分離流程:破碎組織(勻漿或研磨)-差速離心或密度梯度離心分離細(xì)胞器-結(jié)果檢驗分析第3頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六勻漿(Homogenization)低溫條件下,將組織放在勻漿器中,加入等滲勻漿介質(zhì)(即0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化鈣)進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。第4頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六各種勻漿、研磨器第5頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六差速離心分級分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降細(xì)胞器。先用低速使較大的顆粒沉淀,再用較高的轉(zhuǎn)速將上清液中的小顆粒沉淀下來。
DifferentialcentrifugationHighspeedLowspeed第6頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六密度梯度離心(densitygradientcentrifugationmethod)亦稱平衡密度梯度離心法。用超速離心機對小分子物質(zhì)溶液,長時間加一個離心力場達(dá)到沉降平衡,在沉降池內(nèi)從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液,則溶液內(nèi)比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生大分子沉降,比溶劑密度小的部分就會上浮,最后在重力和浮力平衡的位置,集聚形成大分子帶狀物。第7頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation第8頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六分析分級分離得到的組分,可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。第9頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六(一)實驗材料
多葉綠菜第10頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六實驗試劑0.4M蔗糖0.35M氯化鈉(每升19.856g氯化鈉)第11頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六實驗用品1、普通臺式離心機:4臺2、研缽:30個3、40ml小燒杯:30個4、紗布:5包5、離心管60支6、載玻片及蓋玻片見指導(dǎo)。第12頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六一、葉綠體的分離第13頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六細(xì)胞中及勻漿中的葉綠體第14頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六葉綠體的分離步驟1、采樣、洗滌、去葉脈:最好在晴天上午10時左右選取生長正常的菠菜葉子(菜心、白菜、豌豆也可)洗干凈,用吸水紙擦干,去柄及粗脈2、預(yù)冷:放入4℃冰箱預(yù)冷1h;3、研磨勻漿:稱2克葉子在玻璃研缽中剪碎,先加1-2m1制備液,快速磨成勻漿,然后再加8m1制備液,磨勻;4、過濾:把勻漿液倒在6層沙布上過濾入小燒杯;第15頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六5、離心去完整細(xì)胞、細(xì)胞核等:上述濾液轉(zhuǎn)入10ml離心管,平衡后在約500rpm(每分鐘的轉(zhuǎn)速)離心2分鐘,上清轉(zhuǎn)入另一離心管;6、離心收集葉綠體:上清液在2600rpm離心5分鐘,棄上清液,沉淀即是葉綠體。7、懸浮葉綠體:沉淀中加入制備液適量,用吸管吹打懸浮、混勻:8、鏡檢分離效果9、葉綠體被膜完整度的測定:鐵氰化鉀光還原的Hill反應(yīng)第16頁,共17頁,2023年,2月20日,星期六葉綠體
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