雙熒光報(bào)告基因分析

雙熒光報(bào)告基因分析實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯哭D(zhuǎn)錄因子的活性和調(diào)控元件的活性。實(shí)驗(yàn)原理：通過(guò)將感興趣的目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件構(gòu)建到帶熒光素酶（fireflyluciferase）的表達(dá)載體，如pGL3,構(gòu)建成報(bào)告基因質(zhì)粒，使這段DNA序列調(diào)控luciferase的轉(zhuǎn)錄。然后將報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，并加入底物熒光素后（luciferin），luciferase可以催化熒光素發(fā)出熒光，從而可以通過(guò)測(cè)量熒光值的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。為避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)細(xì)胞時(shí)效率的差異而帶來(lái)的誤差，可以同時(shí)轉(zhuǎn)入Renilla熒光素酶的報(bào)告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參，即雙熒光報(bào)告系統(tǒng)。該實(shí)驗(yàn)可以用于研究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)promoter或enhancer序列的調(diào)控，也可以用于研究受體活性，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，或者microRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：1．質(zhì)粒構(gòu)建1.1載體的選擇常用的載體有pGL3系列，包括pGL3-basic（附圖la），pGL3-promoter（附圖1b），pGL3-enhancer（附圖1c）。如果要研究的序列是promoter，可選擇將目的片段插入pGL3-enhancer載體；若要研究的序列是enhancer，則可選擇pGL-promoter載體。1.2抽提基因組DNA，并以基因組DNA為模板PCR,克隆目的片段，通過(guò)合適的酶切，插入載體，構(gòu)建報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒。2．轉(zhuǎn)染將報(bào)告基因質(zhì)粒和作為內(nèi)參的Renilla以及待研究的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并根據(jù)需要刺激或處理細(xì)胞，24h-48h后收細(xì)胞。在共轉(zhuǎn)染時(shí)，由于內(nèi)參質(zhì)粒Renilla有很強(qiáng)的promoter/enhancer，因此報(bào)告基因質(zhì)粒:Renilla轉(zhuǎn)染量一般為10：1到50：1。3.Luciferase活性的測(cè)定(以promega的雙熒光報(bào)告試劑盒為例)3.1細(xì)胞裂解試劑盒中提供的裂解液為5XPLB(passivelysisbuffer)，使用前取1體積的PLB,加4體積的dH2O混勻。去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗一遍以去掉殘留的培液，加入1XPLB。并將培養(yǎng)板于搖床上室溫?fù)u15min,使細(xì)胞充分裂解。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至ep管，12000gX30sX4°C離心。上清中即含有fireflyluciferas和Renillaluciferase，用于測(cè)定酶活性；而沉淀為核蛋白，可用于westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。MultiwellPlateIXPLB6-wellcultaeplate500ul12-wellcultiu^plate250ul24-wellcultiu^platelOOul48-wellcultiueplate65ul%-wellcultiu^plate20ul3.2LARII和Stop&GloLARII(luciferaseassayreagent)是fireflyluciferase的底物，在使用新的KIT時(shí)，將LARII溶解在LAIIbuffer中，并分裝保存。Stop&Glo是Renillaluciferase的底物，同時(shí)能終止LARII的反應(yīng)。在試劑盒中提供的是50XStop&Glosubstrate以及Stop&Globuffer?？梢砸淮螌ubstrate與buffer混勻，然后分裝保存，也可以每次使用前取1體積的substrate，加入50體積的buffero3.3測(cè)定在指形管中加入40m的LARII，10m細(xì)胞裂解液，用槍頭上下打勻2-3次，于發(fā)光儀中測(cè)量，讀數(shù)，即為fireflyluciferase的值。每管依次測(cè)量完后，加入40卩1Stop&Glo，再次測(cè)量讀數(shù)，即為Renillaluciferase的值。3.4數(shù)據(jù)的處理先計(jì)算出每管的fireflyluciferase/Renillaluciferase的比值，再以control組的比值為單位1，即可得到不同處理組或轉(zhuǎn)染組的相對(duì)luciferase活性，也就是該處理組基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控的活性。實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑：Dual-Luciferase?ReporterAssaySystem(Promega,E1910orE1960)保存條件：5XPLB -20°CLARII 分裝后于-70C避光保存Stop&Glo分裝后于-70C避光保存注意事項(xiàng)：為保證熒光素酶檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性，可以采取適當(dāng)分裝后避光保存的方法，以避免反復(fù)凍融和長(zhǎng)時(shí)間暴露于室溫。為取得最佳測(cè)定效果，樣品和測(cè)定試劑混合后到測(cè)定前的時(shí)間應(yīng)盡量控制在相同時(shí)間內(nèi)。樣品和測(cè)定試劑混合后，再進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)間通常為10秒，根據(jù)情況也可以測(cè)定更長(zhǎng)或更短時(shí)間，但是同一批樣品最好使用相同的測(cè)定時(shí)間。由于溫度對(duì)酶反應(yīng)有影響，所以測(cè)定時(shí)樣品和試劑均需達(dá)到室溫后再進(jìn)行測(cè)定。附錄：pGL3圖譜s>TiOiyik；poi^A)Eiigrifliftmn&:hptpausesiteI'iort^ckgni^iid^!<)iatepd^A|sig仃salrtar?uc+repcfterlHPtjI190220102M4JtoaJ1742Ncul8C噸Nlari121^inl^tin：polyfA)sfgraJ/transcriplionalpfiusesite(rorhA^kgrcjjndrecijcticn)圖1a5V40Ei-hfucerEWQ\sti3tpq^A^signal|fcr/uicircpirtor)HpsiI9C2KpnssciMidi忖卜相SrrihiiXhoii)GL3-Ef^iaiKer

Vector(50B4k>p)Xbal1742圖1cSa\\BamHi：.SVdOPranote-rHindi105NCOI2?&Hpal兇94腹且11眄JKpnl151s~265112cq33pGLS-ProoiolEFVector(50l0bp]SV4()lateQagnal::+r-ypon&r)Synlhetcpo