釀酒酵母全細胞催化腺苷磷酸化合成三磷酸腺苷的機理研究

.勛死口,切刀給巴譬,∈西施▲¨.,夠:.▲二,▲、刪南京工業(yè)大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)的聲明一、學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知,除了文中特別加以標注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得南京工業(yè)大學(xué)或其他教育▲●.結(jié)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一起工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中做了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名:日期:二、關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明南京工業(yè)大學(xué)、中國科學(xué)技術(shù)信息研究所、國家圖書館、中國學(xué)術(shù)期刊光盤版電子雜志社及清華同方光盤股份有權(quán)保留本人所送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子文檔,可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容完全一致。允許論文被查閱和借閱,可以公布包括刊登論文的全部或部分內(nèi)容。論文的公布包括刊登授權(quán)南京工業(yè)大學(xué)研究生部辦理。研究生簽名:導(dǎo)師簽名:日期:??●●奎碩士學(xué)位論文摘要利用啤酒酵母酶系催化腺苷磷酸化合成三磷酸腺苷,是最具應(yīng)用前景的三磷酸核苷生產(chǎn)方法之一。認識反應(yīng)機理,優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)率、降低成本是當(dāng)前三磷酸核苷工業(yè)化生產(chǎn)急待解決的問題。本文對釀酒酵母全細胞催化腺苷磷酸化合成三磷酸腺苷的機理進行了探討,主要從以下四個方面進行了研究:、膜透性對積累的影響。通過研究不同促滲透劑:新型促滲透劑、甲苯、氣流干燥及吐溫,細胞活性酒精生產(chǎn)能力與細胞合成皿的關(guān)系,探討新型促滲透劑破壁效果以及對細胞酶系合成活力的影響。、線粒體對積累的影響。對細胞膜及細胞酶系的深入研究,實驗室自身合成了新型促滲透劑,通過添加線粒體解偶聯(lián)劑二硝基苯酚與否,研究了線粒體對細胞酶系磷酸化合成的貢獻。、無機小分子對積累的影響。通過研究幾種主要的金屬離子如,和對釀酒酵母合成過程的影響,初步探討了釀酒酵母合成的反應(yīng)機理。、對釀酒酵母磷酸化合成三磷酸腺苷的機理有初步認識的基礎(chǔ)上,對以下個因素進行實驗設(shè)計:腺苷,葡萄糖,酵母,硫酸銨,硫酸鎂,氯化鈉,磷酸二氫鉀,新型促滲透劑,,一二硝基苯酚,,溫度。最終轉(zhuǎn)化率為.%,得率為/,較報導(dǎo)的水平%提高了近%,得率提高近倍?；诹姿峄瘷C理研究成果,完成了釀酒酵母全細胞催化腺苷磷酸化合成三磷,▲酸腺苷的中試。關(guān)鍵詞:腺苷三磷酸腺核苷機理磷酸化能量偶聯(lián)碩士學(xué)位論文膨括蛔.跏辦口,,砂已,,也仃.仃
【◆口如口廠,,妒∞陀括婦.,仃.:.夠虢時,飪矗仃,,,,.,硼.鋤仃觴巧,、“啪,∞仃,仃.觚.虢,嬲,弱,,孤彤西婦『口乃口加彬弦.撕,:,,鋤,,,砌,,,,,.廿巧,.矗廳口,以弦囂地,廁切、,仃.:;:仃:,;唱,目錄摘要.第一章文獻綜述.引言??.......的理化性質(zhì)?...生物學(xué)功能.國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及存在問題?...光合磷酸化法..化學(xué)合成法..酶法..利用微生物細胞酶系合成?....利用基因工程菌生產(chǎn)...釀酒酵母...利用酵母酶系生產(chǎn)產(chǎn)品?。..生物催化不對稱合成??....磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)??..擬解決問題及實驗方案..第二章實驗材料、設(shè)備與分析方法?.實驗材料與儀器??....實驗材料...主要儀器.實驗條件...無機磷的測定...試劑配制....無機磷的標準曲線及樣品測定...葡萄糖濃度的標準曲線及樣品測定??..三磷酸腺苷的分析方法一高效液相色譜法?..色譜條件?。一..標準品溶液及樣品溶液的制備?..及濃度??...原理...緩沖液?..???:....磷酸丙糖異構(gòu)酶?...甘油一一磷酸脫氫酶?..醛縮酶..標準溶液??...測定.濃度??...原理..緩沖液.....?...葡萄糖..葡萄糖一一磷酸脫氫酶..己糖激酶..葡萄糖一一磷酸標準液....測定.丙酮酸?..原理..溶液?......丙酮酸標準溶液?...測定.培養(yǎng)及發(fā)酵方法..基本合成液.第三章膜透性對積累的影響?.基本理論.實驗材料..實驗材料..。培養(yǎng)及發(fā)酵方法?...細胞的透性化處理...活細胞鑒別...胞內(nèi)物質(zhì)釋放??...葡萄糖及乙醇含量測定?...含量測定??...實驗結(jié)果..酵母細胞的促滲透化處理...促滲透劑對三磷酸腺苷合成的影響??.。.細胞膜的滲透性對酒精生產(chǎn)能力的影響。.討論?...結(jié)論?;.第四章釀酒酵母合成的反應(yīng)機理研究?..理論部分.實驗?,..材料?....培養(yǎng)基..釀酒酵母培養(yǎng)方法..釀酒酵母合成反應(yīng)過程??...對釀酒酵母合成的影響..否.析因?qū)嶒炘O(shè)計?.相應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化工藝條件??.第七章結(jié)論與展望?.結(jié)論?...展望符號說明成果?.參考文獻,致謝,碩士學(xué)位論文第一章文獻綜述.引言三磷酸核苷、、、是重要的磷酰基化合物,是核酸合成的直接前體、重要的輔酶和能量載體,在細胞的生命代謝中起著十分重要的作用。眾所周知,碳、氫、氧、氮、磷等元素組成了生物體,其中磷是組成生命活體的至關(guān)重要的元素。目前尚未發(fā)現(xiàn)在生命過程中不包含磷的生命體,人體內(nèi)磷的含量大約占元素總量的%,占總量的%。磷與蛋白質(zhì)、核酸、糖原、脂質(zhì)和新陳代謝過程有著密切的聯(lián)系。早在年【】等人就從水解酪蛋白中分離得到含磷的肽,此后許多與磷通過其價鍵結(jié)合的磷酰蛋白和磷酰肽相繼被發(fā)現(xiàn),并逐漸證實了磷在酶的活性調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)、糖原和脂質(zhì)的生物合成、開關(guān)血漿膜上某些特殊離子的微孔、調(diào)節(jié)膜的滲透等主要過程中起著關(guān)鍵作用。年,美國著名科學(xué)家的觀點,之后中國】闡述了“著名磷化學(xué)專家趙玉芬教授【】提出了“磷是生物化學(xué)過程中的調(diào)控中心的觀點,并建立以.磷酰氨基酸作為能量及磷?；Y(jié)合體的生命起源模型。年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎得主發(fā)現(xiàn)的可逆蛋白質(zhì)磷酸化作用提示了外界生物信息在細胞內(nèi)傳遞的基本原理和方式,是細胞代謝、生長、繁殖和癌變的調(diào)控中心。酶的活性態(tài)與非活性態(tài)間的相互轉(zhuǎn)化是通過在酶蛋白中某些氨基酸殘基上增減基因的方式實現(xiàn)的,在六種可能方式中以磷酰化和去磷?；钪匾?、最普遍、生理效應(yīng)最顯著,它是哺乳動物化學(xué)修飾的主要形式,可以說磷?；鶇⑴c的反應(yīng)控制著整個生命過程。以為代表的作為生命活動的能量源泉,當(dāng)釋放一個磷?；?yōu)?時,就有一個生物分子接受了這個磷?；?在磷?；膮⑴c下,一些通常在溫和條件下本不發(fā)生反應(yīng)的生物分子卻發(fā)生了一系列反應(yīng),這是由于因,磷?；膮⑴c而改變了反應(yīng)途徑,降低了反應(yīng)的活化能所致。作為基本代謝過程中最重要的化合物,、和在磷?；^程中同樣起著重要的作用,如【】等人的實驗表明和能夠激活脫氧胞嘧啶核苷激酶對脫氧胞嘧啶核苷及其抗病毒、抗癌類似物的作用;三磷酸腺苷,又名腺昔三磷酸、腺嘌呤核苷三磷酸,簡稱腺三磷;英文名:’。分子式:,分子量:.。純凈的為白色或類白色粉末或晶體;無臭,味咸,微有酸性,有引濕性。在水溶液中解離成離子形式,因此具有極性,易溶于水等極性溶劑中。因它含有磷酸殘基部分,而不溶于乙醇、氯仿或乙醚等有機溶劑。在℃/鹽酸中,就游離出%的磷。的中性鈉鉀鹽在一℃保存,可穩(wěn)定放置數(shù)月。堿性溶液在℃以上分解成無機焦磷酸鹽及一磷酸腺苷。在水溶液里可以發(fā)生水解反應(yīng)【。這和其他無機鹽類的水解方式相同。一般來說的水解分三步進行、分別產(chǎn)生、及腺苷。水解發(fā)生在的兩個高能磷酸酸酐鍵和磷酸酯鍵處。水解方程式如下:△’一./】.十△’一./】.腺苷△’一.,.碩士學(xué)位論文下面是的離子結(jié)構(gòu)形式:《旬一?噎。一;生‘因為水解反應(yīng)是吸熱過程,溫度升高水解就更加徹底。其他諸如反應(yīng)體系內(nèi)各物質(zhì)的濃度及環(huán)境壓強的改變都對水解有一定的影響。在熱力學(xué)含義上,當(dāng)△時,化學(xué)反應(yīng)可以自發(fā)進行。因而的水解反應(yīng)從熱力學(xué)角度上來說是一個十分有利的反應(yīng)。生物化學(xué)中常把含有./以上能量的化合物所含的鍵稱為高能鍵,因此分子里具有兩個高能鍵。分子里所含的、、丫三分子磷酸殘基,從前面所列方程式可知,當(dāng).時,【、之間和、丫之間鍵的水解標準自由能基本上相同,都是一./。磷酸與核糖之間的連結(jié)是磷酸酯鍵,與前兩者的酸酐連結(jié)相比較,它的△’一./較低,因此它不是高能鍵。具有旋光性,原因在于分子里含有核糖環(huán)。而核糖環(huán)上有不對稱碳原子也稱手性碳原子棗。由于上含有腺嘌呤,堿基,上含有共軛雙鍵,就具有特殊的紫外吸收峰。在~波段內(nèi)有一強烈的吸收峰,最大的吸收值在眥處附近。..生物學(xué)功能雖然人類一切生命活動所需的能量主要來自糖和脂肪的分解,但物質(zhì)氧化所產(chǎn)生的能量必須先轉(zhuǎn)變成等含有的高能鍵才能利用。是食物中蘊藏的能量和機體利用的能量之間的紐帶,是人體細胞最主要的直接供能物質(zhì)。分解成和、和時所釋放的能量可用于驅(qū)動熱力學(xué)不利△的過程。生物體系中的生物代謝,如肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)、消化吸收、分泌排泄、運輸貯存、物質(zhì)合成等能量形式的消耗,多有賴于提供。當(dāng)然的同類型物質(zhì):三磷酸尿苷、三磷酸鳥苷、三磷酸胞苷等也分別可為糖原、蛋白質(zhì)、磷脂的生物合成供能,但這些核苷酸的生成和補充都有賴于。第一章文獻綜述但生物有機體內(nèi)并非含有充足的、大量的來貯存能量,即不是貯存能量的物質(zhì),而是以一種靈便的形式作為能量的載體。故人們常把比作是細胞內(nèi)能量的“通用貨幣”。.國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及存在問題..光合磷酸化法光合磷酸化是利用細胞的細胞器葉綠體、載色體、線粒體來生產(chǎn)邛。在提供光照下,利用光合細菌中分離的載色體,或從植物組織中分離的葉綠體,以及具有光自養(yǎng)能量的藻類細胞,使底物或和無機磷反應(yīng)生成。【】等從應(yīng)用雙水相再生反應(yīng)器的角度,研究了載色體在雙相之間分配的各種條件參數(shù)。】等報導(dǎo)了一種在超濾膜反應(yīng)器中利用載色體進行光合磷酸化反應(yīng)?！搿尽康葓髮?dǎo)從深紅螺菌中分離的載色體在循環(huán)光合磷酸化反應(yīng)中,其機械和化學(xué)穩(wěn)定性高于葉綠體。高翔等【發(fā)現(xiàn)特制的半導(dǎo)體可代替葉綠體進行光合磷酸化,合成,得率約%。該工藝原料來源廣,成本低,在提高轉(zhuǎn)化的技術(shù)方面有望取得突破,是一種比較有前景的生產(chǎn)工藝。..化學(xué)合成法的化學(xué)合成,一般以帶磷酸基團的化合物作為磷酸基供體,在無機或有機催化劑的催化作用下,磷酸供體的磷酸基團被選擇性地活化并轉(zhuǎn)移到反應(yīng)底物或上,生成。等人明采用此法進行實驗,的生產(chǎn)得率為%,反應(yīng)專一,分離容易,磷酸化試劑可以再生重復(fù)使用?；瘜W(xué)合成法的特點是反應(yīng)簡單,規(guī)模易擴大,但磷酸化試劑和催化劑昂貴,轉(zhuǎn)化率相對較低,因而該法發(fā)展受到限制。..酶法酶催化合成的基本反應(yīng)過程是磷酸基供體在磷酸化激酶或磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下,將磷酸基轉(zhuǎn)移給、或生成。等【】經(jīng)過大量的研究,發(fā)現(xiàn)乙酸激酶是最佳的磷酸轉(zhuǎn)移酶,其次為氨甲酸激酶,而腺苷激酶和腺苷酸激酶一般在腺苷和作為生成底物時才適用。利用乙酸激酶來合成被認為是尋求工業(yè)化生產(chǎn)突破的方法之一,不過由于酶的價格昂貴,還未在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用。碩士學(xué)位論文..利用微生物細胞酶系合成用微生物細胞作酶源進行酶催化反應(yīng),由于細胞具有維持其生命活動的完整的多酶系統(tǒng),各種酶又保持著原有生活細胞所處的狀態(tài)和特定位置,因此能夠迅速有效地完成多步酶催化反應(yīng)。年,等人】利用面包酵母細胞酶系作為酶源,由生成,這種能完成多步酶催化反應(yīng)的方法應(yīng)用于生產(chǎn)引起了人們的重視,隨后得到發(fā)展。年中山大學(xué)生物系微生物教研室【報導(dǎo)了利用啤酒酵母進行合成的研究,他們以Ⅷ為底物,得率達到%。黎立奇利用啤酒酵母合成,得率達到%。目前,國內(nèi)啤酒廠眾多,該工藝所需酵母的來源極廣,成本低,受季節(jié)限制少;另外,該工藝產(chǎn)率較高,并具有挖掘改進潛力。是目前三磷酸腺苷的主要生產(chǎn)方式之一。..利用基因工程菌生產(chǎn)年代,有學(xué)者利用基因克隆或細胞融合技術(shù)來改進微生物菌體的糖酵解活性和腺苷酸磷酸化酶活力,提高其生產(chǎn)能力。等將釀酒酵母的己糖激酶基因和葡萄糖激酶基因克隆到質(zhì)粒上得到雜交質(zhì)粒和,然后轉(zhuǎn)入酵母細胞中。結(jié)果顯示帶有雜交質(zhì)粒和的酵母細胞,其葡萄糖的磷酸化活性比沒帶質(zhì)粒的酵母細胞提高三倍。應(yīng)用重組研蛆技術(shù)來構(gòu)建生產(chǎn)和谷胱甘肽的基因工程菌,的得率達到%,而對照菌的只有%。這些結(jié)果表明重組技術(shù)在改進微生物的糖代謝活性和提高生產(chǎn)活力的應(yīng)用研究上能夠有效地發(fā)揮作用。.釀酒酵母酵母菌是人類的第一種“家養(yǎng)微生物,也是千百年來與人類生活最為密切相關(guān)的一類微生物,酵母產(chǎn)酒精飲料和谷物淀粉發(fā)酵的功能極大地改善了人們的生活。在酵母無細胞體系發(fā)現(xiàn)“發(fā)酵力的存在,使人們認識了生物催化劑一一酶,以此為契機誕生了生物化學(xué)學(xué)科。在現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的今天,酵母作為模式生物更是扮演著無可替代的作用。酵母是最為廣泛應(yīng)用的外源基因表達寄主微生物,生產(chǎn)了許多有價值的外源基因產(chǎn)物。年完成的釀酒酵母完整基因組測序成為遺傳學(xué)上的里程碑,這是人類首次獲得真核生物基因組的完整核普酸序列【】。酵母作為真核單細胞生物,一方面在生物信息學(xué)研究上為揭示高等哺乳動第一章文獻綜述物遺傳規(guī)律提供了可以方便檢測的實驗系統(tǒng):同時也使酵母作為異源基因表達體系顯示了誘人的前景。利用酵母細胞獲得新產(chǎn)品有著無限潛力,“酵母細胞工廠嬲.珂【。酵母作為與人類密切的微生物,在利用物質(zhì)生產(chǎn)方面有著巨大的潛力。特別是釀酒酵母作為真核單細胞生物,其完整基因組測序已經(jīng)完成,為揭示高等哺乳動物遺傳規(guī)律提供了方便的實驗系統(tǒng),這同時也使酵母作為利用物質(zhì)生產(chǎn)體系顯示了誘人的前景。酵母菌作為研究最為透徹的細胞,是代謝工程方法研究的理想體系;同時,代謝工程原理在建立和改進酵母生產(chǎn)工藝方面也發(fā)揮愈來愈重要作用,對于擴展酵母發(fā)酵原料、增加代謝產(chǎn)物收率,改進發(fā)酵工藝以及超量生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)都具有顯著的意義。酵母作為單細胞低等真核生物,具有易培養(yǎng),繁殖快,便于基因操作等優(yōu)點,已被開發(fā)作為外源基因表達的重要系統(tǒng)。用酵母作宿主表達高等真核生物重組蛋白的顯著優(yōu)點為該體系的發(fā)酵工藝研究提出了要求。重組酵母發(fā)酵有不同于大腸桿菌系統(tǒng)的特點,包括啟動子調(diào)節(jié)、選擇性壓力與質(zhì)粒穩(wěn)定性對策、產(chǎn)物的分泌等。高密度培養(yǎng)重組酵母的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。可再生資源生產(chǎn)酒精是酵母代謝工程研究的熱點。將聊口聯(lián)冊甜的乳糖透性酶和半乳糖酐酶基因?qū)攵⒂喺既?可直接利用乳品工業(yè)廢料乳清中的乳糖發(fā)酵乙醇Ⅲ】【】【。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生有機資源,將木質(zhì)纖維素中的纖維素含葡萄糖、半纖維素含六碳糖和五碳糖水解發(fā)酵乙醇是一項意義重大的課題,盡管仍存在一些技術(shù)障礙,但應(yīng)用代謝工程作為工具來構(gòu)造一些菌株可有效而經(jīng)濟地將木質(zhì)纖維素水解液中的各類糖轉(zhuǎn)變成有用的產(chǎn)物。通過代謝分析和基因操作賦予釀酒酵母有益的性狀,可更好地提高釀造過程效益。代謝工程在減少酵母發(fā)酵副產(chǎn)物生成方面將發(fā)揮重要作用。通過代謝分析搞清具體控制酵母凝聚的機理,獲取穩(wěn)定表達強凝集性的酵母,對提高發(fā)酵效率也有重要意義【】。細胞代謝能量物質(zhì)的途徑?jīng)Q定了生物合成的效率。等將應(yīng)用于研究重組盯礦婦培養(yǎng)時細胞生理狀態(tài)、代謝通量與外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的關(guān)系,碩士學(xué)位論文發(fā)現(xiàn)代謝途徑的通量分配通過效率影響外源蛋白質(zhì)表達產(chǎn)量【】。”【】曾說,生物化學(xué)家最后一塊勝地是關(guān)于細胞的滲透性,迄今為止未找到合適的解釋。【對細胞膜的生理功能評價,認為其困難之處遠在人們的意料之外。酵母不失為一種模式菌株,對其細胞膜的研究也許會在這項鄰域有所建樹、創(chuàng)新。..利用酵母酶系生產(chǎn)產(chǎn)品酵母細胞含酶種類豐富,具有催化多種生化反應(yīng)的潛力。特別酵母細胞具有輔酶,,曙再生功能,在催化氧化還原反應(yīng)、磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)方面可發(fā)揮重要作用。利用酵母細胞的酶系進行酶催化反應(yīng)生產(chǎn)所需產(chǎn)品范圍廣泛、具有很好的市場前景。..生物催化不對稱合成利用面包酵母陀,括砌催化不對稱合成反應(yīng)是近十?dāng)?shù)年來研究十分活躍的領(lǐng)域。隨著研究工作進展,己經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以直接將面包酵母用于各類化合物的不對稱合成,往往能獲得很高的光學(xué)純度和收率。面包酵母作為生物催化劑廣泛應(yīng)用于如下方面一酮酯的還原;氧代酸衍生物的還原;一羥基醛和酮還原成連二醇;一碳上含硫功能基團的還原;一二酮的還原;碳碳雙鍵的還原;碳碳單鍵的生成包括功能基手性合成結(jié)構(gòu)單元的制備等;光學(xué)活性氟化合物制備;雜環(huán)酮的還原;芳香酮的還原;環(huán)狀外消旋酮的動力學(xué)拆分;含硝基化合物的還原;酯的水解;,一不飽和醛的雙鍵水加成;不飽和脂肪酸的脫氫作用,等等,這些產(chǎn)物在醫(yī)藥、農(nóng)藥、精細化工品合成等領(lǐng)域有著十分廣闊的應(yīng)用前景。..磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的天然三肽。具有重要的藥用價值。已經(jīng)可以通過化學(xué)合成、從酵母或麥芽中提取等方法生產(chǎn),但產(chǎn)率低,成本高。利用表達谷胱甘膚合成酶的基因工程菌酶法合成是最有前途的方法。酶合成反應(yīng)需要的參與,從經(jīng)濟上考慮,高效、低成本的合成首先必須有一個廉價的再生方法。用酵母的糖酵解途徑再生,被表達谷胱甘肽合成酶基因的重組礎(chǔ)利用,可以高效合成。利用釀酒酵母假卯旭怯口或產(chǎn)肌假絲“,,,西也是可以通過直接發(fā)酵力一法生產(chǎn)谷胱甘肽【】。第一章文獻綜述腺苷甲硫氨酸.甜矗曲,Ⅵ或是臨床治療關(guān)節(jié)炎、精神病、肝炎的藥物。利用陀括融,擾凰等普通酵母,在前體一甲硫氨酸存在下生物轉(zhuǎn)化合成舢訂,在酵母細胞的合成酶:?仃,...及糖酵解酶系共同參與下,可以獲得燦訂的高水平積累【。.擬解決問題及實驗方案酵母代謝工程的研究集中于釀酒酵母。一方面釀酒酵母作為研究最為透徹的真核細胞為代謝工程方法建立提供了重要的素材;同時該酵母代謝工程研究對改善酵母傳統(tǒng)發(fā)酵工藝、提高產(chǎn)品品質(zhì)、擴大產(chǎn)品類型有重要意義。酵母體系生產(chǎn)產(chǎn)品應(yīng)用廣泛,依據(jù)代謝工程原理改善酵母傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝、開發(fā)酵母生產(chǎn)新功能實際意義顯著,因而,成為近年熱點研究領(lǐng)域之一。本論文將對工程因素調(diào)節(jié)酵母分解和合成代謝、超量生產(chǎn)代謝中間產(chǎn)物進行深入研究,以期建立有價值的優(yōu)化生產(chǎn)工藝,為工程放大提供依據(jù)。建立透性酵母細胞糖代謝的途徑模型,應(yīng)用代謝分布方法分析了代謝系統(tǒng),待解決的幾個問題:、膜透性與積累的研究。通過研究不同促滲透劑:新型促滲透劑、甲苯、氣流干燥及吐溫,細胞活性酒精生產(chǎn)能力與細胞合成的關(guān)系,探討新型促滲透劑破壁效果以及對細胞酶系合成活力的影響。、線粒體對積累影響的研究。對細胞膜及細胞酶系的深入研究,實驗室自身合成了新型促滲透劑,通過添加線粒體解偶聯(lián)劑二硝基苯酚與否,研究了線粒體對細胞酶系磷酸化合成的貢獻。、金屬離子對積累的影響。通過研究幾種主要的金屬離子如”,和對釀酒酵母合成過程的影響,初步探討了釀酒酵母合成的反應(yīng)機理。、采用響應(yīng)面設(shè)計實驗設(shè)計方法,研究腺苷濃度、葡萄糖、濃度、濃度、溫度、、無機磷酸鹽濃度、新型促滲透劑等因素對積累的影響,并進行進一步的優(yōu)化,提高得率。碩士論文第二章實驗材料、設(shè)備與分析方法.實驗材料與儀器..實驗材料本論文中所用到的主要實驗試劑列于表.億一..葡萄糖中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司..磷酸二氫鉀汕頭金砂化工廠..磷酸氫二鉀:汕頭市西隴化工廠..無水硫酸鎂上海試劑四廠..二乙胺上海亭新化工試劑廠..四水合鉬酸銨鑫科股份合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠..卜氨基一一萘酚一一磺酸中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司..,一二硝基水楊酸中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司..硫酸銨南京化學(xué)試劑廠鹽酸..上?；瘜W(xué)試劑..氨水上海聯(lián)試化學(xué)試劑..異丁酸上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站試劑廠..磷酸二氫鈉汕頭市西隴化工廠..磷酸氫二鈉中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司..氯化鈉南京化學(xué)試劑廠..氯化鉀南京化學(xué)試劑廠..氯化十六烷基吡啶中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司..無水亞硫酸鈉南京化學(xué)試劑廠..亞硫酸氫鈉南京化學(xué)試劑廠..氫氧化鈉上海凌峰化學(xué)試劑’一%本實驗室精制%江蘇誠意藥業(yè)十二烷基硫酸鈉中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司:冰醋酸從從上海宏圖化學(xué)試劑廠高氯酸從上海桃浦化工廠磷酸南京化學(xué)試劑廠硫酸上?；瘜W(xué)試劑公司甲醇∞從讎上海陸都化學(xué)試劑公司甲一公司一公司一公司一公司一公司一公司一公司一公司一公司一公司一公司一公司一公司一公司啪一公司一公司.一公司..主要儀器本論文中所用到的主要實驗儀器列于表.表主要實驗儀器’“巧.紫外可見分光光度計上海天美科學(xué)儀器型電子天平上海天平儀器廠碩士論文高速冷凍離心機德國公司電熱鼓風(fēng)干燥箱?重慶銀河儀器№冰箱電器恒溫水浴鍋常州國華電器.型電熱恒溫水浴鍋江蘇金壇國華儀器上海偉業(yè)儀器廠.型酸度計高效液相色譜儀器公司電動變速攪拌器常州國華電器.快速混勻器常州國華電器.型三用紫外分析儀上海顧村電光儀器廠?標準型凈化工作臺吳江市生化凈化設(shè)備廠臺式恒溫隔水培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械廠電熱手提壓力蒸汽消毒器上海醫(yī)用核子儀器廠.遛轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜上海欣蕊自動化設(shè)備.實驗條件..無機磷的測定【...試劑配制標準磷酸溶液:準確稱取℃干燥的磷酸二氫鉀.,加入,加水定容至。鉬酸銨硫酸試劑:準確稱取鉬酸銨.,加入濃硫酸.,再加水至每兩周重配一次卜氨基一一萘酚一一磺酸液:‘解,定容至備用。...無機磷的標準曲線及樣品測定將標準磷酸溶液再稀釋倍,準確量取、、、札、、、、、至試管,加入液.,加入液,加水至刻度,混勻,放置一,測得吸光值,以為橫坐標,以無機磷濃度/為縱坐標,繪制標準曲線如圖?,其.。反應(yīng)液樣品先稀釋倍,表一加入試劑。表?測定葡萄糖標準曲線的溶液配制,?.......。........,一,.........將各管溶液混勻,在沸水浴中加熱分鐘,取出后立即用冷水冷卻到室溫,每管加入.蒸餾水,搖勻。測處吸光值,以為橫坐標,葡萄糖濃度/為縱坐標,繪制標準曲線如圖?,其.。反應(yīng)液樣品先稀釋倍,再各取.稀釋樣品,其余操作同標準的測定。測得吸光值,對照標準曲線或擬合的方程可得葡萄糖含量。.,;柱溫:室溫;檢測波長:;流速:./;進樣量:此。..標準品溶液及樣品溶液的制備精確稱取腺苷、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的標準品,用緩沖液配制成質(zhì)量濃度約為幾的標準品溶液;將經(jīng)預(yù)處理的樣品用緩沖液稀釋至約幾,并用.岬微孔膜進行過濾后,作為樣品溶液待檢測。.及濃度..原理凹??旦.。一.:十.一????卜?一,抖第二章實驗材料、設(shè)備與分析方法幾,.,平衡偏向右側(cè)。因此,反應(yīng)平衡常數(shù)..×在過量存在下,被完全轉(zhuǎn)化并消耗化學(xué)計量的。由于在處有明顯的吸收峰,而且很穩(wěn)定,而?穢在此波長無光吸收,由此可以根據(jù)在處吸光度的變化來測定濃度。./..緩沖液.,/.//鹽酸,稱取.三乙醇胺,添加..和約..州約,中。鈉鹽%溶解至...磷酸丙糖異構(gòu)酶,/用蒸餾水稀釋試劑...,提純自面包酵母,結(jié)晶物懸浮./中公司產(chǎn)品至所要濃度。..甘油一一磷酸脫氫酶,/用蒸餾水稀釋試劑...,提純自兔肌,結(jié)晶物懸浮于./中公司產(chǎn)品至所要濃度。..醛縮酶,.【/用蒸餾水稀釋試劑...,提純自兔肌,結(jié)晶物懸浮./中,公司產(chǎn)品至所要濃度。..標準溶液幾.。%溶解于蒸餾水中,定容至..測定樣品稀釋至、濃度在~/后進行下述操作。.緩沖液./樣品...,紫外姍處測定吸光度混合后于室溫℃反應(yīng)~.,混合,室溫反應(yīng),測定.‘碩士論文混合,恒溫反應(yīng)以上,測定△,通過相同條件下制作標準曲線確定樣品濃度。。一.濃度..原理下述反應(yīng)被用于同時測定和。???..卜????一一...緩沖液/,.?././..,.,,蒸餾水,。。混勻,調(diào)后定容至..約/中。小提純自酵母,約%,公司產(chǎn)品溶解于.../..葡萄糖/..葡萄糖一一磷酸脫氫酶,/..己糖激酶,/試劑提純自面包酵母,結(jié)晶物懸浮于./中,公司產(chǎn)品用蒸餾水稀釋至所要濃度。..葡萄糖一一磷酸標準液’/二鈉鹽蒸餾水溶解。../二鈉鹽蒸餾水溶解?！?.測定樣品稀釋至濃度為~饑后進行下述操作。緩沖液..,樣品.腙堿性稀釋到.../..丙酮酸標準溶液/..測定樣品與.樣品稀釋至?岬溶液混合,于度恒/,..溫分鐘后,加入/。測定Ⅱ波長的吸光度,根據(jù)相同條件下制作的標準曲線求出丙酮酸濃度。.培養(yǎng)及發(fā)酵方法斜面恒溫培養(yǎng):超凈臺上將菌種涂于斜面,于臺式恒溫隔水培養(yǎng)箱內(nèi)℃恒溫培養(yǎng),冰箱℃保存?zhèn)溆?。三角瓶發(fā)酵培養(yǎng):挑取斜面菌種一環(huán),接入三角瓶培養(yǎng)基中.迪轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜內(nèi)℃下恒溫培養(yǎng),搖床速印。搖床發(fā)酵培養(yǎng):將三角瓶搖瓶種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,于.迪轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜內(nèi)℃下恒溫培養(yǎng)。.基本合成液腺苷/,葡萄糖/,酵母/,硫酸銨/,硫酸鎂/,氯化碩士論文????????????????????????????????????????????????????????一鈉/,磷酸二氫鉀/。第三章膜透性與積累的研究第三章膜透性對積累的影響.理論基礎(chǔ)細胞代謝是由一個受到精密調(diào)控而又彼此協(xié)調(diào)的代謝網(wǎng)絡(luò)來完成的。細胞的代謝網(wǎng)絡(luò)包含了大約個酶的催化反應(yīng)以及選擇性膜傳遞系統(tǒng)。細胞膜是細胞的重要組成部分,它不僅將細胞內(nèi)部與周圍環(huán)境分開,更為重要的是它提供了細胞同周圍環(huán)境重的其他物質(zhì)進行物質(zhì)交換的通道。亟運輸上酸化?一?一運締艫磷酸化?、前體代謝物/一:一一√‖結(jié)構(gòu)單元大分子圖一利用糖類進行細胞合成的總框架一不同種類的物質(zhì)穿越原生質(zhì)膜生物質(zhì)運輸有三種不同的機制:自由擴散;促進擴散;主動運輸。前兩種機制是被動的過程,原則上不需要吉布斯自有能的供應(yīng)。在自由擴散和促進擴散中,物質(zhì)沿著濃度梯度被運輸。這兩種運輸機制的不同之處在于促進擴散是需要以載體為中介的,也就是說,在物質(zhì)運輸過程中需要特定的載體或跨膜蛋白,而自由擴散是分子運輸,在化學(xué)勢能差的驅(qū)動碩士論文下進行。第三種運輸機制即主動運輸,它允許物質(zhì)逆著濃度梯度進行運輸,但需要吉布斯自有能的參與。主動運輸在需要特定的膜定位蛋白或滲透酶調(diào)節(jié)與促進擴散相似。糖類被運輸進入細胞,首先被磷酸化然后進入磷酸己糖庫。磷酸化可獨立于運輸過程或與之相耦合。在真菌中,許多糖類物質(zhì)通過擴散進行運輸。據(jù)報道【】在釀酒酵母中,葡萄糖通過擴散進行運輸,但同時存在一個葡萄糖阻遏型的高親和性體系為/和一個組成型的低親和性體系為/。而酵解過程中的磷酸化作用,使得從葡萄糖到丙酮酸之間的所有中間產(chǎn)物都成為磷酸化的化合物。細胞膜對大多數(shù)磷?；衔锞哂懈叨炔粷B透性。因此,對于負極性化合物的生產(chǎn)中改變細胞膜的通透性對于代謝調(diào)控具有極為重要的意義,只有具有通透性的釀酒酵母才能在發(fā)酵液中積累。細胞膜主要由脂類和蛋白組成。脂類主要為磷脂,并含有糖苷脂和甾醇。磷脂和糖苷酯都具有疏水性及親水性官能團,它們不溶于水,但能在水環(huán)境中有序排列,靠脂肪酸的碳氫鏈的疏水作用,緊密的聚集在一起。其親水官能團由磷?；M成,與水接觸時,形成高度有規(guī)則的雙脂層。脂類在膜中處于液晶狀態(tài),雖然有序排列,但又有轉(zhuǎn)動、擺動和流動的自由。膜可以在溫度影響下發(fā)生物理變化,由一種柔順的流體似的液晶狀態(tài)轉(zhuǎn)變成一種固體凝膠狀的結(jié)晶狀態(tài),發(fā)生的相變化的溫度與親水、疏水兩脂類的成分有關(guān)。與膜鍵合的酶,其傳遞程序、接受部位等,均以一定的脂質(zhì)緩解為前提,故酶活性因膜脂質(zhì)的物理狀態(tài)的變化而發(fā)生顯著變化。因此,膜的相轉(zhuǎn)變可以對細胞的生理功能與生化反應(yīng)產(chǎn)生影響。不同工藝條件培養(yǎng)的啤酒酵母,一般都具有葡萄糖代謝活性,但是,當(dāng)不同條件下培養(yǎng)的啤酒酵母細胞分別用于轉(zhuǎn)化時,它們的酶催化活性和產(chǎn)率明顯不同。利用酵母細胞酶系合成三磷酸腺苷筒呼,由于細胞膜促滲透性的限制,細胞內(nèi)各種酶的活性一般不能完全發(fā)揮作用。段學(xué)輝等人的研究顯示【,釀酒酵母細胞用于合成,催化磷酸化的酶系活性缺乏穩(wěn)定性。改變細胞的促滲透性來促進胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的釋放,是生物合成和生物催化應(yīng)用研究中常用的一種有效方法。國內(nèi)外酵母促滲透處理法主要如下【】:第三章膜透性與】限積累的研究溫度沖擊法促滲透化方法生物生理調(diào)控法圖?細胞促滲透方法毹.?‘胞促滲透化處理常用有機溶劑,其機理是有機溶劑透過細胞壁與細胞進行內(nèi)反應(yīng),破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)層的流動性,使細胞膜失去原有的對胞內(nèi)外物質(zhì)傳遞的調(diào)控能力,從而提高細胞膜的促滲透性。低溫冷凍、脫水干燥和超聲波處理等也是提高酵母細胞促滲透性的方法;這些物理方法對細胞膜和細胞壁的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞,細胞因膜/壁結(jié)構(gòu)性損傷而提高促滲透性。采用物理方法提高細胞的促滲透性在生產(chǎn)操作上有一定難度;有機溶劑法具有可操作性,但受到環(huán)境和衛(wèi)生安全方面的限制。應(yīng)用生物生理調(diào)控方法,使培養(yǎng)酵母的細胞膜產(chǎn)生生理性缺陷而形成特殊的促滲透性能【】,具有潛在的工業(yè)價值。培養(yǎng)基添加表面活性劑可以改變酵母的生理特性。如聚氧乙烯三梨聚糖脂肪酸酯吐溫可以提高甜聊甜研酒精產(chǎn)量,增加絮凝效果【】【。聚氧烯油酸二醇畔冷凝物作為消泡劑,對“乃羿,淞和材聊所的生長、呼吸都有促進作用【】。.表面活性劑同樣可以對酵母細胞滲透化,滲透化的程度取決于酵母的種類及細胞膜固醇含量【】。及指出,表面活性劑的分子量在~,對理,括蛔細胞生長、變異及酒精產(chǎn)量作用最好【。本實驗室自身合成一種?的衍生物,其分子量在~。其分子式如下所示?！酷ùT士論文其中,薩,~,。在普通.的烷基段,添加了季銨鹽。陀括脅本文對一株啤酒酵母.,本試驗室保藏進行破壁促滲透化研究。通過不同促滲透方法,如添加新型促滲透劑、甲苯、吐溫及通過氣流干燥,研究細胞活性酒精生產(chǎn)能力與細胞合成限的關(guān)系,探討新型促滲透劑破壁效果以及對細胞酶系合成活力的影響。.實驗部分..實驗材料腭括腸斜面培菌種為啤酒酵母.,本試驗室保藏。養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基組成同文獻【”。..培養(yǎng)及發(fā)酵方法參考第二章。..細胞的透性化處理破壁處理:用適量的水調(diào)腺苷成漿狀,最終為/,葡萄糖/,酵母/,/,硫酸銨./,硫酸鎂./,氯化鈉./,磷酸二氫鉀..,溫度.℃。破壁劑、甲苯、吐溫分別加入./、/、./。氣流干燥破壁處理:過濾分離的細胞均勻地分布在細目過濾網(wǎng)上,過濾網(wǎng)放在一個相應(yīng)大小地布氏漏斗上,從漏斗底部均勻地通入壓縮空氣,℃下氣流干燥畔】。..活細胞鑒別次甲基亞藍染色法測定。..胞內(nèi)物質(zhì)釋放將.濕細胞或.空氣干燥細胞均勻地懸浮在磷酸鉀緩沖液中,值用和.兒調(diào)節(jié)在...,在給定的溫度下間隙攪動提取.;離心分離,取上清液分析釋放的胞內(nèi)物質(zhì)濃度。以緩沖液作空白,于波長測定提取液的吸光度;零時未處理提取液的吸光度~為基值,胞內(nèi)釋放到提取液中物質(zhì)的吸光度.~【】。..葡萄糖及乙醇含量測定參考第二章。..含量測定第三章膜透性與積累的研究參考第二章。.實驗結(jié)果..酵母細胞的促滲透化處理由于細胞內(nèi)大多數(shù)的酶都存在于內(nèi)膜表面和胞間質(zhì)中,細胞壁和細胞膜的存在對物質(zhì)傳輸造成了一定的阻力。一方面降低了底物在胞內(nèi)濃度,降低了反應(yīng)的速度:另一方面也使得產(chǎn)物在胞內(nèi)大量積累,抑制了細胞的催化活力。為了增強膜的促滲透性,往往加入有機溶劑如乙酸乙酯和醇類物質(zhì)以及物理處理的方法,能夠顯著增強傳質(zhì)。利用酵母細胞酶系合成,由于細胞膜的促滲透性限制,胞內(nèi)酶不能完全發(fā)揮作用。采用營養(yǎng)緩沖液、添加新型破壁劑.%的營養(yǎng)緩沖液、體積百分比為%的甲苯營養(yǎng)緩沖液、體積百分比%的吐溫的營養(yǎng)緩沖液和氣流干燥等對培養(yǎng)的全細胞進行促滲透化處理。結(jié)果如表.:表.不同方法處理的細胞促滲透化處理啪仃表.中可以看出,經(jīng)處理的細胞與未處理的細胞相比,其促滲透性明顯改觀;添加新型破壁劑.%的營養(yǎng)緩沖液的細胞促滲透性可與氣流干燥的效果相碩士論文媲美。..促滲透劑對三磷酸腺苷合成的影響幾十年來研究工作者對酵母細胞合成反應(yīng)的機理做了大量的工作,經(jīng)研究認為與糖酵解途徑而不是與途徑相關(guān)聯(lián)。釀酒酵母合成曙需糖酵解途徑偶聯(lián)腺苷激酶和腺苷酸激酶。促滲透化處理的細胞酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的能量,被腺苷加以利用,以高能磷酰化合物的形式被貯存。經(jīng)促滲透化處理的細胞,酒精發(fā)酵能力提高,由于的合成與之相偶聯(lián),就此而言,酒精代謝途徑越發(fā)達,越有利于的合成。釀酒酵母合成限需糖酵解途徑偶聯(lián)腺苷激酶和腺苷酸激酶。在糖酵解過程中,酒精發(fā)酵是主要能量來源,其中的己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶是關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶,協(xié)調(diào)著糖酵解速率。各種破壁方式下的產(chǎn)量與酒精產(chǎn)量關(guān)系如圖.、、.和.。圖.營養(yǎng)緩沖液下的產(chǎn)量與酒精產(chǎn)量關(guān)系力倒舭.?的研究圖新型破壁劑處理后的產(chǎn)量與酒精產(chǎn)量關(guān)系、?汀’.圖?甲苯處理后的產(chǎn)量與酒精產(chǎn)量關(guān)系鉚.?似仃厶:
捌■∞圖.釀酒酵母合成途徑.陀’,婦卵的能量循環(huán)是生物體整個代謝的核心,它不僅是途徑的產(chǎn)物一個完整的途徑產(chǎn)生兩個分子,而且它所介導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)對途徑的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用,一方面通過激酶的作用傾向于將它的磷酸基團轉(zhuǎn)間產(chǎn)物帶了與酶結(jié)合而胞正常維持中的關(guān)鍵酶代謝抑制戊糖等圖?不司處理方式,釀酒酵母酒精生產(chǎn)能力訛嘻?從圖.中可以看出,經(jīng)過促滲透化處理的細胞,其酒精發(fā)酵能力有明顯提高;與其他幾種破壁方式相比,新型破壁劑對釀酒酵母酒精發(fā)酵能力提高最大,最終酒精濃度接近/,此時對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率接近%。圖.也表明,這幾種破壁劑基本不影響酵母的酶系活力,基本都是在開始快速酒精發(fā)酵。另外,實驗測定的最終殘?zhí)菨舛然緸?經(jīng)促滲透處理的釀酒酵母磷酸化合成三磷酸腺苷,主要是與糖酵解途徑相關(guān)聯(lián),但在合成初期可能與相關(guān)聯(lián)。.討論促滲透作用過程可以分為步,即吸附到細菌表面,穿透細胞壁,與細胞膜結(jié)合,擾亂細胞膜組成,導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏。碩士論文帶正電.衍生物首先被吸附到菌體表面,穿透細胞壁,與細胞膜的類脂層和蛋白質(zhì)層結(jié)合,阻礙了細菌對外界的正常離子交換和物質(zhì)交換,并破壞控制細胞滲透性的原生質(zhì)膜,使細胞內(nèi)物質(zhì)外滲。為了達到較好的殺菌效果,聚陽離子必須要有足夠長的鏈。通過碘化丙錠染色法證明季銨鹽的目標主要是細胞膜,因為這種紅色的熒光染料只能進入到細胞膜損失的細胞,此實驗說明了破壞細胞膜是表面接觸殺菌聚合物的殺菌機理,聚合物長鏈可以穿過微生物細胞的外層細胞壁將活性部分伸入到細胞膜從而殺死細胞。在促滲透過程中,帶正電荷的首先選擇性的吸附到帶負電的細胞膜表面,形成一層高濃度的離子基團,改變了細胞膜導(dǎo)電性、表面張力、溶解性,其疏水性基團和親水性基團可分別滲入菌體細胞膜的類脂層與蛋白質(zhì)層,從而改變菌體細胞漿膜的滲透性,使細胞內(nèi)物質(zhì)外滲,導(dǎo)致酵母菌體窒息死亡或抑制其生長。同時,其官能團烷氧基等可與蛋白質(zhì)上的一些基團發(fā)生反應(yīng)形成絡(luò)合物,從而使蛋白質(zhì)變性。.結(jié)論對細胞膜及細胞酶系的深入研究,實驗室自