離體蛙心灌流

離體蛙心灌流第1頁/共38頁離體蛙心灌流第2頁/共38頁【目的要求】1、學(xué)習(xí)斯氏離體蛙心灌流法。2、觀察離子及藥物等對(duì)離體心臟活動(dòng)的影響。第3頁/共38頁【基本原理】心臟的正常節(jié)律性活動(dòng)需要一個(gè)適宜的內(nèi)環(huán)境（如Na＋，K＋，Ca2＋等的濃度及比例、pH值和溫度），內(nèi)環(huán)境的變化直接影響到心臟的正常節(jié)律性活動(dòng)。將失去神經(jīng)支配的離體心臟保持于適宜的理化環(huán)境中（任氏液Ringersolution），在一定時(shí)間內(nèi)仍能產(chǎn)生自動(dòng)節(jié)律性興奮和收縮。第4頁/共38頁

離子對(duì)心臟活動(dòng)的影響改變?nèi)问弦旱慕M成成分，離體心臟的活動(dòng)就會(huì)受到影響。K+參與心肌細(xì)胞的復(fù)極化和自律細(xì)胞的4期自動(dòng)去極化過程，其改變不僅取決于細(xì)胞內(nèi)外K+濃度梯度，還與細(xì)胞膜對(duì)K+通透性有關(guān)，因此其影響是多方面的。Ca2+對(duì)Na+內(nèi)流存在競爭抑制作用，稱膜屏障作用，對(duì)靜息電位無影響。[Ca2+]o↑，可使心肌細(xì)胞的興奮性降低，傳導(dǎo)減慢，收縮力增強(qiáng)。第5頁/共38頁在體心臟受交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的雙重支配交感神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素，與心肌細(xì)胞β受體結(jié)合，使心肌收縮力加強(qiáng)，傳導(dǎo)速度加快，心率加快；阻斷劑心得安迷走神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，與心肌細(xì)胞M受體結(jié)合，使心肌收縮力減弱，心肌傳導(dǎo)速度減慢，心率減慢；阻斷劑阿托品第6頁/共38頁【動(dòng)物、器材與試劑】蟾蜍或蛙、紗布、毀髓針、眼科鑷、手術(shù)剪、眼科剪、蛙板、蛙釘、玻璃分針、滴管、細(xì)棉線、蛙心夾、鐵支架、萬能滑輪、小燒杯、斯氏蛙心套管、雙凹夾、套管夾、張力換能器、生物信號(hào)計(jì)算機(jī)采集系統(tǒng)任氏液、0.65%NaCl、2%CaCl2

、1%KCl、1/10000腎上腺素、1/10000乙酰膽堿、阿托品、300U/ml肝素。第7頁/共38頁【方法與步驟】1、儀器準(zhǔn)備2、離體蛙心的制備3、連接實(shí)驗(yàn)裝置4、實(shí)驗(yàn)觀察第8頁/共38頁1、儀器準(zhǔn)備打開計(jì)算機(jī)生物信號(hào)采集系統(tǒng)，選擇實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目-循環(huán)實(shí)驗(yàn)-離體蛙心灌流。熟悉實(shí)驗(yàn)標(biāo)記的使用。參考：生理模擬實(shí)驗(yàn)軟件-離子和藥物對(duì)離體蛙心的影響第9頁/共38頁2、離體蛙心的制備（斯氏蛙心插管法）在左主動(dòng)脈下方穿線，靠上端結(jié)扎，作插管時(shí)牽引用在主動(dòng)脈干下方穿線，在動(dòng)脈圓錐上方打一活結(jié)備用（用以結(jié)扎和固定插管）。取蛙或蟾蜍，雙毀髓后背位置于蛙板上，暴露心臟。仔細(xì)識(shí)別心臟周圍的大血管。第10頁/共38頁左手提起左主動(dòng)脈上方的結(jié)扎線，右手用眼科剪在結(jié)扎線下方、沿向心方向?qū)?dòng)脈管壁剪一斜口（注意要剪破血管內(nèi)膜，每次心縮時(shí)有血自切口涌出，但不要把血管剪斷，剪口位置視套管尖端長度與心臟大小而定）。選擇大小適宜的斯氏蛙心套管，盛入少量任氏液（內(nèi)加一滴肝素溶液，套管內(nèi)2－3cm高度）。左手用眼科鑷提起切口緣，右手將注有任氏液的斯氏套管插入動(dòng)脈干內(nèi)，然后左手持左側(cè)血管分支上的結(jié)扎線向外拉，右手將蛙心套管送入動(dòng)脈圓錐。第11頁/共38頁當(dāng)套管尖端到達(dá)動(dòng)脈圓錐基部時(shí)，應(yīng)將套管稍向后退（因主動(dòng)脈內(nèi)有螺旋瓣會(huì)阻礙插管前進(jìn)），并將套管尾端稍向右主動(dòng)脈方向及腹側(cè)面傾斜，使插管尖端向動(dòng)脈圓錐的背部后下方及心尖方向推進(jìn)，在心室收縮時(shí)經(jīng)主動(dòng)脈瓣進(jìn)入心室。第12頁/共38頁注意插管不可插得過深，插管的斜面應(yīng)朝向心室腔，以免插管下口被心室壁堵住。此時(shí)可見血液沖入套管，并使液面隨心臟搏動(dòng)而上下移動(dòng)，表明操作成功（否則需退回并重新插入）用滴管吸去套管中的血液，換新鮮任氏液。第13頁/共38頁穩(wěn)定住套管后，輕輕提起備用線，將左、右主動(dòng)脈連同插入的套管用雙結(jié)扎緊（不得翻液），再將結(jié)線固定在套管的小玻璃鉤上，然后剪斷結(jié)扎線上方的血管。看清靜脈竇的位置，在心臟的下方繞一線，將左右肺靜脈及前后腔靜脈一起結(jié)扎（注意切勿損壞靜脈竇）。輕輕提起套管和心臟，于靜脈竇下方剪斷有牽連的組織，僅保留靜脈竇與心臟的聯(lián)系，使心臟離體。第14頁/共38頁用任氏液反復(fù)沖洗心室內(nèi)余血，使套管內(nèi)灌流液不再有殘留血液。保持套管內(nèi)液面高度一致（1.5－2cm，或在套管的下1/3處結(jié)一線作為標(biāo)志，每次換任氏液時(shí)使液面與此線相平），即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第15頁/共38頁其他方法技巧用蛙心夾提起心尖，使心室與動(dòng)脈圓錐約呈100°-200°的鈍角，然后當(dāng)心室縮緊時(shí)把套管平直往心室方向推進(jìn)。當(dāng)感覺套管進(jìn)入心室后再把心尖放平，隨即將套管稍向心室推進(jìn)，調(diào)整合適位置，可見套管內(nèi)液面隨心跳而升降。第16頁/共38頁3、連接實(shí)驗(yàn)裝置將套管固定在支架上，用蛙心夾在心舒期夾住少許心尖部肌肉（不要夾多，以免夾破心室而漏液）。將蛙心夾上的系線繞過一個(gè)滑輪與張力傳感器相連。勿使灌流液滴到傳感器上。調(diào)節(jié)記錄儀器上的收縮曲線的幅度適中。第17頁/共38頁4、實(shí)驗(yàn)觀察1)記錄正常心搏曲線。2)改用0.65%NaCl溶液灌流，并作好加藥標(biāo)記，觀察心搏變化。待曲線出現(xiàn)明顯變化時(shí)，立即吸去套管中的灌流液，同時(shí)做好沖洗標(biāo)記，并用新鮮任氏液清洗2－3次，待心搏恢復(fù)正常。注意：換液時(shí)切勿碰套管，以免影響描記曲線的基線，同時(shí)保持灌流液面一致（下同）。第18頁/共38頁3)向套管內(nèi)加2－6滴5%NaCl溶液，作好加藥標(biāo)記，觀察心搏曲線的頻率及振幅變化。當(dāng)曲線出現(xiàn)明顯變化時(shí)，應(yīng)立即吸去套管中的灌流液，并做好沖洗標(biāo)記，迅速用新鮮任氏液清洗2－3次，待心搏恢復(fù)正常。4)向套管內(nèi)加1－2滴2%CaCl2溶液，作好加藥記號(hào)，觀察心搏曲線的頻率及振幅變化。標(biāo)記、沖洗至心搏恢復(fù)正常5)向套管內(nèi)加入1－2滴1%KCl溶液，記錄心搏曲線的變化。當(dāng)心搏曲線變化時(shí)，同法更換灌流液，待心搏恢復(fù)正常。第19頁/共38頁6)同法記錄套管中加入1－2滴腎上腺素溶液(1/10000)后心搏曲線的變化。7)同法記錄套管中加入1－2滴乙酰膽堿溶液(1/10000)后心搏曲線的變化。8)同法記錄套管中先加入阿托品后再加1－2滴乙酰膽堿溶液(1/10000)后心搏曲線的變化。第20頁/共38頁【注意事項(xiàng)】1、制備離體心臟標(biāo)本時(shí)，勿傷及靜脈竇。2、蛙心夾應(yīng)在心室舒張期一次性夾住心尖，避免因夾傷心臟而導(dǎo)致漏液。3、每一觀察項(xiàng)目都應(yīng)先描記一段正常曲線，然后再加藥并記錄其效應(yīng)。加藥時(shí)應(yīng)在心跳曲線上予以標(biāo)記，以便觀察分析。4、各種滴管應(yīng)分開，不可混用。5、在實(shí)驗(yàn)過程中，插管內(nèi)灌流液面高度應(yīng)保持恒定；儀器的各種參數(shù)一經(jīng)調(diào)好，應(yīng)不再變動(dòng)。第21頁/共38頁6、標(biāo)本制備好后，若心臟功能狀態(tài)不好（不搏動(dòng)），可向插管內(nèi)滴加1～2滴2%CaCl2或1：10000腎上腺素，以促進(jìn)（起動(dòng)）心臟搏動(dòng)。在實(shí)驗(yàn)程序安排上也可考慮促進(jìn)和抑制心臟搏動(dòng)的藥物交換使用。7、給藥后若效果不明顯，可再適量滴加，并密切注意藥物劑量添加后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。給藥量必須適度，加藥出現(xiàn)變化后，就應(yīng)立即更換任氏液，否則會(huì)造成不可挽回的后果，尤其是K＋稍有過量，即可導(dǎo)致難以恢復(fù)的心臟停跳。8、謹(jǐn)防灌流液沿絲線流入張力傳感器內(nèi)而損壞其電子元件。第22頁/共38頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目收縮強(qiáng)度心率處理前處理后處理前處理后0.65%NaCl2%CaCl21%KCl1：10000E1：10000Ach阿托品+Ach第23頁/共38頁第24頁/共38頁第25頁/共38頁第26頁/共38頁CaCl2灌流第27頁/共38頁第28頁/共38頁第29頁/共38頁KCl灌流第30頁/共38頁第31頁/共38頁第32頁/共38頁1:10000E灌流4期If、ICaT通道↑4期自動(dòng)去極速度↑自律性↑心率↑與心肌β1受體結(jié)合Ca2+內(nèi)流↑肌漿網(wǎng)釋放Ca2+↑興奮-收縮耦聯(lián)↑收縮力↑c(diǎn)AMP第33頁/共38頁第34頁/共38頁第35頁/共38頁1:10000Ach灌流與心肌M受體結(jié)合K+外流↑,Ca2+內(nèi)流↓E-C耦聯(lián)↓收縮力↓最大復(fù)極電位↑

4期K+外流↑

自律性↓心率↓[Ca2+]i↓第36頁/共