微生物應用技術1

微生物應用技術曹理想中山大學生物化學系主要內容：前言微生物多樣性與微生物資源開發(fā)技術發(fā)酵培養(yǎng)與下游技術育種技術檢測技術藥物篩選技術細菌生物膜與細菌信號傳導燃料電池與生物傳感器生物轉化技術疫苗前言微生物的特性：1、體積小、面積大2、吸收多、轉化快3、生長旺、繁殖快4、易變異、適應強5、種類多、分布廣第一章微生物多樣性與微生物資源開發(fā)利用1微生物多樣性分類多樣性：古細菌（產甲烷細菌、極端嗜鹽菌、極端嗜熱菌）真細菌（有11個分支，目前在生物技術上重要的菌種屬于革蘭氏陽性菌與紫細菌）紫細菌（蛋白細菌proteobacteria)包括紫色光合細菌與非光合型的革蘭氏陰性菌，分為四個亞門（α、β、γ、δ）α亞門：土壤桿菌屬、根瘤菌屬、立克次氏體屬β亞門：硫桿菌屬γ亞門：腸桿菌科及某些假單胞菌革蘭氏陽性菌低GC含量的多為梭菌、芽孢桿菌、乳酸菌、葡萄球菌等高GC含量為放線菌群微生物，有三類：1、長而細的桿狀細菌（節(jié)桿菌屬、纖維單胞菌屬）與球狀的微球菌屬2、棒狀桿菌—分枝桿菌—諾卡氏菌3、鏈霉菌屬及其近緣種1微生物多樣性分類多樣性功能多樣性化學多樣性（代謝物結構多樣性）2微生物資源開發(fā)利用2.1歷史1、釀酒業(yè)、面包業(yè)2、50－60年代，大規(guī)模開發(fā)與發(fā)酵工業(yè)興起目前利用方式：1、微生物菌體利用2、微生物代謝物利用3、微生物特性利用4、其他（廢物資源再利用、工業(yè)污染廢物降解與凈化）2.2微生物資源開發(fā)利用技術在科學上榮譽屬于那些征服世界的人，而不屬于首先產生這種觀念的人，著名人物往往是征服了世界的人們—他們發(fā)展一種技術、一種工具，或者提出一個受到普遍采納的概念，或清楚地解釋他們的發(fā)現(xiàn)，從而促進科學的發(fā)展和繁榮。2.2微生物資源開發(fā)利用技術1、顯微鏡技術2、無菌技術3、純種分離技術4、純培養(yǎng)技術5、通氣攪拌的好氣性發(fā)酵工程技術6、人工誘變育種與代謝控制發(fā)酵工程技術7、發(fā)酵動力學、發(fā)酵的連續(xù)化自動化工程技術8、微生物酶反應生物合成和化學合成反應相結合純培養(yǎng)技術與科赫法則的不足不了解病毒兩種以上微生物在致病方面與干酪發(fā)酵過程的協(xié)同作用對海洋微生物、瘤胃微生物、腸道微生物的研究需掌握微生物類群的生態(tài)關系9其他微生物研究技術維諾格拉德斯基分離到硫細菌、鐵細菌與硝化細菌；設計硅膠平板并改進直接觀察土壤微生物的技術。貝格林克證實藍藻具有固氮能力，分離出根瘤菌純培養(yǎng)，證實TMV通過植物汁液傳播其他微生物研究技術伊萬諾夫斯基證知TMV的存在，發(fā)現(xiàn)超顯微微生物世界梅契尼科夫細胞免疫P.Ehrlich體液免疫、并提出化學治療概念10微生物藥物研究歷史弗萊明Wansman鏈霉素Chain（半合成抗生素）6-APA;7-ACA;7-ADCA梅澤濱夫提出酶抑制劑概念酶抑制劑Bestatin可抑制蛋白酶活性，可增強免疫反應洛伐他丁與普伐他丁為HMG-CoA還原酶抑制劑，降低血液膽固醇濃度免疫抑制劑環(huán)孢菌素A，F(xiàn)K506，雷帕霉素受體拮抗劑aspercilin與L－156當前尋找藥物的熱點：建立新的篩選模型，尋找新活性物質利用基因工程技術構建產生新次級代謝物的工程菌擴大微生物來源應用定向生物合成和突變生物合成的原理尋找新的代謝物對已知化合物進行化學改造11厭氧菌研究技術燭罐培養(yǎng)技術鋼絲絨技術、厭氧轉管法和預還原技術瓶皿法及厭氧手套箱厭氧菌的種類根據(jù)對氧氣的耐受性，分為三類：專性厭氧菌、微需氧菌與兼性厭氧菌。專性厭氧菌指不能利用分子氧作為電子終末受體，只能在低氧分壓、低氧化還原電位下才能生長的細菌，分為三類：1、極端厭氧菌：空氣中10分鐘立即死亡2、中等厭氧菌：空氣中60－90分鐘死亡3、耐氧厭氧菌：有氧條件下生長差、厭氧條件下生長好微需氧菌指在5％－10％CO2條件下才能生長很好的細菌，如彎曲菌、乳桿菌。12分子細菌學研究從分子的、基因的、基因調控和表達的水平上研究細菌生命活動的基本現(xiàn)象和原理。分子細菌學與普通細菌學的區(qū)別分子細菌學基因型現(xiàn)象與導致原因化學本質的，基因產物修飾水平上普通細菌學表型現(xiàn)象細胞的，至多在某種因子水平分子細菌學與普通細菌學的區(qū)別在細菌分類、鑒定方面細菌毒力因子和致病機制菌苗發(fā)展細菌與環(huán)境分子微生態(tài)學分子細菌學研究方法以普通細菌學的觀察為基礎把表現(xiàn)型－基因型－基因產物聯(lián)系起來基因缺失技術是研究基因功能的最佳方法電子計算機技術基因和菌株的改造13細菌基因組學核苷酸和氨基酸的相似性和同源性不一定意味著功能的相似性幾種菌的純培養(yǎng)分離方法弗蘭克氏菌海洋沉積物異養(yǎng)菌（Science296:1127-1129,2002)海洋浮游細菌(Nature418:630-633,2002)傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)缺陷通用培養(yǎng)基對大多數(shù)極端環(huán)境下難培養(yǎng)微生物(99%以上)沒有選擇性。培養(yǎng)條件很難與自然條件一致。對微生物領域認識的局限。極端環(huán)境微生物培養(yǎng)方法歸納模擬自然環(huán)境分離獲得純培養(yǎng)。采用熒光標記已探測菌基因，追蹤分離。極端營養(yǎng)研究，實現(xiàn)微生物分離培養(yǎng)。Isolating“Uncultivable”MicroorganismsinPureCultureinaSimulatedNaturalEnvironmentT.Kaeberlein,K.Lewis,S.S.EpsteinBiologyDepartment,NortheasternUniversity,Boston,MA02115,USA;MarineScienceCenter,NortheasternUniversity,Nahant,MA01908,USA.Science,2002Vol.296,1127-1129

作者依據(jù)膜過濾原理和固定化技術，設計了一種新型的培養(yǎng)方式。在自然環(huán)境中，營養(yǎng)物質和代謝廢物能通過膜，而細菌則在固定化培養(yǎng)過程中形成菌落。對于其生長機理的研究則有利于對環(huán)境中微生物的未可培養(yǎng)機理進行探討。研究結果通過這種培養(yǎng)方法培養(yǎng)出來的微生物中（86±7）％以上在培養(yǎng)皿上不能得到培養(yǎng)。其中得到能夠在常規(guī)方法純培養(yǎng)的都屬于生長速度相對比較快速的微生物。通過這種新方法分離得到了新目級別的新物種。其中的一株菌MSC1不能在培養(yǎng)皿上獨立生存，只有和其他的細菌（MSC2，MSC4或MSC5）一起才能維持生存。CultivationoftheubiquitousSAR11

marinebacterioplankton

cladeMichaelS.Rappe,StephanieA.Connon,KevinL.Vergin

&StephenJ.Giovannoni

DepartmentofMicrobiology,OregonStateUniversity,Corvallis,Oregon97331,USA

Nature,2002,Vol.418,630-633研究過程通過DNA檢測，首先發(fā)現(xiàn)SAR11類細菌在海洋中大量存在。設計該菌種的特異探針，并對其熒光標記，找到該菌位置。對培養(yǎng)方法的探索，使該菌得到增殖達到分離并純培養(yǎng)。研究結論SAR11細菌是目前發(fā)現(xiàn)的最小的細菌（0.01μm3）。其與目前已知的－蛋白細菌的最高相似度只有82％，是一類全新的物種。與普通細菌相比，SAR11類細菌偏好于無機營養(yǎng)成分，而不是復合有機養(yǎng)料。NewStrategiesforCultivationandDetectionofPreviously

UnculturedMicrobesBradleyS.Stevenson,*StephanieA.Eichorst,JohnT.Wertz,ThomasM.Schmidt,andJohnA.BreznakDepartmentofMicrobiologyandMolecularGenetics,MichiganStateUniversity,

EastLansing,Michigan

AppliedandEnviromental

Microbiology,2004,Vol.70

4748–4755設計了針對分離目標Acidobacteria

和Verrucomicrobia的PCR引物，同時對照洗脫培養(yǎng)皿和培養(yǎng)孔板進行PCR反應，確定培養(yǎng)目標，然后進行培養(yǎng)篩選，最后在使目標達到了純培養(yǎng)。極大地減少了培養(yǎng)過程中的盲目性，提高了實驗效率。結論與思考不同的微生物之間的培養(yǎng)方法有極大的差異，因此對極端難培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)不能“一刀切”。在研究培養(yǎng)方法時要充分借鑒其原始的生活環(huán)境和生理條件。現(xiàn)有的分子生物學探測微生物多樣性方面仍可能存在缺陷，未知基因的存在？未知微生物存在的可能性？微生物本身生理情況？生長速度的局限？極端環(huán)境微生物培養(yǎng)之未來極端環(huán)境微生物是一大類超越人們想象的豐富的未開發(fā)資源。得到菌株，實現(xiàn)培養(yǎng)將為人類開發(fā)這資源提供更廣闊的空間。對其獲得純培養(yǎng)需要突破傳統(tǒng)的分離觀念，在方法學上下功夫。某些特殊情況下純培養(yǎng)是難以實現(xiàn)的，而共培養(yǎng)、共代謝是極端環(huán)境