PCR技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用

主要參考書

CW迪芬巴赫

、GS德弗克斯勒［美］主編。《PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》黃留玉主編。《PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用》尹一兵主編?！斗肿釉\斷學(xué)》現(xiàn)在是1頁\一共有101頁\編輯于星期一多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerasechainreaction，PCR）PCR技術(shù)的原理PCR技術(shù)的衍生技術(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)PCR技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)在是2頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因?，F(xiàn)在是3頁\一共有101頁\編輯于星期一1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR技術(shù)的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍MOVIEPCR反應(yīng)過程PCR的特點(diǎn)PCR的操作步驟現(xiàn)在是4頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃現(xiàn)在是5頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物現(xiàn)在是6頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶現(xiàn)在是7頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束95℃第2輪開始現(xiàn)在是8頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃TaqTaqTaqTaq現(xiàn)在是9頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束現(xiàn)在是10頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

重復(fù)30輪后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417現(xiàn)在是11頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善但測(cè)序和引物合成的困難70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……現(xiàn)在是12頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）實(shí)現(xiàn)了在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制。然而，采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)現(xiàn)在是13頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR技術(shù)簡(jiǎn)史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，特異性、真實(shí)性也較高，但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。

耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀現(xiàn)在是14頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR技術(shù)的基本原理PCR反應(yīng)過程PCR的特點(diǎn)PCR的操作步驟靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞細(xì)菌、病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)拷貝簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，1～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體液、洗嗽液、毛發(fā)、活組織、細(xì)胞、石蠟包塊、古生物標(biāo)本等的粗提DNA現(xiàn)在是15頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR技術(shù)的基本原理PCR反應(yīng)過程PCR的特點(diǎn)PCR的操作步驟標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L現(xiàn)在是16頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR技術(shù)的基本原理PCR反應(yīng)過程PCR的特點(diǎn)PCR的操作步驟現(xiàn)在是17頁\一共有101頁\編輯于星期一設(shè)置反應(yīng)程序(1)94℃變性5min，(2)94℃變性1min，(3)52℃退火1min，(4)72℃延伸1min。

(5)72℃延伸10min。重復(fù)(2)-(4)30次現(xiàn)在是18頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR結(jié)果：1、對(duì)照(無模板)；2－6、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）PCR產(chǎn)物的電泳鑒定現(xiàn)在是19頁\一共有101頁\編輯于星期一（1）模板單、雙鏈DNA均可，多種來源。質(zhì)量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般人基因組100ngDNA模板（100L）。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)的影響因素

1)反應(yīng)體系Lambda

DNA，模板量分別為100

pg,

10pg,

1pg,

100fg

,

10fg

現(xiàn)在是20頁\一共有101頁\編輯于星期一（2）引物引物是與待擴(kuò)增DNA片斷兩翼互補(bǔ)的一段特異的寡核苷酸片斷。引物是PCR反應(yīng)中最關(guān)鍵的因素，因此引物序列的設(shè)計(jì)對(duì)于PCR是否成功是非常重要的。

現(xiàn)在是21頁\一共有101頁\編輯于星期一1.引物長(zhǎng)度：

以18-24bp為宜。2.堿基均衡分布：

四種堿基盡可能隨機(jī)分布；G+C占40-60%，上下游引物應(yīng)基本一致。3.避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)：

發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體。4.引物的兩端：

3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。引物設(shè)計(jì)的原則：現(xiàn)在是22頁\一共有101頁\編輯于星期一3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記現(xiàn)在是23頁\一共有101頁\編輯于星期一5.引物的特異性：

引物序列應(yīng)避免在模板內(nèi)有較高相似性的系列，尤其是3’末端。可以在www.ncbi.nih/blast.cgi%E8%BF%9B%E8%A1%8C%E5%9C%A8%E7%BA%BF%E6%AF%94%E8%BE%83%E6%88%96%E9%80%9A%E8%BF%87OMIGA進(jìn)行在線比較通過OMIGA、ClustalX等軟件進(jìn)行兩兩或多序列的比較。引物序列同源性比對(duì)：現(xiàn)在是24頁\一共有101頁\編輯于星期一引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)常用軟件主要有：PrimerPremier5.0Oligo6primer3ThePrimerGeneratorNetPrimer現(xiàn)在是25頁\一共有101頁\編輯于星期一1.將序列輸入軟件中（2）在表中粘貼序列（1）新序列兩個(gè)方法現(xiàn)在是26頁\一共有101頁\編輯于星期一選擇序列文件所在位置（2）打開原有的序列文件現(xiàn)在是27頁\一共有101頁\編輯于星期一在對(duì)話框中輸入待擴(kuò)增序列點(diǎn)擊左上角的“Primer”按鈕現(xiàn)在是28頁\一共有101頁\編輯于星期一2.設(shè)置相關(guān)參數(shù)現(xiàn)在是29頁\一共有101頁\編輯于星期一3.得到的引物結(jié)果現(xiàn)在是30頁\一共有101頁\編輯于星期一Hairpin:引物自身是否會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer:同一種引物是否會(huì)形成二聚體Falseprimiring:引物在待擴(kuò)增序列中其他位置是否有配對(duì)CrossDimer:正向與反向引物間是否會(huì)形成二聚體正向和反向引物的互換正向和反向引物的評(píng)價(jià)正向和反向引物的信息每點(diǎn)擊左邊紅色的按鈕，就出現(xiàn)相應(yīng)的內(nèi)容對(duì)正向和反向引物進(jìn)行編輯現(xiàn)在是31頁\一共有101頁\編輯于星期一可對(duì)引物進(jìn)行增加或減少堿基用鍵盤輸入5個(gè)堿基現(xiàn)在是32頁\一共有101頁\編輯于星期一引物的信息改動(dòng)后引物的信息現(xiàn)在是33頁\一共有101頁\編輯于星期一重新回到雙引物的界面現(xiàn)在是34頁\一共有101頁\編輯于星期一“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”5'CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA3'4.輸出引物序列現(xiàn)在是35頁\一共有101頁\編輯于星期一引物純度：公司合成引物常用的純化方式C18脫鹽、OPC純化、PAGE純化、HPLC純化。普通PCR：OPC純（>95%）較長(zhǎng)引物（大于50個(gè)堿基）：PAGE純（>95%）經(jīng)過修飾或標(biāo)記的引物：HPLC純（>99%,但價(jià)格昂貴）引物濃度：0.1-0.5mol/L，濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配，反應(yīng)特異性下降?，F(xiàn)在是36頁\一共有101頁\編輯于星期一

合成內(nèi)容產(chǎn)量(OD)發(fā)貨時(shí)間(工作日)純化方式價(jià)格(￥)普通引物合成(<60base)23PAGE1.60/base2~53OPC1.30/base5~105PAGE2.20/base3OPC1.80/base205PAGE4.00/base3OPC3.20/base305PAGE5.80/base3OPC4.60/base506PAGE10.00/base4OPC8.00/base1007PAGE詢價(jià)5OPC詢價(jià)長(zhǎng)鏈合成(60~90base)25PAGE3.50/base長(zhǎng)鏈合成(90~120base)25PAGE5.00/base***生物科技有限公司的引物合成服務(wù)現(xiàn)在是37頁\一共有101頁\編輯于星期一（3）耐熱DNA聚合酶1）TaqDNA聚合酶（Taqpolymerase）：95℃的半壽期為40min最適溫度（72℃）時(shí)每個(gè)酶分子每秒可催化合成150個(gè)核苷酸酶活性（受多種因素影響）：5’→3’方向的聚合酶活性，5’→3’方向的外切酶活性和逆轉(zhuǎn)錄酶活性，非模板依賴性活性，可在雙鏈PCR產(chǎn)物每一條鏈的3‘端加上單核苷酸尾，使PCR產(chǎn)物的3’端突出一個(gè)單A核苷酸尾現(xiàn)在是38頁\一共有101頁\編輯于星期一TthDNA聚合酶：在高溫和MnCl2存在的條件下，能有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA。用于一步法RT-PCR。VentDNA聚合酶：又稱TliDNA聚合酶，該酶耐高溫且具有3‘-5’外切酶活性的校對(duì)功能，其保真性較TaqDNA聚合酶高一倍。該酶擴(kuò)增長(zhǎng)片斷（>12kb）的功能較強(qiáng)。PfuDNA聚合酶：具有3’→5’外切酶活性的校對(duì)功能，催化DNA合成的忠實(shí)性比Taq聚合酶高12倍，但不適于>2kb的片斷擴(kuò)增。2）其他的耐熱聚合酶現(xiàn)在是39頁\一共有101頁\編輯于星期一（4）dNTP四種dNTP濃度應(yīng)相等dNTP濃度：100~200μmol/L濃度過高，影響DNA聚合酶的活性，且易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量。UNG酶可降解dUTP替代擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)在是40頁\一共有101頁\編輯于星期一（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。dNTP、EDTA等負(fù)離子的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性?，F(xiàn)在是41頁\一共有101頁\編輯于星期一2）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈95oC20-30秒(2)退火溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合，降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。現(xiàn)在是42頁\一共有101頁\編輯于星期一（3）延伸70-75oC，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低，錯(cuò)誤摻入率增加現(xiàn)在是43頁\一共有101頁\編輯于星期一二、PCR的衍生技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）

反向PCR（inversePCR）

巢氏PCR（nestingPCR）

原位PCR（insituPCR）多重PCR（multiplexPCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）

不對(duì)稱PCR（asymmertricPCR）

錨定PCR（anchoredPCR）

長(zhǎng)片段PCR（longfragmentPCR）熒光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）現(xiàn)在是44頁\一共有101頁\編輯于星期一逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增1、逆轉(zhuǎn)錄PCR

(reversetranscription-PCR,RT-PCR)

現(xiàn)在是45頁\一共有101頁\編輯于星期一影響因素（1）模板對(duì)RT-PCR的影響對(duì)RNA制品的純度和完整性要求都極為嚴(yán)格（2）逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RT-PCR的影響MLV逆轉(zhuǎn)錄酶能合成大于2kb的較長(zhǎng)cDNA，但對(duì)熱的穩(wěn)定性較AMV逆轉(zhuǎn)錄酶差。（3）逆轉(zhuǎn)錄引物對(duì)RT-PCR的影響隨機(jī)引物：原核細(xì)胞多用oligo(dT)：真核細(xì)胞多用基因特異性的引物（GSP）：特異性強(qiáng)，廣譜性低現(xiàn)在是46頁\一共有101頁\編輯于星期一例子：S.pn的轉(zhuǎn)化對(duì)PsaA基因mRNA表達(dá)的影響a、RNA的提取：野生型和轉(zhuǎn)化缺陷型S.pn都誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，采用Qiagen試劑盒進(jìn)行總RNA提取。b、cDNA的制備：取RNA2μl，隨機(jī)引物1μl，DEPC水9μl，混勻后，70℃變性5min，立即置于冰上。然后順序加入逆轉(zhuǎn)錄buffer5μl，dNTP1.5μl,RNasin0.5μl,DEPC水5μl,逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV1μl?；靹蚝笥?7℃，1小時(shí)，得到cDNA。c、PCR擴(kuò)增:

PsaA的引物3μL，cDNA1μL，Tagplus酶0.2μL，共30μL體系。循環(huán)參數(shù)：94℃30秒，55℃40秒，72℃45秒，循環(huán)30次。用16srRNA的PCR產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)物，2%瓊脂糖電泳。現(xiàn)在是47頁\一共有101頁\編輯于星期一

電泳結(jié)果用軟件Quantity-one3.2進(jìn)行半定量比較，結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析16S(463bp)PsaA(254bp)圖2，2號(hào)菌株及其轉(zhuǎn)化缺陷菌株在加入CSP后的不同時(shí)間PsaAmRNA的表達(dá)。

1234567圖1，2號(hào)菌株及其轉(zhuǎn)化缺陷菌株在加入CSP后的不同時(shí)間PsaA的RT-PCR電泳圖。line1:Marker2.line2-4:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2wasaddedCSP.line5-7:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2dwasaddedCSP.

***現(xiàn)在是48頁\一共有101頁\編輯于星期一2、反向PCR(inversePCR)

用反向的引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用：（1）用于測(cè)序的DNA大片段的克隆（2）獲得啟動(dòng)子序列（3）小質(zhì)粒的定點(diǎn)突變（4）鑒定插入失活基因或體內(nèi)誘導(dǎo)基因現(xiàn)在是49頁\一共有101頁\編輯于星期一已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶反向PCR示意圖現(xiàn)在是50頁\一共有101頁\編輯于星期一轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，提取質(zhì)粒，采用質(zhì)粒引物即可直接對(duì)X片斷進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，得到X基因序列信息。（10/64）EGFPXdw序列Xdw序列質(zhì)粒引物質(zhì)粒引物質(zhì)粒引物例子：S.pn體內(nèi)誘導(dǎo)基因序列的獲得現(xiàn)在是51頁\一共有101頁\編輯于星期一3、多重PCR(multiplexPCR)

用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物現(xiàn)在是52頁\一共有101頁\編輯于星期一圖1第1、2、3組引物多重PCR電泳圖

1：正常對(duì)照；2：DL2000marker；3~10：檢出的缺失型患者杜氏/貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥一種常見的致死性神經(jīng)-肌肉系統(tǒng)的X連鎖隱性遺傳病，其基因突變中缺失最常見，約占55%~65%，缺失分布的位點(diǎn)較多，隨地域及民族的差異而有不同特點(diǎn)現(xiàn)在是53頁\一共有101頁\編輯于星期一4、突變PCR（1）隨機(jī)突變：應(yīng)用：構(gòu)建突變體文庫，繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個(gè)體策略：易錯(cuò)PCR（error-pronePCR）。利用TaqDNA聚合酶等耐熱DNA聚合酶不具有3′→5′校對(duì)功能的特性，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中可能摻入錯(cuò)誤的核苷酸，從而產(chǎn)生隨機(jī)錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物。加入次黃嘌呤核苷酸并限制某一種核苷酸的用量，從而促進(jìn)DNA聚合酶選擇其它3種核苷酸或次黃嘌呤核苷酸，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生突變?，F(xiàn)在是54頁\一共有101頁\編輯于星期一（2）定點(diǎn)突變（1）5‘端引入突變：通過修飾上游引物的5’端，即可引入標(biāo)記的堿基、限制性酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列等。（2）序列中的單位點(diǎn)突變：采用重疊延伸PCR(OverlapExtensionPCR，OEPCR)現(xiàn)在是55頁\一共有101頁\編輯于星期一（A）為5‘端引入突變（B）為單堿基突變現(xiàn)在是56頁\一共有101頁\編輯于星期一例子：S.pn的ply146aa缺失的突變序列構(gòu)建S.Pn的ply為一細(xì)胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大減弱。構(gòu)建突變體作為疫苗：首先設(shè)計(jì)4個(gè)引物：（M1和M2完全重疊）P1:5’-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3’BamHIP2:5’-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3’XhoIM1:5’-GGTCAATAATGTCCCAAGAATGCAGTATG-3’M2:5’-CATACTGCATTCTTGGGACATTATTGACC-3’現(xiàn)在是57頁\一共有101頁\編輯于星期一突變位點(diǎn)M2M1P2P15’5’5’3’3’5’為酶切位點(diǎn)序列以基因組DNA為模板，以P1和M1為引物擴(kuò)增出ply上游片斷，以P2和M2為引物擴(kuò)增出ply下游片斷以上下游片斷為模板，以P1和P2為引物，擴(kuò)出全長(zhǎng)酶切后克隆到質(zhì)粒中保存現(xiàn)在是58頁\一共有101頁\編輯于星期一（3）多位點(diǎn)突變策略：多次重疊PCR關(guān)鍵：重疊引物的設(shè)計(jì)（每對(duì)突變引物需要部分重疊，方向相反）?，F(xiàn)在是59頁\一共有101頁\編輯于星期一5、原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由Hasse等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測(cè)手段來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列。現(xiàn)在是60頁\一共有101頁\編輯于星期一操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)現(xiàn)在是61頁\一共有101頁\編輯于星期一三、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程；結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量?，F(xiàn)在是62頁\一共有101頁\編輯于星期一如何定量？Ct值的概念Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。為什么要用Ct值定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性?，F(xiàn)在是63頁\一共有101頁\編輯于星期一C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；C(t)值具重現(xiàn)性現(xiàn)在是64頁\一共有101頁\編輯于星期一熒光強(qiáng)度循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系現(xiàn)在是65頁\一共有101頁\編輯于星期一定量原理初始DNA量越多,熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少（Ct值）Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量確定初始模板的濃度現(xiàn)在是66頁\一共有101頁\編輯于星期一1、熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)現(xiàn)在是67頁\一共有101頁\編輯于星期一5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

1）內(nèi)摻式染料現(xiàn)在是68頁\一共有101頁\編輯于星期一5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

現(xiàn)在是69頁\一共有101頁\編輯于星期一優(yōu)點(diǎn)使用方便 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物沒有序列特異性可以用于不同的模板便宜靈敏現(xiàn)在是70頁\一共有101頁\編輯于星期一例子：熒光定量PCR檢測(cè)肺炎鏈球菌comE基因轉(zhuǎn)錄水平方法流程：1、標(biāo)準(zhǔn)品制備：普通PCR擴(kuò)增出comE基因片斷→裝入克隆質(zhì)?！肯♂尀?09拷貝作為標(biāo)準(zhǔn)品備用2、定量檢測(cè)comE基因表達(dá)水平：提取RNA→逆轉(zhuǎn)錄成cDNA→與成10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品一起作為模板，同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR→根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果→得到其表達(dá)的絕對(duì)量?，F(xiàn)在是71頁\一共有101頁\編輯于星期一圖1comE基因熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖2comE基因熒光定量PCR融解曲線表1D39菌株在CSP誘導(dǎo)后不同時(shí)間的comE基因mRNA表達(dá)批次comE/16SrRNA0min10min*20min10.03410.95200.040220.19741.20470.111230.01240.40730.0160*：p<0.05，CSP誘導(dǎo)10min時(shí)comE的表達(dá)量較0min和20min時(shí)顯著增高實(shí)驗(yàn)結(jié)果：現(xiàn)在是72頁\一共有101頁\編輯于星期一Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）2）序列特異性探針現(xiàn)在是73頁\一共有101頁\編輯于星期一雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）現(xiàn)在是74頁\一共有101頁\編輯于星期一優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性特別適合于SNP檢測(cè)與MolecularBeacons相比設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單是目前應(yīng)用最廣泛的一種技術(shù)TACCGGGGGTTACGAACGGTAATGA

T

C

CTA

CCG

A

T

C

C

C

A

CCSNP檢測(cè)現(xiàn)在是75頁\一共有101頁\編輯于星期一RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）現(xiàn)在是76頁\一共有101頁\編輯于星期一5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針（AmplifluorProbe）3）引物特異性探針現(xiàn)在是77頁\一共有101頁\編輯于星期一2、熒光定量實(shí)時(shí)PCR與普通PCR的比較靈敏度高：熒光檢測(cè)較電泳檢測(cè)靈敏度高特異性高：引物和熒光探針定量準(zhǔn)確：全程監(jiān)控，準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量無需跑膠，自動(dòng)化程度高封閉體系，環(huán)境污染少現(xiàn)在是78頁\一共有101頁\編輯于星期一4通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀3、熒光定量PCR儀熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。現(xiàn)在是79頁\一共有101頁\編輯于星期一韓健:iCubate分子診斷平臺(tái)靶序列富集多重PCR(Tem-PCR,

targetenrichedmultiplexPCR)具有兼容性、特異性、敏感性、半定量、靈活性、高效性適合于分子鑒別診斷方法的開發(fā)。

現(xiàn)在是80頁\一共有101頁\編輯于星期一

PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)PCR只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念?！?/p>

它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnology

byPaulRabinow]現(xiàn)在是81頁\一共有101頁\編輯于星期一PCR技術(shù)的應(yīng)用研究與生產(chǎn)基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，腫瘤診斷法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析其他……現(xiàn)在是82頁\一共有101頁\編輯于星期一1)基因克隆重組質(zhì)粒質(zhì)粒DNA基因片段酶切PCR擴(kuò)增染色體DNA連接現(xiàn)在是83頁\一共有101頁\編輯于星期一基因工程產(chǎn)品大腸桿菌胰島素重組體

+胰島素基因染色體DNAPCR擴(kuò)增現(xiàn)在是84頁\一共有101頁\編輯于星期一我國(guó)已批準(zhǔn)生產(chǎn)的部分生物技術(shù)藥物名稱作用rhuEPO產(chǎn)生紅細(xì)胞rhuIFNα1b(外用)病毒性角膜炎rhuIFNα1b乙肝、丙肝rhuIFNα2a乙肝、丙肝、皰疹等rhuIFNα2a(酵母)乙肝、丙肝rhuIFNα2b乙肝、丙肝白血病等rhuIFNα2a(栓劑)婦科病rhuIFNα2b(凝膠劑)皰疹等rhuIFNγ類風(fēng)濕人胰島素糖尿病rhuG－CSF刺激產(chǎn)生白細(xì)胞rhuGM－CSF刺激產(chǎn)生白細(xì)胞、骨髓移植rhuGH矮小病乙肝疫苗預(yù)防乙肝rhuEGF(外用)燒傷、創(chuàng)傷EGF衍生物燒傷、創(chuàng)傷rhuIL2癌癥輔助治療rhuIL2125Ser癌癥輔助治療bFGF(外用)創(chuàng)傷、燒傷RSK溶血栓(心梗)抗IL28單抗乳膏劑銀屑病痢疾疫苗預(yù)防痢疾現(xiàn)在是85頁\一共有101頁\編輯于星期一Sequencingbysynthesis(Illumina/Solexa)：readlength80-150bp,1G/run.2)基因測(cè)序dioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=35total1stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextensionPCRPCR現(xiàn)在是86頁\一共有101頁\編輯于星期一3)基因檢測(cè)A’內(nèi)源性病變基因正常人A病人外源性基因正常人(-)病人(+)現(xiàn)在是87頁\一共有101頁\編輯于星期一β-地中海貧血癥

擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS）進(jìn)行檢測(cè)（1）內(nèi)源性基因檢測(cè)—遺傳病的診斷現(xiàn)在是88頁\一共有101頁\編輯于星期一現(xiàn)在是89頁\一共有101頁\編輯于星期一300bp1000bp800bp圖1，β珠蛋白ARMS檢測(cè)結(jié)果11、2分別為正常樣本的N產(chǎn)物和M產(chǎn)物，3、5、7為檢測(cè)樣本的N產(chǎn)物,4、6、8為相應(yīng)M產(chǎn)物。圖2，β珠蛋白ARMS檢測(cè)結(jié)果21為N產(chǎn)物，2為M產(chǎn)物對(duì)照產(chǎn)物861bp現(xiàn)在是90頁\一共有101頁\編輯于星期一囊性纖維化病(CF)

現(xiàn)在是91頁\一共有101頁\編輯于星期一鐮刀型細(xì)胞貧血癥

現(xiàn)在是92頁\一共有101頁\編輯于星期