重組人生長(zhǎng)激素可比性研究報(bào)告

歡迎閱讀本文檔，希望本文檔能對(duì)您有所幫助!歡迎閱讀本文檔，希望本文檔能對(duì)您有所幫助!歡迎閱讀本文檔，希望本文檔能對(duì)您有所幫助!歡迎閱讀本文檔，希望本文檔能對(duì)您有所幫助!歡迎閱讀本文檔，希望本文檔能對(duì)您有所幫助!歡迎閱讀本文檔，希望本文檔能對(duì)您有所幫助!摘要研究背景：在研發(fā)過(guò)程中或正式批準(zhǔn)后生物制品的生產(chǎn)商經(jīng)常會(huì)發(fā)生一些變更。變更的原因?yàn)楦倪M(jìn)生產(chǎn)工藝、增大規(guī)模、擴(kuò)建/新建車(chē)間、提高產(chǎn)品穩(wěn)定性和符合法規(guī)規(guī)定。當(dāng)發(fā)生這些變更時(shí)，生產(chǎn)商通常需要評(píng)價(jià)產(chǎn)品的相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)，以證明變更沒(méi)有對(duì)藥品的安全和有效性產(chǎn)生不利的影響。研究目的：通過(guò)新建車(chē)間和老車(chē)間生產(chǎn)的注射用重組人生長(zhǎng)激素比較研究，分析兩個(gè)車(chē)間注射用重組人生長(zhǎng)激素產(chǎn)品質(zhì)量是否有差異，證明新車(chē)間產(chǎn)品是安全性和有效性。研究方法：1、工藝的研究：根據(jù)老車(chē)間的歷史數(shù)據(jù)，從被變更的工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性的關(guān)系出發(fā)，在確定關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵物料屬性的基礎(chǔ)上，研究是否由于變更而導(dǎo)致終產(chǎn)品質(zhì)量的改變。2、所涉及廠房的評(píng)估：根據(jù)工藝研究結(jié)果對(duì)涉及到的變更進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，對(duì)變更的潛在影響進(jìn)行分析。3、產(chǎn)品安全性和有效性研究：用產(chǎn)品放行標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，通過(guò)比較兩個(gè)車(chē)間原液、半成品和成品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，評(píng)價(jià)兩個(gè)產(chǎn)品的一致性。研究結(jié)果：用產(chǎn)品放行標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，我們以新車(chē)間生產(chǎn)的20批原液和老車(chē)間原液歷史上數(shù)據(jù)為比較的基礎(chǔ)，進(jìn)行了生物學(xué)活性、免疫化學(xué)性質(zhì)，原液純度、雜質(zhì)和污染情況比較，證明兩個(gè)車(chē)間的產(chǎn)品沒(méi)有顯著差異。強(qiáng)制降解試驗(yàn)對(duì)比表明沒(méi)有發(fā)現(xiàn)兩個(gè)車(chē)間原液的降解產(chǎn)物的降解產(chǎn)物種類(lèi)和降解速率有顯著差異。兩個(gè)車(chē)間3批原液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性沒(méi)有顯著差異。結(jié)構(gòu)確證研究表明兩個(gè)車(chē)間的一級(jí)和二級(jí)沒(méi)有差異。大鼠體內(nèi)生物學(xué)活性符合要求，沒(méi)有顯著差異。加速和長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究表明，兩者從雜質(zhì)分布和降解速率上沒(méi)有顯著差異。產(chǎn)品質(zhì)量的相似性主要是由于新車(chē)間的在滿(mǎn)足產(chǎn)品的工藝要求的基礎(chǔ)上，并沒(méi)有關(guān)鍵工藝參數(shù)的變更。發(fā)酵和凍干規(guī)模的放大沒(méi)有對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)的控制產(chǎn)生影響。這些證據(jù)表明新車(chē)間廠房和設(shè)備的驗(yàn)證表明其達(dá)到了設(shè)計(jì)要求，并可以滿(mǎn)足注射用重組人生長(zhǎng)激素的工藝要求。研究結(jié)論：由于市場(chǎng)對(duì)于產(chǎn)品需求增大經(jīng)常導(dǎo)致了廠房變更。用生產(chǎn)注射用重組人生長(zhǎng)激素廠房變更為案例清楚表明：如果設(shè)計(jì)合理，在符合cGMP原則的理念的指導(dǎo)下，通過(guò)產(chǎn)品質(zhì)量放行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行嚴(yán)格的比較學(xué)研究證明了在中國(guó)廠房變更的可實(shí)現(xiàn)性。關(guān)鍵詞：重組人生長(zhǎng)激素；可比性研究；場(chǎng)地變更，新建車(chē)間

ComparabilityStudyofInjectableRecombinantHumanGrowthHormoneProducedfromOriginalFacilityandNewlyBuiltFacilityAbstractBackground:Duetomarketincreaseddemandofbiologicaltherapeutics,anewfacilityisrequiredtomeetthemarketneed.Acriticalsystemicevaluationusingproductqualityspecificationforlotreleaseisdesignedandimplementedfortheproductsproducedfrombothoforiginalfacilityandnewlybuiltfacility.ThishasbeendemonstratedaverysuccessfulapproachforthecasestudyofrecombinanttherapeuticproteinhumangrowthhormoneinShanghai,CHINA.ResearchObjective:ByanalysisandcomparisonoftheCQAoftheproductsproducedfromoriginalfacilityandnewlybuiltfacility,wewouldtoconvinceourselfandChinesedrugapprovalagenciesthatthefacilitychangenotonlymeetourmarketdemand,butmostimportantlyalsomeettherequirementofdrugquality.Methods:Themethodsusedweretheriskanalysisandcontrolforallthepossiblechangesinbio-processduetofacilitychange,andtheeffectsofdifferencesbetweenoriginalfacilityandnewfacilityonthequalityofdrugproduct.Finally,bioassaysandregularanalyticalassayswereusedtoshowthequalitysimilarityofDrugSubstancesandDrugProduct.Results:Ouranalyticaldatausing20lotsofdrugsubstancesfromnewlybuiltfacilitytocomparethedatageneratedforthedrugsubstancesfromtheoriginalfacilityforbiologicalpotency,in-vivoactivity,immunochemicalproperties,purityandimpurityshowsgreatsimilarity.Degradationoftheproductsunderstressconditionsdisplayedsimilarprofilesfordegradationproductsanddegradationrates.Inaddition,ourstructuralanalysisindicatedthesimilarityofprimaryandsecondarystructuresofthefinalproductsfromthebothfacility.AlltheevidencesdeterminedthefacilitychangehasNOnoticeableorveryminimalconcernstomanufactureourcurrentproductoncethecorrectdesignandstrategywereused.Conclusions:Ourcasestudyusinginjectablerecombinanthumangrowthhormoneclearlyindicatedthat,inChina,asuccessfulfacilitychangeforbiologicaltherapeuticswithsimilardrugqualityprocomparisonwiththeoriginalfacilitycanbeachievedifalogicaldesignandcGMPconceptiscorrectlyimplemented.Keywords:recombinanthumangrowthhormone,comparableresearch,facilitychange,newfacility目錄第1章 概述 11.1 重組人生長(zhǎng)激素的發(fā)展歷史 11.2 場(chǎng)地變更的原因 61.3 注射用重組人生長(zhǎng)激素工藝流程 7第2章 研究目的與意義 10第3章 注射用重組人生長(zhǎng)激素產(chǎn)品介紹 103.1 原液的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 113.1.1 重組人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu) 113.1.2 放行標(biāo)準(zhǔn) 123.2 原液的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 123.2.1 重組人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu) 133.2.2 放行標(biāo)準(zhǔn) 143.2.3 生物學(xué)活性 153.2.4 免疫化學(xué)性質(zhì) 153.2.5 強(qiáng)制降解試驗(yàn)和長(zhǎng)期穩(wěn)定性 163.3 半成品的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 163.4 成品的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 16第4章 初步風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 184.1 輸入物料的變更分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 184.2 工藝的變更分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 21第5章 對(duì)比研究結(jié)果 235.1 原液的對(duì)比研究結(jié)果 235.1.1 結(jié)構(gòu)確證 235.1.2 生物學(xué)活性 245.1.3 免疫化學(xué)性質(zhì) 245.1.4 純度、雜質(zhì)和污染 255.1.5 強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果 265.1.6 長(zhǎng)期穩(wěn)定性 275.1.7 工藝驗(yàn)證結(jié)果和討論 285.2 成品的對(duì)比研究結(jié)果 285.2.1 放行檢驗(yàn)結(jié)果 285.2.2 生物學(xué)活性 295.2.3 穩(wěn)定性 295.2.4 半成品的對(duì)比研究結(jié)果 31第6章 可比性研究討論 32第7章 結(jié)論 33概述重組人生長(zhǎng)激素的發(fā)展歷史人生長(zhǎng)激素（hGH）是由腦垂體前葉，含有嗜酸性顆粒的生長(zhǎng)激素（GH）分泌細(xì)胞所分泌，為191個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽類(lèi)激素。正常情況下，生長(zhǎng)激素hGH呈脈沖式分泌，生長(zhǎng)激素（HGH）的分泌受下丘腦產(chǎn)生的生長(zhǎng)激素釋放素(GHRH)的調(diào)節(jié)，還受性別、年齡和晝夜節(jié)律的影響，睡眠狀態(tài)下分泌明顯增加。生長(zhǎng)激素的主要生理功能是促進(jìn)神經(jīng)組織以外的所有其他組織生長(zhǎng)；促進(jìn)機(jī)體合成代謝和蛋白質(zhì)合成；促進(jìn)脂肪分解；對(duì)胰島素有拮抗作用；抑制葡萄糖利用而使血糖升高等作用。生長(zhǎng)激素主要生理作用是對(duì)人體各種組織尤其是蛋白質(zhì)有促進(jìn)合成作用，能刺激骨關(guān)節(jié)軟骨和骨骺軟骨生長(zhǎng)，因而能增高。人體一旦缺乏生長(zhǎng)激素就導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯。1886年P(guān)ierreMarie第一次在臨床上觀察到腦下垂體的功能，發(fā)現(xiàn)在肢端肥大病人中腦下垂體增大。20世紀(jì)約翰霍普金斯醫(yī)院的HarveyCushing第一次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)垂體前葉在人、小鼠和狗中具有促生長(zhǎng)作用[1~4]。1921年，Evans和Long牛垂體前葉的提取物可以刺激正常大鼠的生長(zhǎng)[5]，很快又發(fā)現(xiàn)此提取物可以使去垂體的大鼠保持生長(zhǎng)[6]。促進(jìn)生長(zhǎng)的提取物發(fā)現(xiàn)可以刺激合成代謝效應(yīng)，降低尿中氮、鈣和磷的排泄[7,8]。尿中這些元素的測(cè)定提供了一個(gè)簡(jiǎn)便的生物活性檢測(cè)方法，并用于在垂體提取物中分離活性組分。1944年Li和Evans第一次從牛垂體中分離現(xiàn)在已知為生長(zhǎng)激素的多肽激素[9]。由于牛生長(zhǎng)激素沒(méi)有成功的促進(jìn)人的長(zhǎng)高[10]，因此人們開(kāi)始從尸體或去除垂體的乳腺按患者的垂體中提取人生長(zhǎng)激素[11-13]。在臨床試驗(yàn)中，人和猴子的生長(zhǎng)激素產(chǎn)生了合成代謝，并刺激了長(zhǎng)高[14-15]。猿和非猿的生長(zhǎng)激素的的生物化學(xué)差異被鑒別出來(lái)，同時(shí)解釋了生理效應(yīng)的物種特異性[14]。在1957和1985年之間，從尸體垂體提取的人生長(zhǎng)激素被用于很多生長(zhǎng)激素缺乏兒童的激素替代治療中[16]。在此期間，生長(zhǎng)激素治療發(fā)現(xiàn)是有效并沒(méi)有什么副反應(yīng)。然而，人垂體生長(zhǎng)激素是稀缺和昂貴的。其他治療的應(yīng)用開(kāi)發(fā)，或人生長(zhǎng)激素的細(xì)胞作用機(jī)理的研究時(shí)不可能的?？茖W(xué)的進(jìn)步改變了人生長(zhǎng)激素領(lǐng)域的發(fā)展。人生長(zhǎng)激素的DNA被克隆到了細(xì)菌質(zhì)粒上[17]，從此開(kāi)辟了基因工程人生長(zhǎng)激素商業(yè)化的道路。1985年被報(bào)道[18]發(fā)現(xiàn)兒童期使用人生長(zhǎng)激素的兒童，成年后發(fā)現(xiàn)罹患致命的神經(jīng)退行性疾病-克雅病，因此美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在上世紀(jì)80年代命令停止一切提取自死人腦垂體的hGH，并不準(zhǔn)應(yīng)用于人體上。這一事件促發(fā)了重組人生長(zhǎng)激素在臨床上商業(yè)化使用。隨著在細(xì)菌中大規(guī)模生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素，人生長(zhǎng)激素的供應(yīng)不再成為人體或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行各種治療研究的限制。20世紀(jì)80年代，基因工程興起。1981年Genentech公司利用大腸桿菌（E.Coli）包涵體技術(shù)研制出含192氨基酸的基因重組人生長(zhǎng)激素——Met-rhGH。與天然hGH相比，在N-末端多了一個(gè)蛋氨酸殘基，又稱(chēng)為somatrem(Protropin?)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，1986年通過(guò)基因重組技術(shù)合成出含天然序列的重組人生長(zhǎng)激素。上世紀(jì)90年代人們純化了人生長(zhǎng)激素受體蛋白，并克隆了基因[19,20]。通過(guò)X射線晶體衍射解析了人生長(zhǎng)激素受體蛋白和人生長(zhǎng)激素的相互作用的三維結(jié)構(gòu)[21]。生長(zhǎng)激素受體結(jié)構(gòu)的知識(shí)對(duì)生長(zhǎng)激素信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理的研究提供了新的視野和方向。直接單位點(diǎn)突變技術(shù)被用于對(duì)生長(zhǎng)激素配體-受體相互作用的研究[22]，分子方法也被用于生長(zhǎng)激素受體激動(dòng)劑的設(shè)計(jì)。人生長(zhǎng)激素基因簇大約有66,500個(gè)堿基，位于第17染色體的長(zhǎng)臂上[23]。由GH-N（正常生長(zhǎng)激素基因），CS-L（類(lèi)絨毛膜生長(zhǎng)激素），CS-A（絨毛膜生長(zhǎng)激素A），GH-V（生長(zhǎng)激素變體基因，也是胎盤(pán)生長(zhǎng)激素）和CS-B（絨毛膜生長(zhǎng)激素B）5個(gè)基因家族組成。GH-N和GH-V有時(shí)也稱(chēng)為GH-1和GH-2。絨毛膜生長(zhǎng)激素也是胎盤(pán)催乳素基因。這5個(gè)基因的DNA序列高度同源。因此猜測(cè)生長(zhǎng)激素基因家族通過(guò)基因復(fù)制而產(chǎn)生的。只有GH-N是正常健康必須的。切除或突變GH-N基因引起IA型生長(zhǎng)激素缺乏，這是最嚴(yán)重的生長(zhǎng)激素缺乏。具有這個(gè)缺陷的個(gè)體不能產(chǎn)生內(nèi)源性生長(zhǎng)激素。在出生或出生3~6個(gè)月引起有明顯的重度低血糖和生長(zhǎng)延緩[24]。這些患者初始對(duì)生長(zhǎng)激素替代有響應(yīng)，但治療1年內(nèi)由于生長(zhǎng)激素抗體產(chǎn)生而抑制了生長(zhǎng)。GH-N基因在垂體前葉表達(dá)，是在兒童和成年人中循環(huán)的主要形式[25]。生長(zhǎng)激素是分泌蛋白，它的合成是一個(gè)含26個(gè)氨基酸的激素前體。當(dāng)生長(zhǎng)激素跨過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到貯藏粒中時(shí)信號(hào)肽被切除。GH-N表達(dá)的生長(zhǎng)激素是一個(gè)22kDa，191個(gè)氨基酸的單鏈多肽。生長(zhǎng)激素生物活性構(gòu)象含有兩個(gè)二硫鍵橋。22kDaGH-N基因產(chǎn)物在人的肝臟和受體結(jié)合，并刺激IGF-1的產(chǎn)生和長(zhǎng)高。所有的人生長(zhǎng)激素都是采用注射的方式給藥。皮下和肌內(nèi)注射時(shí)等價(jià)的[26]。因?yàn)橛休^小的疼痛感，皮下注射更好。腹部的皮下注射比大腿的皮下注射有更高的生長(zhǎng)激素血清濃度，然而刺激IGF-1的水平相當(dāng)[27]。在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)生長(zhǎng)激素和高親和的生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白（GHBP）結(jié)合，和這個(gè)蛋白結(jié)合延長(zhǎng)了生長(zhǎng)激素在循環(huán)系統(tǒng)的半衰期。給藥的時(shí)間不影響血清中生長(zhǎng)激素的水平，晚上給藥模擬了生理的生長(zhǎng)激素峰值[28]。生長(zhǎng)激素的清除半衰期大約在2到3小時(shí)之間。通過(guò)在肝臟和腎臟的代謝而清除的，成年人比兒童清除速率更快[29]。人生長(zhǎng)激素是非糖基化的，因此目前國(guó)際上已經(jīng)批準(zhǔn)上市的重組人生長(zhǎng)激素主要是由細(xì)菌（E.Coli）生產(chǎn)的，如Genentech的Nutropin?，EliLilly的Humatrope?，NovoNordisk的Norditrope?等。也有用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的，如Serono的Saizen?；以及由酵母生產(chǎn)的，如LG的Valtropin?。REF_Ref354145858\h表1列出了目前主要重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)商和在美國(guó)和中國(guó)批準(zhǔn)上市的時(shí)間。我國(guó)內(nèi)已上市產(chǎn)品均是由大腸桿菌（E.Coli）生產(chǎn)的。表SEQ表\*ARABIC1主要重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)商生產(chǎn)商商品名美國(guó)批準(zhǔn)日期中國(guó)批準(zhǔn)日期美國(guó)禮來(lái)制藥Humatrope1987年3月2009年6月美國(guó)基因技術(shù)公司Nutropin1993年11月/輝瑞制藥Genotropin1995年8月2009年7月默克雪蘭諾Saizen1996年10月2008年4月諾和諾德制藥有限公司NorditropinFlexpro

2000年6月2008年6月山德士制藥有限公司Omnitrope2006年5月/上海聯(lián)合賽生物工程有限公司珍怡/1999年7月長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司賽增/1998年安徽安科生物工程股份有限公司安蘇萌/1999年*met-hGH已下市重組人生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中的表達(dá)有兩種形式，第一種形式是甲硫氨酸生長(zhǎng)激素m-hGH，他和天然生長(zhǎng)激素有一個(gè)氨基酸的差異，在N端多了一個(gè)甲硫氨酸，美國(guó)基因技術(shù)公司和諾和諾德最初的產(chǎn)品就是m-hGH，目前這種形式的重組人生長(zhǎng)激素已經(jīng)下市。第二種形式是真實(shí)的人生長(zhǎng)激素。一些研究表明甲硫氨酸生長(zhǎng)激素比真實(shí)的人生長(zhǎng)激素產(chǎn)生較高的抗體[30]，美國(guó)禮來(lái)公司的Humatrope是第一個(gè)批準(zhǔn)的和天然序列一致的重組人生長(zhǎng)激素[31]。甲硫氨酸殘基和細(xì)菌蛋白結(jié)合的痕量的人生長(zhǎng)激素比單純的甲硫氨酸人生長(zhǎng)激素產(chǎn)生更高的免疫原性，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)純化而緩解?？贵w的產(chǎn)生很少干擾人生長(zhǎng)激素的生物活性，因?yàn)榭贵w的親和性和濃度均較低[31]。生長(zhǎng)激素抗體水平使得市場(chǎng)不再追隨甲硫氨酸人生長(zhǎng)激素。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的人生長(zhǎng)激素有非常低的免疫原性[32]。目前主要的重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)商均提供的是和天然人生長(zhǎng)激素一致的重組人生長(zhǎng)激素。大多數(shù)生產(chǎn)商采用的是大腸桿菌系統(tǒng)，因?yàn)槟壳芭鷾?zhǔn)上市的產(chǎn)品證明大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的人生長(zhǎng)激素的免疫原性并未對(duì)產(chǎn)品的有效性和安全性產(chǎn)生不利的影響采用大腸桿菌系統(tǒng)是最經(jīng)濟(jì)的，而且大腸桿菌系統(tǒng)已經(jīng)是比較成熟的基因工程技術(shù)，上游構(gòu)建和下游純化均有比較成熟的技術(shù)，工藝控制比較穩(wěn)定。重組人生長(zhǎng)激素是一個(gè)單鏈多肽激素，通常以生物活性的單體存在，但正像大家所知的他易聚集為二聚體，并在熱和機(jī)械應(yīng)力下（如制備過(guò)程中的搖動(dòng)等）轉(zhuǎn)化為多聚體而失去活性。生長(zhǎng)激素的藥物配方趨向于不穩(wěn)定，尤其在溶液中，生長(zhǎng)激素容易生成降解產(chǎn)物，如脫氨和氧化產(chǎn)物。主要的降解反應(yīng)是1）直接水解脫氨或通過(guò)環(huán)狀琥珀酰亞胺中間體而形成L-asp-hGH，L-iso-asp-hGH，D-asp-hGH以及D-iso-asp-hGH；2）在14和125位上甲硫氨酸殘基的氧化；3）聚集；4）肽骨架的截?cái)?。凍干狀態(tài)以及溶液狀態(tài)的生長(zhǎng)激素的主要降解產(chǎn)物是脫氨組分。脫氨發(fā)生在149的Asn天冬酰胺上，在152的天冬酰胺殘基上也會(huì)產(chǎn)生少量的脫氨。在溶液中人生長(zhǎng)激素在14和125位上的甲硫氨酸極易氧化。溶液中hGH氧化形成亞砜主要原因是配方中的溶解氧。蒸餾水中氧氣的溶解度大約是200uM，而對(duì)于4IU/ml的生長(zhǎng)激素來(lái)說(shuō)，其濃度相當(dāng)于60nM。在正常的儲(chǔ)存條件下，溶解氧的量超過(guò)了3000倍生長(zhǎng)激素的化學(xué)計(jì)量，所以是不能通過(guò)塞蓋或包裝前對(duì)緩沖溶液除氣來(lái)解決溶解氧的問(wèn)題。很多降解反應(yīng)多可以通過(guò)凍干從蛋白質(zhì)中移走水分而顯著降低，所以現(xiàn)在生長(zhǎng)激素通常都是凍干的，在4℃以?xún)龈尚问絻?chǔ)存的凍干劑型，使用前再重新溶解，大部分的商品重組人生長(zhǎng)激素是凍干形式的。除了常見(jiàn)的凍干形式制劑外，考慮到使用方便和患者的依從性，人生長(zhǎng)激素的溶液制劑和緩釋制劑的研究也很多。目前國(guó)際上諾和諾德和美國(guó)基因技術(shù)公司均有溶液劑型的生長(zhǎng)激素上市，但由于人生長(zhǎng)激素在溶液中很不穩(wěn)定，因此貨架期要比凍干劑型短很多，而且對(duì)運(yùn)輸?shù)囊笠脖容^高，溶液劑型對(duì)溫度的敏感性比凍干劑型高很多。從二十世紀(jì)八九十年代至今，普遍認(rèn)為在冷凍干燥過(guò)程中冷凍和干燥都會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。Dean[33]認(rèn)為在冷凍過(guò)程中缺少保護(hù)劑的情況下，蛋白質(zhì)將失去活性；而脫水過(guò)程本身能使蛋白質(zhì)損傷，從而復(fù)水后蛋白失去活性。保護(hù)劑的作用一般認(rèn)為是通過(guò)與蛋白的氫鍵作用而保護(hù)了蛋白由于失去水分而裸露的基團(tuán)。保護(hù)劑的濃度和凍干速率相關(guān)，由于對(duì)于藥物制劑來(lái)說(shuō)保護(hù)劑的濃度不能過(guò)高，所以要有較大的凍干速率。人生長(zhǎng)激素制劑的穩(wěn)定性是和水分以及氧有密切的關(guān)系，在低的水分含量以及最小氧的存在下制劑的穩(wěn)定性最好[34]。但是在不加保護(hù)劑的情況下，如果單純降低水分含量可能適得其反，因?yàn)榈鞍兹绻プ詈笠粚铀值谋Ｗo(hù)，將因?yàn)榛鶊F(tuán)的暴露而聚集變性。有報(bào)道[35]人生長(zhǎng)激素在含水量4.6%時(shí)完全變性，而在含水量7.6%時(shí)沒(méi)有變性。所以?xún)龈蛇^(guò)程應(yīng)該加入合適的保護(hù)劑以及其他輔料，并且含水量不是越低越好。較少氧對(duì)蛋白的氧化，可以通過(guò)充氮?dú)鈦?lái)保護(hù)[36]。冷凍干燥過(guò)程中的降溫速率的選擇與保護(hù)劑的濃度有關(guān)，如果保護(hù)劑濃度很高，以不太大的降溫速率就能使溶液以玻璃態(tài)固化。很多人認(rèn)為快速冷凍有益于生物活性，因?yàn)榭焖倮鋬隹梢詼p少緩沖液結(jié)晶引起的pH變化，減低蛋白質(zhì)局部高離子強(qiáng)度的接觸時(shí)間，減少變性可能發(fā)生的時(shí)間。但是很多證據(jù)表明凍融和冷凍干燥后，快速冷凍對(duì)蛋白的活性回收不利，并對(duì)貯藏期凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定性也有影響[37]。用磷酸緩沖液和甘露醇作為賦形劑體系，在pH7.4~7.8時(shí)，冷凍速率對(duì)人生長(zhǎng)激素的可溶性聚合物形成的影響檢測(cè)不到，可是對(duì)不溶性聚合物形成的影響是顯著的，冷凍速率越高聚合物越多。不溶性聚合物的形成被冷凍前的低pH加速。凍干溶液的pH很重要，對(duì)脫氨的影響較大。選用不同的緩沖溶液對(duì)pH的要求也不一樣。當(dāng)選用磷酸鹽作為緩沖液時(shí)，在較低的pH（6.0）下，有較少的脫氨組分，但在此pH下較易產(chǎn)生聚集[38]。人生長(zhǎng)激素溶液劑型就是選用較低的pH，添加非離子表面活性劑防止聚集。人生長(zhǎng)激素最常用的凍干保護(hù)劑是甘氨酸和甘露醇。兩種配方比很重要，根據(jù)劑量的不同兩種物質(zhì)加入的比例是不同一樣的。甘露醇作為保護(hù)劑和甘氨酸一起起到穩(wěn)定凍干制劑的作用。為了保證重新溶解后人生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定，也有在溶解水中加入非離子表面活性劑來(lái)增加溶液的物理穩(wěn)定性，如諾和諾德的NorditropinSimpleXx，在溶解水中加入泊洛沙姆188以增加物理穩(wěn)定性。表2列出了價(jià)格典型的商品化重組人生長(zhǎng)激素的配方。表SEQ表\*ARABIC2常見(jiàn)商品化重組人生長(zhǎng)激素的凍干配方*商品名劑型規(guī)格賦形劑緩沖鹽rhGH甘氨酸甘露醇蔗糖NaH2PO4Na2HPO4pHGenotropin凍干劑型4.5IU1.527.60/0.300.306.717.45.82.21.8/0.320.326.7Humatrope155525/01.137.5186618/01.367.5Nutropin1551.745/0.451.37.4Saizen155//34.26.5-8.5*來(lái)源于FDA網(wǎng)站相關(guān)產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)REF_Ref354161124\h表2中可以看到大多數(shù)上市產(chǎn)品采用的甘氨酸和甘露醇配方系統(tǒng)。本文討論的產(chǎn)品就是采用冷凍干燥技術(shù)制備的凍干粉針劑型，也采用和上市產(chǎn)品同樣的甘氨酸和甘露醇體系，配方均得到批準(zhǔn)，長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，凍干劑型和溶液劑型相比較在貨架期要穩(wěn)定的很多，這也是目前市場(chǎng)上還是主要以?xún)龈蓜┬蜑橹鞯脑颉?chǎng)地變更的原因注射用重組人生長(zhǎng)激素是上海聯(lián)合賽生物工程有限公司已上市十多年的老產(chǎn)品，隨著市場(chǎng)的擴(kuò)大，原生產(chǎn)車(chē)間已不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，為此在原址上新建了注射用重組人生長(zhǎng)激素生產(chǎn)車(chē)間，用于注射用重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)。由于在原址上新建，原質(zhì)量檢測(cè)、原輔材料采購(gòu)和儲(chǔ)存，以及質(zhì)量保證系統(tǒng)均采用原來(lái)的系統(tǒng)，檢測(cè)、原輔材料和質(zhì)量保證系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)較低。本次是在原廠址增建了一個(gè)注射用重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)線，包括了原液生產(chǎn)車(chē)間和制劑生產(chǎn)車(chē)間，對(duì)于本次新建車(chē)間經(jīng)歷了下面幾個(gè)階段。表SEQ表\*ARABIC3新增車(chē)間經(jīng)歷的階段流程階段要求設(shè)計(jì)前根據(jù)歷史研究和生產(chǎn)數(shù)據(jù)分析和評(píng)估原液和制劑的關(guān)鍵工藝參數(shù)，并分析其對(duì)終產(chǎn)品質(zhì)量屬性的影響。廠房設(shè)計(jì)根據(jù)關(guān)鍵工藝參數(shù)的分析結(jié)果，提出對(duì)廠房和設(shè)備的工藝設(shè)計(jì)要求。廠房和設(shè)備應(yīng)可以滿(mǎn)足有效控制關(guān)鍵工藝參數(shù)的要求。安裝確認(rèn)完成廠房和設(shè)備3Q試制在新建車(chē)間進(jìn)行試制，考察車(chē)間、設(shè)備、人員等是否可以按照預(yù)定的工藝參數(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，并得到合格的產(chǎn)品。工藝驗(yàn)證根據(jù)是試制的結(jié)果完善工藝規(guī)程和批記錄等，然后進(jìn)行工藝驗(yàn)證。比較研究新車(chē)間和老車(chē)間的原液和成品進(jìn)行全面的藥學(xué)比較研究。持續(xù)改進(jìn)新老車(chē)間進(jìn)行持續(xù)的考察和比較，對(duì)更多批次的原液和成品進(jìn)行回顧性的驗(yàn)證，進(jìn)一步確認(rèn)工藝的穩(wěn)定性。在新車(chē)間的設(shè)計(jì)前根據(jù)實(shí)際需要，放大了發(fā)酵規(guī)模和凍干規(guī)模，保持其他操作單元規(guī)模不變。對(duì)于生物制品，其生產(chǎn)工藝是關(guān)鍵的，因此在整個(gè)新車(chē)間發(fā)展階段，以不改變關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性為前提進(jìn)行設(shè)計(jì)、實(shí)施和驗(yàn)證。注射用重組人生長(zhǎng)激素工藝流程注射用重組人生長(zhǎng)激素是凍干粉針劑型，其原液通過(guò)基因工程技術(shù)將目的基因插入載體質(zhì)粒中，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌而得到可以表達(dá)重組人生長(zhǎng)激素的大腸桿菌工程菌，再通過(guò)大腸桿菌的培養(yǎng)使之生產(chǎn)目的蛋白重組人生長(zhǎng)激素。由于重組人生長(zhǎng)激素是通過(guò)大腸桿菌來(lái)生產(chǎn)的，因此需要將目的產(chǎn)物和大腸桿菌其他組分如宿主蛋白等進(jìn)行分離。培養(yǎng)后的大腸桿菌需要通過(guò)一系列的工藝步驟進(jìn)行分離純化后才能得到純凈的重組人生長(zhǎng)激素原液。得到的原液經(jīng)過(guò)配制、除菌過(guò)濾、凍干和包裝等制劑過(guò)程，得到終產(chǎn)品注射用重組人生長(zhǎng)激素凍干粉針。對(duì)于藥品的生產(chǎn)，圖1形象的給出了關(guān)鍵物料屬性和關(guān)鍵工藝參數(shù)對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響。根據(jù)這一定義，工藝狀態(tài)取決于該工藝的關(guān)鍵工藝參數(shù)和輸出物料的關(guān)鍵物料屬性[39]。藥品生產(chǎn)單元操作藥品生產(chǎn)單元操作CMAs輸入物料CQAs產(chǎn)出物CPPs關(guān)鍵工藝參數(shù)圖SEQ圖\*ARABIC1關(guān)鍵物料屬性（CMAs）和關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPPs）對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）的影響生物制品由于分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)于分析方法和儀器設(shè)備要求頗高；盡管如此，現(xiàn)代分析技術(shù)難以按照個(gè)體分子的2級(jí)及3級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行完整表征化測(cè)定，因此主要通過(guò)控制其生產(chǎn)工藝來(lái)說(shuō)明批次生產(chǎn)的相似性；而生產(chǎn)工藝是通過(guò)多個(gè)生產(chǎn)單元操作來(lái)實(shí)現(xiàn)的。注射用重組人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)工藝也被分為多個(gè)單元操作，REF_Ref353921443\h圖2給出了注射用重組人生長(zhǎng)激素生產(chǎn)工藝流程圖。流程圖中根據(jù)REF_Ref353921457\h圖1的方法，給出了每個(gè)單元操作的輸入物料和產(chǎn)出物。從圖中可以看出，上一步驟的產(chǎn)出物是下一步驟的輸入物料，這里將工藝的產(chǎn)出物除原液、半成品和成品外的工藝產(chǎn)出物均定義為中間品。根據(jù)多年的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)對(duì)每一個(gè)單元操作的物料屬性和工藝參數(shù)進(jìn)行分析，并評(píng)估其對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響。當(dāng)輸入物料的某個(gè)質(zhì)量屬性（如水分、純度）的變化能顯著影響產(chǎn)出物的屬性時(shí)，則定義其為關(guān)鍵物料屬性。當(dāng)工藝參數(shù)運(yùn)行參數(shù)（如流速、轉(zhuǎn)速）或工藝狀態(tài)變量（如溫度、壓力、pH）的實(shí)際變化能顯著影響產(chǎn)出物料的屬性時(shí)，則定義該工藝參數(shù)是關(guān)鍵的[40]。新建車(chē)間輸入物料和產(chǎn)出物的關(guān)鍵屬性CMAs和CQA應(yīng)和老車(chē)間保持一致。細(xì)胞庫(kù)（MCB和WCB）細(xì)胞庫(kù)（MCB和WCB）培養(yǎng)基、工藝空氣、純化水發(fā)酵培養(yǎng)中間品1離心捕獲菌體中間品1中間品2初純中間品2各種鹽、純化水中間品3精純重組人生長(zhǎng)激素原液中間品3層析介質(zhì)、過(guò)濾膜、注射用水配制中間品4重組人生長(zhǎng)激素原液輔料、注射用水除菌過(guò)濾半成品中間品4過(guò)濾膜、工藝空氣、注射用水灌裝中間品5半成品膠塞、西林瓶、注射用水凍干中間品6中間品5氮?dú)忉徤w成品凍干品鋁蓋包裝包裝成品成品瓶貼、說(shuō)明書(shū)、外包裝輸入物料產(chǎn)出物生產(chǎn)操作單元圖SEQ圖\*ARABIC2注射用重組人生長(zhǎng)激素工藝流程圖（下劃線表示單元操作的產(chǎn)出物）從總體的工藝流程上看原液是成品關(guān)鍵物料，新車(chē)間原液的關(guān)鍵質(zhì)量屬性和老車(chē)間不應(yīng)有顯著差異，原液后面工藝的變更不對(duì)原液的質(zhì)量屬性產(chǎn)生不利的影響。研究目的與意義根據(jù)《關(guān)于貫徹實(shí)施<藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）>的通知》（國(guó)食藥監(jiān)安〔2011〕101號(hào)）和《關(guān)于進(jìn)一步明確眼用制劑等產(chǎn)品實(shí)施新修訂藥品GMP期限的通知》（國(guó)食藥監(jiān)安〔2012〕106號(hào)）要求，涉及無(wú)菌檢查項(xiàng)目制劑和原料藥均應(yīng)在2013年12月31日前達(dá)到新修訂的藥品GMP要求。其他應(yīng)在2015年12月31日前達(dá)到新修訂藥品GMP要求。生物制品均應(yīng)在2013年12月31日前達(dá)到新修訂的藥品GMP要求。《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》（簡(jiǎn)稱(chēng)新版GMP）[41]是一次重大的GMP修訂，特別是針對(duì)無(wú)菌藥品的生產(chǎn)提高了要求，很多生產(chǎn)商為符合新版GMP要求必須對(duì)原有廠房進(jìn)行改建，與此同時(shí)很多生物制品通過(guò)改建或擴(kuò)建淘汰老的工藝，采用新工藝。如何將變更后的產(chǎn)品與變更前的產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比是很多生產(chǎn)商面臨的問(wèn)題。生產(chǎn)方法、工藝、質(zhì)控檢測(cè)方法以及產(chǎn)品表征檢測(cè)方法的改進(jìn)，使生產(chǎn)商能夠較好對(duì)變更對(duì)生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)設(shè)施的影響進(jìn)行識(shí)別和評(píng)估，這使得從藥學(xué)上證明其有可比性成為可能。比如，近年來(lái)大分子分離技術(shù)、產(chǎn)品以及工藝相關(guān)技術(shù)大大改進(jìn)，生產(chǎn)商在建立產(chǎn)品和生物活性表征方面經(jīng)驗(yàn)證的靈敏方法以及對(duì)這些檢測(cè)中差異顯著性評(píng)價(jià)方面所具有的能力，有能力在不必重復(fù)進(jìn)行臨床藥效研究的情況下，對(duì)產(chǎn)品可比性研究進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果可比性試驗(yàn)證明生產(chǎn)變更并未對(duì)產(chǎn)品的安全性、特性、純度和效價(jià)產(chǎn)生影響，可認(rèn)為這兩種產(chǎn)品具有可比性。可比性研究是廠房變更的關(guān)鍵，本文嘗試以注射用重組人生長(zhǎng)激素新建廠房的可比性研究為例，對(duì)如何評(píng)價(jià)產(chǎn)品變更前后的可比性進(jìn)行探討。注射用重組人生長(zhǎng)激素產(chǎn)品介紹藥品的安全性和有效性是通過(guò)上市前非臨床和臨床試驗(yàn)而評(píng)價(jià)，藥品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性通過(guò)臨床期間的藥學(xué)研究而最終確定的，因此對(duì)于已上市產(chǎn)品的變更，其關(guān)鍵質(zhì)量屬性不應(yīng)發(fā)生變更，否則需要追加非臨床或臨床試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)其安全性和有效性。注射用重組人生長(zhǎng)激素產(chǎn)品已上市10多年，歐洲藥典、美國(guó)藥典和中國(guó)藥典均收錄了此產(chǎn)品，具有比較成熟的分析方法，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也是基于對(duì)產(chǎn)品和工藝的了解而建立的，因此質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)反映了其關(guān)鍵質(zhì)量屬性。下面從原液、半成品和成品3個(gè)方面分別介紹新車(chē)間產(chǎn)品的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。原液的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重組人生長(zhǎng)激素的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、免疫化學(xué)性質(zhì)、生物活性、純度和雜質(zhì)以及產(chǎn)品的穩(wěn)定性，原液的研究方法應(yīng)包含上述內(nèi)容。重組人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu)REF_Ref353918240\h圖3給出了人生長(zhǎng)激素的一級(jí)氨基酸序列和二硫鍵位置。圖SEQ圖\*ARABIC3人生長(zhǎng)激素一級(jí)結(jié)構(gòu)圖[42]重組人生長(zhǎng)激素的分子式為C990H1528N262O300S7，分子量22125道爾頓。其他結(jié)構(gòu)信息列于REF_Ref353935249\h表4中。新車(chē)間重組人生長(zhǎng)激素原液應(yīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)的確證，證明其和天然的人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu)具有一致的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)確證檢測(cè)包括：肽圖質(zhì)譜覆蓋率、質(zhì)譜分子量、N末端和C末端序列檢測(cè)、二硫鍵配對(duì)檢測(cè)和圓二色譜法檢測(cè)。兩個(gè)車(chē)間各取1~3批原液進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測(cè)，REF_Ref353935249\h表4列出了檢測(cè)項(xiàng)目和兩個(gè)車(chē)間原液結(jié)構(gòu)的一致性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。表SEQ表\*ARABIC4人生長(zhǎng)激素結(jié)構(gòu)確證研究?jī)?nèi)容檢測(cè)項(xiàng)目理論值一致性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜分子量22,125Dalton3批原液檢測(cè)，分子量和理論值誤差小于1%；和對(duì)照品平均分子量相差小于20Dalton肽圖質(zhì)譜覆蓋率氨基酸序列兩種酶酶切，分子量覆蓋率應(yīng)大于90%圓二色譜法alfa螺旋占多數(shù)相同條件檢測(cè)，應(yīng)和對(duì)照品譜圖一致二硫鍵配對(duì)兩對(duì)二硫鍵：Cys53-Cys165和Cys182-Cys189僅有C53-C165和C182和C189兩對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，沒(méi)有錯(cuò)配和分子間二硫鍵N末端序列NH2-FPTIPLSRLFN末端10個(gè)殘基序列為NH2-FPTIPLSRLFC末端序列SVEGSCGF-COOHC末端8個(gè)殘基序列為SVEGSCGF-COOH放行標(biāo)準(zhǔn)注射用重組人生長(zhǎng)激素產(chǎn)品已上市10多年，并且是在《中華人民共和國(guó)藥典》中有收錄，因此質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)反映了其關(guān)鍵質(zhì)量屬性，下面從原液、半成品和成品3個(gè)方面分別介紹新車(chē)間產(chǎn)品的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。原液的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重組人生長(zhǎng)激素的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、免疫化學(xué)性質(zhì)、生物活性、純度和雜質(zhì)，以及產(chǎn)品的穩(wěn)定性，因此原液的研究方法應(yīng)從上述方面進(jìn)行。重組人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu)REF_Ref353918240\h圖3給出了人生長(zhǎng)激素的一級(jí)氨基酸序列和二硫鍵位置。圖SEQ圖\*ARABIC4人生長(zhǎng)激素一級(jí)結(jié)構(gòu)圖[]重組人生長(zhǎng)激素的分子式為C990H1528N262O300S7，分子量22125道爾頓。其他結(jié)構(gòu)信息列于REF_Ref353935249\h表4中。新車(chē)間重組人生長(zhǎng)激素原液，應(yīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)的確證，證明其和天然的人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu)具有一致的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)。兩個(gè)車(chē)間各取1~3批原液進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測(cè)，檢測(cè)包括：肽圖質(zhì)譜覆蓋率、質(zhì)譜分子量、N末端和C末端序列檢測(cè)、二硫鍵配對(duì)檢測(cè)和圓二色譜法檢測(cè)。REF_Ref353935249\h表4列出了這些檢測(cè)的理論值和兩個(gè)車(chē)間原液結(jié)構(gòu)的一致性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。表SEQ表\*ARABIC5人生長(zhǎng)激素結(jié)構(gòu)確證研究?jī)?nèi)容檢測(cè)項(xiàng)目理論值一致性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜分子量22,125Dalton3批原液檢測(cè)，分子量和理論值誤差小于1%；和對(duì)照品平均分子量相差小于20Dalton肽圖質(zhì)譜覆蓋率氨基酸序列兩種酶酶切，分子量覆蓋率應(yīng)大于90%圓二色譜法alfa螺旋占多數(shù)相同條件檢測(cè)，應(yīng)和對(duì)照品譜圖一致二硫鍵配對(duì)兩對(duì)二硫鍵：Cys53-Cys165和Cys182-Cys189僅有C53-C165和C182和C189兩對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，沒(méi)有錯(cuò)配和分子間二硫鍵N末端序列NH2-FPTIPLSRLFN末端10個(gè)殘基序列為NH2-FPTIPLSRLFC末端序列SVEGSCGF-COOHC末端8個(gè)殘基序列為SVEGSCGF-COOH放行標(biāo)準(zhǔn)新車(chē)間重組人生長(zhǎng)激素原液不僅應(yīng)符合放行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)基于收集的歷史數(shù)據(jù)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立兩個(gè)車(chē)間比較的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)分析方法的性質(zhì)，可以將放行標(biāo)準(zhǔn)分為定量標(biāo)準(zhǔn)和定性標(biāo)準(zhǔn)，定性標(biāo)準(zhǔn)作為定量標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充，更全面的展現(xiàn)產(chǎn)品雜質(zhì)增減情況。重組人生長(zhǎng)激素主要相關(guān)雜質(zhì)有：脫氨組分、氧化組分、多聚體、工藝中被截?cái)嗟娜松L(zhǎng)激素片段。主要工藝雜質(zhì)有：內(nèi)毒素、宿主菌體蛋白、外源DNA、微生物。內(nèi)控放行標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法涵蓋了上述雜質(zhì)的分析。因此可以通過(guò)對(duì)放行檢測(cè)結(jié)果的比較，證明廠房的變更對(duì)原液的理化性質(zhì)、純度和雜質(zhì)是否產(chǎn)生了不利影響。新車(chē)間采用至少10批次原液和老車(chē)間進(jìn)行比較，原液應(yīng)符合放行標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)對(duì)定量檢測(cè)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，比較兩個(gè)車(chē)間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，判斷兩者是否有顯著差異。REF_Ref353931977\h表6列出了主要的放行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目，檢測(cè)方法基本是藥典方法，分析方法可靠并均經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。表SEQ表\*ARABIC6重組人生長(zhǎng)激素原液的放行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目分析方法外觀目檢鑒別方法（1）《中華人民共和國(guó)藥典》二部重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的鑒別（1）項(xiàng)方法（反相色譜法）方法（2）《中華人民共和國(guó)藥典》二部重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的鑒別（4）項(xiàng)方法（等電聚焦電泳IEF）檢查相關(guān)蛋白《中華人民共和國(guó)藥典》二部注射用重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的相關(guān)蛋白檢測(cè)方法（反相色譜法）高分子蛋白《中華人民共和國(guó)藥典》二部注射用重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的高分子蛋白檢測(cè)方法（分子排阻色潽法）電荷異構(gòu)體等電聚焦電泳細(xì)菌內(nèi)毒素《中華人民共和國(guó)藥典》二部附錄XIE殘余宿主蛋白《中華人民共和國(guó)藥典》二部重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的菌體蛋白殘余量檢測(cè)方法DNA殘留《中華人民共和國(guó)藥典》二部重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的外源性DNA殘留量下的方法含量《中華人民共和國(guó)藥典》二部注射用重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下方法生物學(xué)活性《中華人民共和國(guó)藥典二部》附錄XIIP生長(zhǎng)激素生物測(cè)定法是采用去垂體大鼠體重法和脛骨法進(jìn)行的生物活性測(cè)定法，和生長(zhǎng)激素的體內(nèi)藥效學(xué)研究采用相同的方法，因此去垂體大鼠體重法和脛骨法測(cè)定結(jié)果也反映了動(dòng)物體內(nèi)藥效結(jié)果?！吨腥A人民共和國(guó)藥典二部》重組人生長(zhǎng)激素各論中規(guī)定生物活性：照生長(zhǎng)激素生物測(cè)定法（附錄XIIP）依法檢查，每1mg蛋白中含生長(zhǎng)激素不得少于2.5單位（每年至少測(cè)定一次）。兩個(gè)車(chē)間各取1~3批同時(shí)進(jìn)行重組人生長(zhǎng)激素體內(nèi)生物學(xué)活性的檢驗(yàn)，兩個(gè)車(chē)間原液的生物活性應(yīng)符合《中華人民共和國(guó)藥典》重組人生長(zhǎng)激素各論中的規(guī)定，兩者的活性平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)沒(méi)有顯著差異，以此證明廠房的變更未改變其體內(nèi)生物學(xué)活性。免疫化學(xué)性質(zhì)免疫化學(xué)性質(zhì)的檢測(cè)可以采用免疫斑點(diǎn)法或westernblot方法，兩種方法均針對(duì)重組人生長(zhǎng)激素的抗原特性進(jìn)行檢測(cè)。免疫化學(xué)性質(zhì)的研究，可以證明兩個(gè)車(chē)間生產(chǎn)的原液抗原特異性一致性，它的一致性可以進(jìn)一步說(shuō)明兩者結(jié)構(gòu)的一致。強(qiáng)制降解試驗(yàn)和長(zhǎng)期穩(wěn)定性新車(chē)間生產(chǎn)的原液可以通過(guò)高溫和光照強(qiáng)制破壞試驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)蛋白、高分子蛋白質(zhì)、電荷異構(gòu)體、含量，比較兩者之間降解物和降解速率。在工藝不變的情況下降解產(chǎn)物類(lèi)型和降解速率應(yīng)該沒(méi)有顯著變化，新車(chē)間原液和老車(chē)間強(qiáng)制降解比較應(yīng)不得產(chǎn)生新的降解產(chǎn)物。重組人生長(zhǎng)激素原液為冷凍保存，因此無(wú)需進(jìn)行加速穩(wěn)定性考察，僅進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。將新車(chē)間和老車(chē)間的長(zhǎng)期穩(wěn)定性歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和比較，降解速率和雜質(zhì)類(lèi)別上應(yīng)沒(méi)有明顯的差異。重組人生長(zhǎng)激素原液長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察方法如下：擬考察點(diǎn)為0、3、6、12、18、24、36個(gè)月。原液包裝形式和老車(chē)間一致，貯存溫度2~8℃。按照《中國(guó)藥典》2010年版附錄XIXC“原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”，本品為注射劑，指導(dǎo)原則規(guī)定的重點(diǎn)考察項(xiàng)目為：外觀色澤、含量、pH值、可見(jiàn)異物、有關(guān)物質(zhì)。因此重點(diǎn)考察項(xiàng)目為：性狀、含量、pH值、可見(jiàn)異物、有關(guān)物質(zhì)（相關(guān)蛋白、高分子蛋白）、水分指標(biāo)。在0、24和36個(gè)月進(jìn)行全項(xiàng)檢測(cè)。半成品的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重組人生長(zhǎng)激素原液和輔料按照處方比例進(jìn)行混合后除菌過(guò)濾得到半成品。半成品的放行標(biāo)準(zhǔn)包括：內(nèi)毒素、無(wú)菌、蛋白含量。新車(chē)間半成品應(yīng)符合放行標(biāo)準(zhǔn)，和歷史數(shù)據(jù)比較沒(méi)有顯著差異。半成品除放行標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)還應(yīng)增加穩(wěn)定性考察，在室溫下，考察0、8、16和24小時(shí)半成品相關(guān)蛋白、高分子蛋白和含量，新車(chē)間半成品在考察期內(nèi)應(yīng)符合成品的放行標(biāo)準(zhǔn)，比較兩個(gè)車(chē)間上述指標(biāo)平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，兩個(gè)車(chē)間應(yīng)無(wú)顯著差異。成品的研究方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)注射用重組人生長(zhǎng)激素已經(jīng)被錄入《中華人民共和國(guó)藥典》，因此其放行標(biāo)準(zhǔn)是不低于《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版的各論的要求，放行檢測(cè)涵蓋了注射用重組人生長(zhǎng)激素理化性質(zhì)、純度和雜質(zhì)、生物學(xué)活性等產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性?？梢宰鳛樵u(píng)價(jià)兩個(gè)車(chē)間產(chǎn)品質(zhì)量的比較標(biāo)準(zhǔn)。新車(chē)間注射用重組人生長(zhǎng)激素的研究，不僅要求符合放行標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)進(jìn)行生物活性和穩(wěn)定性考察。新車(chē)間至少3個(gè)連續(xù)批和老車(chē)間進(jìn)行比較，比較方法如下：半成品和成品放行檢測(cè)中的定量項(xiàng)目應(yīng)采用統(tǒng)計(jì)分析的方法和老車(chē)間的歷史數(shù)據(jù)比較，比較平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。兩個(gè)車(chē)間同期生產(chǎn)的產(chǎn)品均應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)兩個(gè)車(chē)間同期生產(chǎn)的產(chǎn)品雜質(zhì)進(jìn)行分析，應(yīng)沒(méi)有新增雜質(zhì)的出現(xiàn)。兩個(gè)車(chē)間的產(chǎn)品同時(shí)進(jìn)行高溫和光照的強(qiáng)制降解試驗(yàn)，比較兩個(gè)車(chē)間產(chǎn)品在高溫和光照情況下降解速率是否有不同，雜質(zhì)類(lèi)型是否有差異。新車(chē)間連續(xù)3批產(chǎn)品進(jìn)行加速穩(wěn)定性考察，采用市售小包裝貯存，溫度25℃±2℃，濕度60%±5%。參照《中國(guó)藥典》2005年版附錄XIXC《原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》以及《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》設(shè)置考察時(shí)間點(diǎn)，考察點(diǎn)為0、1、3、4.5和6個(gè)月。重點(diǎn)考察項(xiàng)目為：性狀、含量、pH值、可見(jiàn)異物和有關(guān)物質(zhì)（相關(guān)蛋白和高分子蛋白）。0和6個(gè)月進(jìn)行全項(xiàng)檢測(cè)。新車(chē)間和老車(chē)間產(chǎn)品的歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，兩者在降解速率和雜質(zhì)類(lèi)別上應(yīng)沒(méi)有明顯的差異。新車(chē)間每個(gè)規(guī)格至少3批進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察，采用市售小包裝貯存，貯存溫度5℃±3℃。按照《中國(guó)藥典》2005年版附錄XIXC《原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》以及《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》設(shè)置考察時(shí)間點(diǎn)。時(shí)間點(diǎn)在第一年一般為每3個(gè)月末一次，第二年每6個(gè)月末一次，以后每年末一次。即第0、3、6、9、12、18、24、36個(gè)月末取樣檢測(cè)考察指標(biāo)。重點(diǎn)考察項(xiàng)目為：性狀、含量、pH值、可見(jiàn)異物和有關(guān)物質(zhì)（相關(guān)蛋白和高分子蛋白）。0、24和36個(gè)月分別進(jìn)行全項(xiàng)檢測(cè)。和老車(chē)間同規(guī)格產(chǎn)品進(jìn)行比較，兩者在穩(wěn)定性上應(yīng)沒(méi)有明顯差異。表SEQ表\*ARABIC7注射用重組人生長(zhǎng)激素放行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法檢測(cè)項(xiàng)目分析方法外觀目檢鑒別方法（1）《中華人民共和國(guó)藥典》二部重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的鑒別（1）項(xiàng)方法（反相色譜法）方法（2）《中華人民共和國(guó)藥典》二部重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的鑒別（4）項(xiàng)方法（等電聚焦電泳IEF）檢查水分費(fèi)休氏法容量滴定法相關(guān)蛋白《中華人民共和國(guó)藥典》二部注射用重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的相關(guān)蛋白檢測(cè)方法（反相色譜法）高分子蛋白《中華人民共和國(guó)藥典》二部注射用重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下的高分子蛋白檢測(cè)方法（分子排阻色潽法）電荷異構(gòu)體等電聚焦電泳異常毒性《中華人民共和國(guó)藥典》二部附錄XIC細(xì)菌內(nèi)毒素《中華人民共和國(guó)藥典》二部附錄XIE裝量差異《中華人民共和國(guó)藥典》二部附錄IB注射劑無(wú)菌《中華人民共和國(guó)藥典》二部附錄XIH薄膜過(guò)濾法酸堿度《中華人民共和國(guó)藥典》二部附錄VIH溶液的澄清度與顏色《中華人民共和國(guó)藥典》二部附錄IXA第一法和附錄IXB可見(jiàn)異物《中華人民共和國(guó)藥典》二部附錄IXH燈檢法不溶性微?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》二部附錄IXC第一法含量《中華人民共和國(guó)藥典》二部注射用重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下方法生物學(xué)活性《中華人民共和國(guó)藥典》二部重組人生長(zhǎng)激素項(xiàng)下方法初步風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估輸入物料的變更分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估根據(jù)REF_Ref353921443\h圖2的工藝流程圖，首先對(duì)注射用重組人生長(zhǎng)激素工藝中的輸入物料分別進(jìn)行分析，找出由于廠房變更而引起變化的輸入物料，然后針對(duì)這些輸入物料進(jìn)行變更的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和評(píng)估。REF_Ref353922859\h表8將注射用重組人生長(zhǎng)激素的全部輸入物料列出，并對(duì)可能引起變化的物料進(jìn)行了識(shí)別。表SEQ表\*ARABIC8輸入物料的變更分析物料名稱(chēng)是否變更風(fēng)險(xiǎn)分析細(xì)胞庫(kù)（MCB和WCB）否生物制品的起始物料，是關(guān)鍵物料，由于在原址增建車(chē)間，因此種子批采用和原車(chē)間相同的種子批，需規(guī)定采用相同的轉(zhuǎn)運(yùn)方式。發(fā)酵培養(yǎng)基否半合成培養(yǎng)基，是關(guān)鍵物料，來(lái)源和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和原車(chē)間一致。儲(chǔ)存和稱(chēng)量的地址均未變化。各種鹽否初純和精純使用了各種鹽，如作為緩沖劑的磷酸鹽等，這些化學(xué)物料的來(lái)源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未發(fā)生變化，檢測(cè)、儲(chǔ)存和稱(chēng)量地址均無(wú)變化。層析介質(zhì)否層析介質(zhì)是關(guān)鍵物料，來(lái)源和種類(lèi)對(duì)分離影響很大，因此是不能變更的。采用和原車(chē)間一致的采購(gòu)、質(zhì)控、存儲(chǔ)。過(guò)濾膜否過(guò)濾膜的來(lái)源、材質(zhì)非常重要，不能變更。采用和原車(chē)間一致的采購(gòu)、質(zhì)控、存儲(chǔ)。工藝空氣是工藝空氣和產(chǎn)品接觸的單元操作主要是發(fā)酵和除菌過(guò)濾。發(fā)酵需要通氣保持溶氧。過(guò)濾是通過(guò)氣壓使半成品濾過(guò)除菌過(guò)濾膜。工藝空氣系統(tǒng)進(jìn)行了改造，涉及到變更，風(fēng)險(xiǎn)較高需要進(jìn)行全面驗(yàn)證。純化水是發(fā)酵和初純采用純化水，因?yàn)榇竽c桿菌的發(fā)酵相對(duì)對(duì)水的要求沒(méi)有細(xì)胞培養(yǎng)高，同時(shí)大腸桿菌本身產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，因此在工藝的上游采用純化水。注射用水是注射用水用于精純、半成品配制、器具的最后清洗等過(guò)程。對(duì)于原液生產(chǎn)水是控制內(nèi)毒素的關(guān)鍵因素，制劑的配料等均采用注射用水，因此注射用水十分重要。新建車(chē)間水系統(tǒng)進(jìn)行了改造，涉及到變更，風(fēng)險(xiǎn)較高，需要進(jìn)行全面驗(yàn)證。輔料否輔料是關(guān)鍵物料，采用和原車(chē)間一致的采購(gòu)、質(zhì)控、存儲(chǔ)，沒(méi)有變更。包裝材料否內(nèi)包裝材料和產(chǎn)品接觸，其來(lái)源、材質(zhì)等均是關(guān)鍵屬性，新車(chē)間采用和原車(chē)間一樣的采購(gòu)、質(zhì)控、存儲(chǔ)，沒(méi)有變更。氮?dú)夥裨趦龈赏瓿珊筮M(jìn)行充氮?dú)?，使瓶?jī)?nèi)保持少許負(fù)壓。氮?dú)獾膩?lái)源和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有變化。重組人生長(zhǎng)激素原液否這些均是工藝過(guò)程中得到的工藝產(chǎn)出物，雖然工藝是在新車(chē)間實(shí)施的，但其物料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、儲(chǔ)存條件沒(méi)有發(fā)生變更。半成品否中間品1~6否輸入物料的變更分析可以看出，新增車(chē)間由于需要新的制水和工藝空氣系統(tǒng)，因此水和工藝空氣可能發(fā)生了變更。制水和工藝空氣系統(tǒng)需要在廠房完成后進(jìn)行全面的驗(yàn)證，以保證符合預(yù)定的要求，并和原車(chē)間的控制水平一致。REF_Ref353930914\h表9對(duì)水和工藝空氣的關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以便于判斷變更對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量是否產(chǎn)生顯著的影響。表SEQ表\*ARABIC9變更物料的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估物料名稱(chēng)工藝參數(shù)發(fā)生頻率O*嚴(yán)重程度S*不可檢測(cè)度D*RPN=O*S*D工藝空氣空氣壓縮機(jī)壓力24216儲(chǔ)罐壓力等24216P級(jí)過(guò)濾器參數(shù)26448干燥參數(shù)26224Q級(jí)過(guò)濾器參數(shù)26224S級(jí)過(guò)濾器參數(shù)28232純化水原水來(lái)源26224制水工藝28232清洗工藝28240滅菌工藝28240管路和分配系統(tǒng)28240取樣點(diǎn)分布28240注射用水制水工藝28232循環(huán)保溫28232管路和分配系統(tǒng)28240取樣點(diǎn)分布28240*發(fā)生的頻率O：指發(fā)生的頻率，分1-10級(jí)，從幾乎不可能發(fā)生失效到發(fā)生失效幾乎無(wú)法避免；嚴(yán)重程度S：指對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響后果的嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)指標(biāo)，一般分1-10級(jí)，從無(wú)失效后果到無(wú)警告的嚴(yán)重危害后果；不可檢測(cè)度D：指不可探測(cè)的程度，分1-10級(jí)，從幾乎肯定到幾乎不可能檢測(cè)。從風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的結(jié)果看，雖然制水和工藝空氣系統(tǒng)發(fā)生了變更，但由于其關(guān)鍵質(zhì)量屬性均是可測(cè)的，根據(jù)老車(chē)間的日常監(jiān)控，在符合設(shè)計(jì)要求的情況下，工藝空氣和水的質(zhì)量發(fā)生不符合要求的頻率也很低，因此RPN值不高，說(shuō)明水和工藝空氣的變更風(fēng)險(xiǎn)較小，可以通過(guò)對(duì)制水和工藝空氣系統(tǒng)的驗(yàn)證，以及日常監(jiān)控降低風(fēng)險(xiǎn)。工藝的變更分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估根據(jù)REF_Ref353921443\h圖2的工藝流程圖對(duì)每個(gè)單元操作進(jìn)行分析，找出發(fā)生變更的單元操作，然后針對(duì)變更的單元操作進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和評(píng)估。REF_Ref353926256\h表10對(duì)每個(gè)單元操作進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)分析，并分析其是否發(fā)生了變更。表SEQ表\*ARABIC10注射用重組人生長(zhǎng)激素工藝單元操作的變更分析操作單元是否發(fā)生變更風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)酵培養(yǎng)是新車(chē)間采用新發(fā)酵系統(tǒng)，發(fā)酵體積放大了一倍，因此本操作單元風(fēng)險(xiǎn)較高，需要進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)的識(shí)別和評(píng)估。捕獲菌體否采用和老車(chē)間一樣的設(shè)備和操作條件，通過(guò)增加設(shè)備進(jìn)行放大，單元操作沒(méi)有變更。初純否采用和老車(chē)間一樣的操作條件和工藝設(shè)備，單元操作沒(méi)有變更。精純否采用和老車(chē)間一樣的操作條件和工藝設(shè)備，單元操作沒(méi)有變更。配制否藥品的配方對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生重大的影響，同時(shí)配方為注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，因此為關(guān)鍵工藝參數(shù)，變更需重新申報(bào)。同比放大體積，配制方法和儲(chǔ)存條件沒(méi)有變更。除菌過(guò)濾是變更為兩級(jí)過(guò)濾，增加一個(gè)除菌過(guò)濾膜。灌裝是批量增大使灌裝時(shí)間延長(zhǎng)。凍干否采用和原車(chē)間一樣的操作條件，單元操作沒(méi)有變更。釓蓋否采用和原車(chē)間一樣的操作條件，單元操作沒(méi)有變更。包裝否采用和原車(chē)間一樣的操作條件，單元操作沒(méi)有變更。從REF_Ref353926256\h表10的分析可以看出，新建車(chē)間的變更主要發(fā)生在發(fā)酵培養(yǎng)、除菌過(guò)濾和灌裝3個(gè)單元操作中。REF_Ref347666455\h表11針對(duì)這三個(gè)單元操作的工藝參數(shù)進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。表SEQ表\*ARABIC11注射用重組人生長(zhǎng)激素工藝的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估單元操作工藝參數(shù)發(fā)生頻率*嚴(yán)重程度*不可檢測(cè)度*RPN發(fā)酵培養(yǎng)溫度28232通氣量26224轉(zhuǎn)速26224補(bǔ)料速度26448pH控制26224培養(yǎng)時(shí)間26224除菌過(guò)濾過(guò)濾體積/過(guò)濾膜面積26224過(guò)濾壓力28232完整性測(cè)試210240半成品保存時(shí)間48264半成品保存溫度210240灌裝溫度28232灌裝體積28232灌裝速度24216單元操作時(shí)間26224*同REF_Ref353930914\h表9的說(shuō)明根據(jù)REF_Ref347666455\h表11的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以看出，雖然發(fā)酵培養(yǎng)、除菌過(guò)濾和灌裝的操作單元發(fā)生了變更，通過(guò)對(duì)其工藝參數(shù)的分析可以看出，由于單元操作的關(guān)鍵工藝參數(shù)均可測(cè)定，并易于控制，發(fā)生不符合的頻率較低，因此總RPN值沒(méi)有超過(guò)64的，說(shuō)明變更的風(fēng)險(xiǎn)不大?？梢酝ㄟ^(guò)工藝驗(yàn)證，證明其工藝的可控性，并證明對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量是否產(chǎn)生顯著的影響，并通過(guò)中間品或半成品的檢測(cè)降低其風(fēng)險(xiǎn)。從以上的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估看，本次的場(chǎng)地變更雖然物料和單元操作均有變更，但變更對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的潛在影響比較小。生產(chǎn)工藝應(yīng)進(jìn)行充分的驗(yàn)證，包含對(duì)工藝文件的核查、培訓(xùn)情況的確認(rèn)、工況系統(tǒng)的確認(rèn)、工藝設(shè)備的確認(rèn)、生產(chǎn)操作和監(jiān)控、取樣和檢驗(yàn)、時(shí)限驗(yàn)證、穩(wěn)定性的考察。在工藝驗(yàn)證通過(guò)的前提下，通過(guò)產(chǎn)品的日常監(jiān)測(cè)可以降低引起質(zhì)量不合格的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)比研究結(jié)果原液的對(duì)比研究結(jié)果結(jié)構(gòu)確證兩個(gè)車(chē)間各取3批原液進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。結(jié)構(gòu)確證檢測(cè)項(xiàng)目新車(chē)間老車(chē)間N末端測(cè)序NH2-FPTIPLSRLFNH2-FPTIPLSRLFC末端測(cè)序SVEGSCGF-COOHSVEGSCGF-COOH分子量Dalton22083.922093.4二硫鍵Cys53-Cys165Cys182-Cys189Cys53-Cys165Cys182-Cys189肽圖質(zhì)譜覆蓋率100%100%圓二色譜法與對(duì)照品一致與對(duì)照品一致消光系數(shù)，M-1cm-116,86317,070氨基酸組成與理論一致與理論一致結(jié)構(gòu)確證說(shuō)明變更場(chǎng)地生產(chǎn)的重組人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu)是正確的，和原車(chē)間的產(chǎn)品一致。生物學(xué)活性采用去垂體大鼠體重法和脛骨法測(cè)定生長(zhǎng)激素生物學(xué)活性，分別檢測(cè)連續(xù)3批原液的比活，新車(chē)間平均比活為3.1IU/mg，原車(chē)間平均比活為3.0IU/mg。均符合《中華人民共和國(guó)藥典二部》的規(guī)定，兩個(gè)車(chē)間的原液生物活性一致。表SEQ表\*ARABIC12兩個(gè)車(chē)間生物活性的比較車(chē)間新車(chē)間老車(chē)間批次123123生物活性（IU/mg）3.053.143.092.983.103.04平均值3.13.0免疫化學(xué)性質(zhì)采用免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)重組人生長(zhǎng)激素的抗原特異性進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)均呈現(xiàn)陽(yáng)性。表SEQ表\*ARABIC13兩個(gè)車(chē)間免疫斑點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比新車(chē)間原車(chē)間批次免疫斑點(diǎn)結(jié)果批次免疫斑點(diǎn)結(jié)果1陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色1陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色2陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色2陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色3陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色3陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色4陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色4陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色5陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色5陽(yáng)性對(duì)照品顯色，陰性對(duì)照品不顯色，供試品顯色純度、雜質(zhì)和污染新車(chē)間進(jìn)行了連續(xù)20批原液的放行檢驗(yàn)，均符合內(nèi)控放行標(biāo)準(zhǔn)。將這20批原液的純度、雜質(zhì)和污染，和原車(chē)間歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較（見(jiàn)REF_Ref353938427\h表14）?？梢钥闯鰞蓚€(gè)車(chē)間純度和雜質(zhì)的均值和SD值一致，說(shuō)明兩個(gè)車(chē)間的生產(chǎn)對(duì)純度和雜質(zhì)控制水平是一致的，變更未對(duì)原液的質(zhì)量產(chǎn)生不利的影響。表SEQ表\*ARABIC14原液純度、雜質(zhì)和污染的比較結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目新車(chē)間老車(chē)間均值SD均值SD相關(guān)蛋白質(zhì)2.18%0.67%2.30%0.58%高分子蛋白質(zhì)0.32%0.07%0.28%0.09%電泳純度99.8%0.5%99.7%0.5%含量(mg/mg蛋白)1.030.021.020.02HPLC含量（mg/ml）13.020.9313.370.69細(xì)菌內(nèi)毒素<0.25/<0.25/菌體蛋白殘留量HCP<2.5/<2.5/外源性DNA殘留量（DNA探針雜交法）<2/<2/電荷異構(gòu)體（等電聚焦法）電泳圖譜比對(duì)，從條帶數(shù)目和深淺上未發(fā)現(xiàn)差異除了對(duì)雜質(zhì)含量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)比較外，同時(shí)對(duì)新老車(chē)間雜質(zhì)譜進(jìn)行了分析：反相色譜檢測(cè)：雜質(zhì)峰譜一致，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的雜質(zhì)峰。說(shuō)明兩個(gè)車(chē)間質(zhì)量是一致的，變更車(chē)間沒(méi)有產(chǎn)生新的雜質(zhì)。分子排阻色潽法檢測(cè)：除了二聚體和多聚體峰外，沒(méi)有產(chǎn)生新的雜質(zhì)。非還原SDS電泳：除主帶外，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新增雜質(zhì)。等電聚焦電泳：除主帶外，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新增雜質(zhì)。97.4k66.2k43.0k97.4k66.2k43.0k31.0k20.1k14.4k12345678910圖SEQ圖\*ARABIC5兩個(gè)車(chē)間的電泳圖譜對(duì)比（1~4為還原電泳圖，7~10為非還原電泳，5為Marker，其中：1~2和9~10為新車(chē)間，3~4和7~8為原車(chē)間）可以看出兩個(gè)車(chē)間原液雜質(zhì)譜沒(méi)有差異，變更車(chē)間沒(méi)有對(duì)原液質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果兩個(gè)車(chē)間各去一批原液進(jìn)行高溫的強(qiáng)制降解試驗(yàn)，采用反相色譜、分子篩色譜和等電聚焦色譜檢測(cè)方法對(duì)降解途徑進(jìn)行分析，以比較降解途徑是否發(fā)生了改變。40℃溫度下放置，分別在第0、5和10天進(jìn)行性狀、酸堿度、相關(guān)蛋白、高分子蛋白、可見(jiàn)異物和含量檢測(cè)。兩者性狀和可見(jiàn)異物均符合規(guī)定，未發(fā)生顯著變化。兩者酸堿度未發(fā)生顯著變化。相關(guān)蛋白質(zhì)、高分子蛋白質(zhì)和含量反映了降解產(chǎn)物的變化，而高分子蛋白質(zhì)和含量采用相同的檢測(cè)方法，因此對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)和高分子蛋白質(zhì)的圖譜進(jìn)行了比較。在反相色譜檢測(cè)中，可以看到新老車(chē)間原液高溫加速條件下雜質(zhì)峰相同，未見(jiàn)其他新雜質(zhì)峰出現(xiàn)。在分子排阻色潽法檢測(cè)中也看到相同的結(jié)果。rhGH氧化脫氨—原車(chē)間rhGH氧化脫氨—原車(chē)間—新車(chē)間圖SEQ圖\*ARABIC6兩個(gè)車(chē)間高溫強(qiáng)制降解試驗(yàn)分子篩色譜對(duì)比圖rhGH二聚體—原車(chē)間rhGH二聚體—原車(chē)間—新車(chē)間圖SEQ圖\*ARABIC7兩個(gè)車(chē)間高溫強(qiáng)制降解試驗(yàn)反相色譜對(duì)比圖長(zhǎng)期穩(wěn)定性新車(chē)間重組人生長(zhǎng)激素原液12個(gè)月考察期內(nèi)，含量、高分子蛋白和相關(guān)蛋白敏感指標(biāo)均未發(fā)生顯著變化，和原車(chē)間一致。表SEQ表\*ARABIC15兩個(gè)車(chē)間原液長(zhǎng)期穩(wěn)定性的比較車(chē)間批次相關(guān)蛋白質(zhì)高分子蛋白質(zhì)含量(mg/ml)均值SD均值SD均值SD原車(chē)間12.0%0.31%0.3%0.05%14.300.2422.4%0.42%0.4%0.08%14.590.1632.5%0.36%0.3%0.07%14.540.17新車(chē)間12.1%0.26%0.1%0.00%13.500.1222.4%0.38%0.2%0.31%12.510.1632.5%0.35%0.0%0.00%14.200.06新車(chē)間原液12個(gè)月的穩(wěn)定性考察結(jié)果和老車(chē)間長(zhǎng)期穩(wěn)定性歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較,可以初步得出如下結(jié)論：性狀：所有批次在考察過(guò)程中均為無(wú)色澄清液體；鑒別4項(xiàng)、微生物限度、脫氨組份及細(xì)菌內(nèi)毒素等指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。相關(guān)蛋白含量均符合規(guī)定，兩個(gè)車(chē)間原液在貯存期間穩(wěn)定。高分子蛋白質(zhì)在留樣過(guò)程中變化幅度很小。在穩(wěn)性考察過(guò)程中蛋白含量幾乎不變。工藝驗(yàn)證結(jié)果和討論對(duì)重組人生長(zhǎng)激素原液相關(guān)的文件、培訓(xùn)、工況、工藝設(shè)備、生產(chǎn)操作和環(huán)境控制進(jìn)行了全面的驗(yàn)證，表明：生產(chǎn)、監(jiān)控及檢測(cè)人員培訓(xùn)到位，能滿(mǎn)足生產(chǎn)、監(jiān)控和檢測(cè)的要求；車(chē)間空調(diào)系統(tǒng)潔凈度均符合要求；水系統(tǒng)運(yùn)行平穩(wěn)，純化水和注射用水水質(zhì)均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，能滿(mǎn)足工藝生產(chǎn)要求；生產(chǎn)所用物料管理嚴(yán)格，均購(gòu)置于合格供應(yīng)商，并按要求檢測(cè)、存放和使用；現(xiàn)有的設(shè)備均完成了3Q，并運(yùn)行平穩(wěn)；主要中間品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性：純度和雜質(zhì)分布均和歷史數(shù)據(jù)相同，中間品質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)要求，未低于行動(dòng)限指標(biāo)，菌體得率和表達(dá)量和歷史數(shù)據(jù)一致.說(shuō)明各單元具有相同的去雜效率，變更車(chē)間沒(méi)有對(duì)中間品關(guān)鍵質(zhì)量屬性產(chǎn)生影響。成品的對(duì)比研究結(jié)果放行檢驗(yàn)結(jié)果兩個(gè)車(chē)間制劑的性狀、無(wú)菌、鑒別、裝量差異、異常毒性、溶液的澄清度與顏色和細(xì)菌內(nèi)毒素均符合成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并且沒(méi)有差異。比較兩個(gè)車(chē)間的定量指標(biāo)：酸堿度、水分、相關(guān)蛋白質(zhì)、高分子蛋白質(zhì)、電泳純度、不溶性微粒、含量也均符合成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，兩個(gè)車(chē)間的均值和SD基本一致，說(shuō)明變更車(chē)間沒(méi)有對(duì)上述指標(biāo)產(chǎn)生不利影響，兩者是一致的。雜質(zhì)分析和比較結(jié)果如下：反相色譜檢測(cè)，兩個(gè)車(chē)間各有相對(duì)保留時(shí)間一致的4個(gè)雜質(zhì)峰，除了這4個(gè)雜質(zhì)峰外，沒(méi)有出現(xiàn)其他不同的雜質(zhì)峰。并且這4個(gè)雜質(zhì)的比例也非常一致，說(shuō)明兩個(gè)車(chē)間質(zhì)量是一致的，變更車(chē)間沒(méi)有產(chǎn)生新的雜質(zhì)。分子篩檢測(cè)，兩個(gè)車(chē)間各有2個(gè)雜質(zhì)峰，除了相對(duì)保留時(shí)間0.88-0.90的二聚體峰外，在相對(duì)保留時(shí)間0.64-0.66還有一個(gè)未知雜質(zhì)。兩個(gè)車(chē)間均有此未知雜質(zhì)，變更車(chē)間沒(méi)有產(chǎn)生新的雜質(zhì)。通過(guò)比較非還原電泳圖譜，除主帶外，兩個(gè)車(chē)間各有1條相對(duì)遷移比例0.80-0.82的雜質(zhì)帶，制劑I車(chē)間較制劑III車(chē)間有一批多一條相對(duì)遷移比例0.85的雜質(zhì)帶，說(shuō)明變更車(chē)間沒(méi)有產(chǎn)生新的雜質(zhì)。通過(guò)上述比較可以看出兩個(gè)車(chē)間成品質(zhì)量一致，變更車(chē)間沒(méi)有對(duì)成品關(guān)鍵質(zhì)量屬性產(chǎn)生影響。生物學(xué)活性連續(xù)測(cè)定3批4IU規(guī)格成品的生物學(xué)活性，新車(chē)間平均生物學(xué)活性為4.4IU，和原車(chē)間平均4.2IU歷史數(shù)據(jù)一致。表SEQ表\*ARABIC16新車(chē)間3批成品生物活性結(jié)果批次123生物活性（IU/mg）4.44.34.5平均值4.4穩(wěn)定性強(qiáng)制降解試驗(yàn)比較了高溫降解試驗(yàn)兩個(gè)車(chē)間制劑反相色譜和尺寸排阻色譜的色譜圖，未發(fā)現(xiàn)新增雜質(zhì)峰。分析相關(guān)蛋白和高分子蛋白的增長(zhǎng)率，新車(chē)間制劑相關(guān)蛋白和高分子蛋白的增長(zhǎng)率略小于原車(chē)間制劑，兩者沒(méi)有顯著差異。兩個(gè)車(chē)間各取一批成品進(jìn)行了光照降解試驗(yàn)，用鋁箔包裝作為暗對(duì)照，分別在第0、5和10天取樣檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附件4。在4500LX光照10天，兩個(gè)車(chē)間的性狀、可見(jiàn)異物均符合規(guī)定，未發(fā)生顯著變化。表SEQ表\*ARABIC17光照試驗(yàn)的比較結(jié)果車(chē)間試驗(yàn)樣品酸堿度相關(guān)蛋白質(zhì)高分子蛋白質(zhì)含量測(cè)定原車(chē)間試驗(yàn)品7.28±0.022.59%±0.14%0.93%±0.02%104.3%±0.3%暗對(duì)照7.28±0.032.49%±0.03%0.92%±0.01%104.7%±0.5%新車(chē)間試驗(yàn)品7.28±0.022.89%±0.22%0.99%±0.02%103.2%±0.4%暗對(duì)照7.29±0.022.71%±0.10%0.98%±0.01%103.3%±0.3%和暗對(duì)照相比，兩個(gè)車(chē)間的酸堿度、高分子蛋白質(zhì)、含量均未發(fā)生顯著變化，相關(guān)蛋白有少許增長(zhǎng)，兩個(gè)車(chē)間產(chǎn)品沒(méi)有顯著差異。加速穩(wěn)定性成品6個(gè)月的加速穩(wěn)定性考察結(jié)果和老車(chē)間歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較（見(jiàn)REF_Ref354095955\h圖8），可以得出如下結(jié)果：性狀：所有批次在考察過(guò)程中均為無(wú)色澄清液體；鑒別、無(wú)菌、酸堿度及細(xì)菌內(nèi)毒素等指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。相關(guān)蛋白含量均符合規(guī)定，兩個(gè)車(chē)間相關(guān)蛋白的增長(zhǎng)速率一致。高分子蛋白質(zhì)在加速條件下