光譜檢測(cè)技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用

第2章光譜檢測(cè)技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一紫外透照燈1.光譜范圍和對(duì)應(yīng)的檢測(cè)儀器

400nm

650nmUltraVioletVisibleNearInfrared白光透照燈、普通酶標(biāo)儀、熒光化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀、測(cè)序儀、掃描儀顯微鏡測(cè)序儀、掃描儀凝膠圖像分析系統(tǒng)、核酸蛋白檢測(cè)儀、光密度掃描儀、激光掃描儀、熒光顯微鏡分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)、掃描酶標(biāo)儀現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一紫外線紫外線是德國(guó)物理學(xué)家里特在1801年發(fā)現(xiàn)的，一切高溫物體，如太陽(yáng)、弧光燈發(fā)出的光都含有紫外線。紫外線的作用主要是化學(xué)作用。紫外線有很強(qiáng)的熒光效應(yīng)，能使很多物質(zhì)發(fā)出熒光?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要部件紫外燈管和濾光片波長(zhǎng)254nm、302nm、365nm或2個(gè)、3個(gè)波長(zhǎng)組合一體用于檢測(cè)凝膠和膜上紫外線激發(fā)的熒光染料EB、Sybr-Green等紫外透照儀現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一可見(jiàn)光

A

可

見(jiàn)

光現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要部件日光燈管和磨砂玻璃波長(zhǎng)可見(jiàn)光用于檢測(cè)凝膠和膜上的染料硝酸銀、考馬斯亮藍(lán)等及放射自顯影膠片白光透照儀現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要部件光學(xué)系統(tǒng)（光源、濾光片、光電倍增管）機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)（步進(jìn)馬達(dá)）自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長(zhǎng)：340-700nm用于各種微孔板檢測(cè)普通酶標(biāo)儀現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Elx-800酶標(biāo)儀工作原理光電倍增管計(jì)算機(jī)打印機(jī)酶標(biāo)板濾光片光源現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一光電效應(yīng)在光（包括不可見(jiàn)光）的照射下從物體發(fā)射出電子的現(xiàn)象叫做光電效應(yīng)，發(fā)射出來(lái)的電子叫做光電子。真空光電管：真空的玻璃泡或在內(nèi)充有少量惰性氣體（如氬、氖、氦等）。泡的內(nèi)半壁涂有堿金屬，例如鈉、鋰、銫，作為陰極K，泡內(nèi)另有一陽(yáng)極A。將光電管連在電路里，當(dāng)光照射到陰極K時(shí)，電路里就產(chǎn)生電流，電流的強(qiáng)度取決于照射光的強(qiáng)度。光電管產(chǎn)生的電流很弱，可以用放大器把它放大。現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Elx-808酶標(biāo)儀工作原理濾光片輪鹵素?zé)衄F(xiàn)在是10頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一組成：CCD攝像頭變焦鏡、濾光片、近攝鏡暗箱紫外透照儀PCI圖像捕捉卡圖像捕捉及分析軟件熱敏打印機(jī)電腦及顯示器（OPTION）功能：圖像采集和分析凝膠圖像分析系統(tǒng)現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要部件光學(xué)系統(tǒng)（光源、濾光片、光電倍增管）數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)微量比色杯波長(zhǎng)：230、260、280、320、562、595nm用于各種生物樣品檢測(cè)核酸蛋白檢測(cè)儀現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一核酸蛋白檢測(cè)儀濾光片光源比色杯光電倍增管現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要部件光學(xué)系統(tǒng)（光源、單色器、光電倍增管）機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)（步進(jìn)馬達(dá)）自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長(zhǎng)：200-999nm，1nm步進(jìn)用于各種微孔板檢測(cè)全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀PowerWaveHTSynergy現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀工作原理現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一熒光技術(shù)簡(jiǎn)介現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一一、熒光發(fā)生過(guò)程

熒光產(chǎn)生于某些分子（通常是含多聚芳香烴的碳水化合物或雜環(huán)化合物）稱為熒光體或熒光染料。熒光探針是一個(gè)熒光體設(shè)計(jì)用于定位生物樣品的特異性區(qū)域或?qū)μ禺愋源碳ひ蜃影l(fā)生反應(yīng)。熒光發(fā)生是一個(gè)3階段的過(guò)程?，F(xiàn)在是17頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一①激發(fā)

外源的白熾燈或激光提供的能量（hvEX）的光子被熒光體吸收，產(chǎn)生被激發(fā)的電子單峰態(tài)（S1’）。這個(gè)過(guò)程是熒光和化學(xué)發(fā)光的區(qū)別，化學(xué)發(fā)光的激發(fā)態(tài)是由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的。

現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一②激發(fā)態(tài)的壽命期

激發(fā)態(tài)存在一個(gè)有限的時(shí)間（通常是1-10x10-9秒）。在這時(shí)間，熒光體經(jīng)歷構(gòu)象的改變和容易受到分子環(huán)境的相互作用的影響。這些過(guò)程有兩個(gè)重要的結(jié)果。第一，S1’的能量部分被消耗，形成一個(gè)衰減的單峰激發(fā)態(tài)（S1）即熒光發(fā)射的初始。第二，不是最初被激發(fā)的所有分子都通過(guò)熒光發(fā)射回到基態(tài)。其他的過(guò)程，象振動(dòng)淬滅，熒光能量傳遞也在S1’衰減。熒光量子的產(chǎn)生量，取決于激發(fā)的熒光光子數(shù)量與吸收的光子數(shù)量的比率，是衡量熒光效率的參數(shù)。

現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一③熒光發(fā)射

能量（hvEM）光子被激發(fā)，熒光體回到基態(tài)S0。由于能量在激發(fā)態(tài)壽命期的部分消耗，這些光子的能量較低，因此比激發(fā)光子hvEX有更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。這種由于（hvEM-hvEX）呈現(xiàn)的能量或波長(zhǎng)的差異稱作Stokes漂移。Stokes漂移奠定了熒光技術(shù)靈敏性的基礎(chǔ)，因?yàn)樗梢耘c激發(fā)光子在光譜上分離，而在一個(gè)較低的背景下檢測(cè)發(fā)射光子。相比較而言，吸收光分光測(cè)定法在透射光檢測(cè)時(shí)相對(duì)于較高水平的同一波長(zhǎng)的光。

現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一EmissionFExcitation熒光分子受到激發(fā)后釋放能量的3種方式：發(fā)光現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一EmissionExcitationF2F1Transfer熒光分子受到激發(fā)后釋放能量的3種方式：傳遞現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ExcitationBHFTransfer熒光分子受到激發(fā)后釋放能量的3種方式：發(fā)熱現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一二、熒光光譜

熒光發(fā)生的整個(gè)過(guò)程是循環(huán)的，除非熒光體在激發(fā)態(tài)不可逆轉(zhuǎn)的破壞（一個(gè)重要的現(xiàn)象稱作光漂白），同一熒光體可以反復(fù)地激發(fā)和檢測(cè)。對(duì)于溶液中多原子分子，由hvEX和hvEM呈現(xiàn)的不連續(xù)的電子躍遷被一個(gè)較寬的能量光譜稱作熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜取代。在兩種或更多的熒光體同時(shí)檢測(cè)時(shí)，這些光譜的帶寬是非常重要的參數(shù)。除了很少的例外，一般在稀釋溶液中單種熒光體的熒光激發(fā)光譜和它的吸收光譜是相同的。在同樣條件下，由于在激發(fā)態(tài)壽命期激發(fā)能量的部分消耗，熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長(zhǎng)是分離的。熒光發(fā)射強(qiáng)度是與在激發(fā)波長(zhǎng)的熒光激發(fā)光譜振幅成比例的?，F(xiàn)在是24頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一熒光光譜現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一三、熒光檢測(cè)熒光檢測(cè)儀器

熒光檢測(cè)系統(tǒng)的4個(gè)基本要素是：⑴激發(fā)光源，⑵熒光體，⑶將激發(fā)光子與發(fā)射光子分離的特定波長(zhǎng)的濾光片，⑷檢測(cè)器記錄發(fā)射光子并輸出，通常是電子信號(hào)或圖像。3種主要的熒光檢測(cè)儀器提供不同的數(shù)據(jù)。熒光分光光度計(jì)：測(cè)定液體樣品（uL-mL）熒光顯微鏡：解析熒光作為二維或三維空間位置定位功能流式細(xì)胞儀：測(cè)定流體中每個(gè)細(xì)胞的熒光，在大量樣品中進(jìn)行分選并識(shí)別和定量激光掃描儀現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一熒光信號(hào)

熒光強(qiáng)度的定量取決于這些參數(shù)：吸光度-由Beer-Lambert定律定義為摩爾消光系數(shù)的產(chǎn)物，光徑和稀釋濃度，染料的熒光量子的產(chǎn)量，激發(fā)光源強(qiáng)度和儀器熒光采集效率。在稀釋溶液或懸液中，熒光強(qiáng)度與這些參數(shù)成線性比例關(guān)系。當(dāng)樣品吸光度在1cm光徑超過(guò)0.05時(shí)，線性關(guān)系被自身吸收和內(nèi)濾光效應(yīng)扭曲。通過(guò)一個(gè)大的熒光Stokes漂移（例如分離為A1和E1）可以容易從Rayleigh散射激發(fā)光（EX）分離出熒光發(fā)射信號(hào)（S1）。標(biāo)記有熒光探針的生物分子通常都含有超過(guò)1個(gè)的熒光物，使信號(hào)分離更加復(fù)雜。另一個(gè)光信號(hào)（S2）可能是背景熒光或第二個(gè)熒光探針?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一背景熒光

熒光檢測(cè)的靈敏性會(huì)受到背景信號(hào)的很大影響，這些背景信號(hào)來(lái)自樣品內(nèi)在組分（自發(fā)熒光）或未結(jié)合的和非特異性結(jié)合的探針（試劑背景）。檢測(cè)中可以通過(guò)選擇濾光片或通過(guò)選擇更長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收和發(fā)射的探針來(lái)減小E2自發(fā)熒光對(duì)E1的影響。盡管將熒光檢測(cè)帶寬變窄增加了E1和E2間的分辨力，但是會(huì)影響總的熒光檢測(cè)強(qiáng)度。對(duì)于細(xì)胞、組織和生物體液的自發(fā)熒光，可以采用激發(fā)光＞500nm的探針減小熒光信號(hào)失真。但是，較長(zhǎng)波長(zhǎng)的激發(fā)光會(huì)受到密度介質(zhì)如組織的影響而發(fā)散減弱，就需要更強(qiáng)穿透力的激發(fā)光?，F(xiàn)在是28頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一熒光的兩種檢測(cè)光路現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一直接標(biāo)記－將熒光團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)直接銜接在核酸的雙鏈或單鏈上間接標(biāo)記－將帶有熒光團(tuán)標(biāo)記的NTP或dNTP通過(guò)酶反應(yīng)摻入到新合成的核酸鏈中熒光對(duì)核酸的修飾和標(biāo)記現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一PhysicalDataforIRDye700-CDImax=680nmemission=715nm=190,000LMol-1cm-1PhysicalDataforIRDye800-CDImax=780nmemission=815nm=205,000LMol-1cm-1核酸染料IRDye結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一HybridizeLabelDNA5minFastConvenientRobustLowcostIRDyeDNADNALabeling現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一切口平移法隨機(jī)引物摻入法逆轉(zhuǎn)錄合成摻入法AminallyldUTP與熒光團(tuán)的結(jié)合間接熒光標(biāo)記現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一UniversalLinkageSystem(ULS)platinum-basedchemistry氨基或硫醇基修飾的核酸可直接連接熒光團(tuán)胞嘧啶的硫化介導(dǎo)的熒光團(tuán)標(biāo)記直接熒光標(biāo)記現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一IRDye800Excitationmax=778nmEmissionmax=806nmE=180,000M-1cm-1Quantumyield=0.34Cy5.5Excitationmax=675nmEmissionmax=694nmE=250,000M-1cm-1Quantumyield=0.28蛋白染料IRDye結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一AntigenonMembrane1o1o+2oOR1o+2o1o+2o+3oIRDye800andCy5.5SecondaryandTertiaryLabeledAntibodiesLabeledAntibodies現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要部件光學(xué)系統(tǒng)（光源、濾光片、光電倍增管）機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)（步進(jìn)馬達(dá)）自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)：300-650nm發(fā)射波長(zhǎng)：350-700nm發(fā)光波長(zhǎng)：350-700nm用于各種微孔板檢測(cè)熒光、化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀Flx800Synergy現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要部件共聚焦光學(xué)系統(tǒng)（激光光源、濾光片、光電倍增管）機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)（步進(jìn)馬達(dá)）自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)：488、514、543、594、633nm發(fā)射波長(zhǎng)：500-700nm用于玻璃載片的生物芯片檢測(cè)ScanArray激光共聚焦掃描儀現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ScanArray激光共聚焦原理現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ScanArray熒光激發(fā)現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一顯微鏡光路圖現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一紅外線紅外線是英國(guó)物理學(xué)家赫謝爾在1800年發(fā)現(xiàn)的。紅外線最主要的作用是熱作用。紅外線的波長(zhǎng)較長(zhǎng)，因此衍射現(xiàn)象比較顯著，穿透力很強(qiáng)?，F(xiàn)在是42頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要部件共聚焦光學(xué)系統(tǒng)（激光光源、光電倍增管）機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)（步進(jìn)馬達(dá)）自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)：685、785nm發(fā)射波長(zhǎng)：715、815nm用于測(cè)序紅外激光自動(dòng)測(cè)序儀現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一紅外激光自動(dòng)測(cè)序儀現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要部件共聚焦光學(xué)系統(tǒng)（激光光源、光電倍增管）機(jī)械運(yùn)動(dòng)和定位系統(tǒng)（步進(jìn)馬達(dá)）自動(dòng)控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和傳輸系統(tǒng)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)：685、785nm發(fā)射波長(zhǎng)：715、815nm用于雜交膜檢測(cè)紅外激光掃描儀現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一紅外激光掃描儀原理現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一紅外激光掃描儀熒光激發(fā)IRD700激發(fā)IRD800激發(fā)

現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一熒光顯微鏡光路圖現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一濾光片結(jié)構(gòu)圖現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一熒光顯微鏡濾光片光路圖現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一化學(xué)發(fā)光技術(shù)簡(jiǎn)介現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一按光譜分類：狹義：可見(jiàn)光（400-700nm）廣義：紫外光（10-400nm）可見(jiàn)光（400-700nm）紅外光（700-40000nm）光的基本知識(shí)現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一熾熱光或白熾光(incandescence)-因熱而發(fā)光氣體激發(fā)(gasexcitation>-因電子或熱的激發(fā)而發(fā)光摩擦發(fā)光(triboluminescence)電激發(fā)光(electroluminescence)熒光(fluorescence)-因光激發(fā)而發(fā)光，但光源切斷后即不再發(fā)光磷光(phosphorescence)-因光激發(fā)而發(fā)光，但光源切斷后仍會(huì)持續(xù)發(fā)光化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence>-非生物體把多余的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽苌锇l(fā)光(bioluminescence)-生物體利用化學(xué)能發(fā)光發(fā)光物質(zhì)現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一

某些熒光物質(zhì)（例如Luminol,C8H7N3O2）可將化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的能量，轉(zhuǎn)化成使分子內(nèi)的電子由基態(tài)（groundstate）躍升到激發(fā)態(tài)（excitedstate），處于激發(fā)態(tài)的分子并不穩(wěn)定，將能量以光的形式釋放出來(lái)；有的光波長(zhǎng)為可見(jiàn)光范圍，但占多數(shù)的是熒光（fluorescence）?；瘜W(xué)發(fā)光的原理現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一雜交檢測(cè)中的信號(hào)物質(zhì)（非放射性標(biāo)記）：核酸雜交（Southern&NorthernBlot）蛋白印跡（WesternBlot）酶聯(lián)免疫（Elisa）其他：dot/slot雜交、原位雜交、噬菌體文庫(kù)篩選、菌落文庫(kù)（質(zhì)粒文庫(kù)）篩選…

化學(xué)發(fā)光在生物學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一一般需要一定的發(fā)光底物及發(fā)光增強(qiáng)劑（如CDP-Star，461nm，藍(lán)光）,并配有各自的過(guò)氧化物酶系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)化學(xué)發(fā)光及增強(qiáng)作用，將光量放大后，在X片上發(fā)光自顯影，將特異結(jié)合條帶顯示出來(lái)?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)敏感性高，除借助特殊儀器檢測(cè)外，需要在暗室進(jìn)行X光片曝光，曝光時(shí)間要掌握適度以便得到最佳信號(hào)強(qiáng)度。此外，由于不同發(fā)光底物持續(xù)發(fā)光時(shí)間和強(qiáng)度不同，除了摸索曝光時(shí)間外還要注意在穩(wěn)定持續(xù)發(fā)光時(shí)間內(nèi)可以多次曝光。。

生物學(xué)中化學(xué)發(fā)光檢測(cè)原理現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Luminol（～430nm）CSPD發(fā)光最強(qiáng)最持久：CDP-Star（～460nm，藍(lán)光）Sapphire-II?發(fā)光增強(qiáng)劑Emerald-II?發(fā)光增強(qiáng)劑注：一般的試劑盒中已將發(fā)光底物與發(fā)光增強(qiáng)劑預(yù)先混合為發(fā)光底物L(fēng)uminol幾種常用的發(fā)光底物及增強(qiáng)劑現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一核酸雜交：生物素標(biāo)探針－酶（AP）標(biāo)生物素抗體或Strepavidin－CDP-Star底物生物素標(biāo)探針－酶（AP）標(biāo)生物素抗體或Strepavidin－CDPD底物生物素標(biāo)探針－酶（HRP）標(biāo)生物素抗體或Strepavidin－EnhancedLuminol底物熒光素標(biāo)探針－酶（AP）標(biāo)抗熒光素抗體－CDP-Star底物熒光素標(biāo)探針－酶（HRP）標(biāo)抗熒光素抗體－EnhancedLuminol底物地高辛標(biāo)探針－酶（AP）標(biāo)抗地高辛抗體－CDPD底物酶（專利的耐熱AP）標(biāo)探針－發(fā)光底物幾種常用的試劑盒檢測(cè)原理現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一核酸抽提電泳轉(zhuǎn)膜生物素標(biāo)記探針（隨機(jī)引物法PCR摻入法）雜交、洗脫酶標(biāo)生物素抗體或結(jié)合物敷育底物敷育化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：X光片壓片－曝光－顯影－定影實(shí)驗(yàn)流程

舉例NEBlotPhototopeKit&Phototope-StarChemiluminescentDetectionKit現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一特點(diǎn)：穩(wěn)定：32P-標(biāo)記的探針只能放置幾天，而生物素標(biāo)記的探針可放置較長(zhǎng)時(shí)間敏感：可檢測(cè)哺乳動(dòng)物DNA中的單拷貝基因（<1pg），與同位素相當(dāng)?

快速：整個(gè)檢測(cè)程序只需40分鐘（曝光時(shí)間只需1-10分鐘，需要優(yōu)化）?發(fā)光可持續(xù)幾天，可多次曝光，以獲取最佳信號(hào)強(qiáng)度NEBlotPhototopeKit&Phototope-StarChemiluminescentDetectionKit現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一AmbionBioDetectTMNonisotopicDetectionKit舉例現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一NEN公司化學(xué)熒光素/生物素標(biāo)發(fā)光檢測(cè)試劑盒晶美公司RNADetector?NorthernBlottingKit

DNADetector?GenomicSouthernBlottingKitTropix（ABI）Southern-Light?ChemiluminescenceNucleicAcidDetectionSystemSouthern-Star?ChemiluminescenceNucleicAcidDetectionSystemAmershamAlkphosLabellingandDetectionSystemRocheDIGLuminescentDetectionKit其他產(chǎn)品現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一酶（AP）標(biāo)二抗－CDP-Star底物酶（AP）標(biāo)二抗－CDPD底物生物素標(biāo)一抗－酶（HRP）標(biāo)生物素抗體或Strepavidin－ECL試劑ECL:EnhancedChemiluminescence，EnhancedLuminol底物檢測(cè)限：DAB顯色：對(duì)HRP敏感，1ngECL化學(xué)發(fā)光：<pgSuperSignal（PIERCE，ECL）化學(xué)發(fā)光：10-15fg蛋白雜交現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一CSTPhototope?-HRP化學(xué)發(fā)光法Western

優(yōu)點(diǎn)

?

敏感?？蓹z測(cè)pg級(jí)蛋白質(zhì)。

?

快速。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不超過(guò)2小時(shí)。曝光時(shí)間從數(shù)秒到10分鐘。

?

定量。

舉例蛋白雜交現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ECLWesternBlottingDetectionReagentsECLPlusWesternBlottingDetectionReagents（4to20-foldsensitivity）舉例AmershamECLProteinBiotinylationModule/System現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一TropixWestern-Light?SystemWestern-Star?System（3-to4-foldsensitivity）酶（AP）標(biāo)二抗－CDPD/CDP-Star底物舉例其他產(chǎn)品現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一酶（AP）標(biāo)二抗－CDPD/CDP-Star底物酶聯(lián)免疫現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一四種底物及增強(qiáng)劑搭配方式適用于夾心法，競(jìng)爭(zhēng)法免疫分析，DNA探針捕獲分析配有TR717化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)舉例TropixELISA-LightImmunoassaySystem現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一1.X光片壓片（傳統(tǒng)方法）但曝光時(shí)間需要摸索，壓片法有一定不便，定量也不準(zhǔn)2.掃描儀一定波長(zhǎng)范圍掃描3.成像儀CooledCCD4.熒光化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Typhoon?8600

Typhoon?9200

Typhoon?9210

Typhoon?9400

Typhoon?9410

舉例AmershamImaging&Analysis掃描儀現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Typhoon9410VariableModeImagerunitesprovenstoragephosphorautoradiographytechnologywithfour-color,non-radioactivefluorescentlabellingtechniques.ForDNA,RNA,andproteinsamples,choosefrom:storagephosphorautoradiographydirectblue-excitedfluorescence(457,488

nm)directgreen-excitedfluorescence(532

nm)directred-excitedfluorescence(633

nm)chemiluminescenceAmershamImaging&Analysis掃描儀現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一WhatImagingSystemdoIneed?OptionalDarkroomforFluorescenceChemiluminescenceonlyGGnSamples>15x12cmCGChemiluminescence&FluorescenceReducedBudgetHigherperformanceCG2XECG2MGUV/whitelightgelsReducedBudgetImagesonlyDGGeneToolsMCSGeneToolsMCSPGeneTools/GeneDirectoryMCSPDGGAddGelAnalysis現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一FromGeniusSeries現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一GeneGnomeFrom現(xiàn)在是74頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一BioImagingProductLineDigiDoc-ItSystem DigitalSnapShotBioDoc-ItSystem NoComputer GDS-8000System StandardPC ChemiSystem Expression BioChemiSystem Sensitivity OptiChemiSystem DynamicRange BioMicroSystem RGBColor BioDensitySystem Scanner 舉例現(xiàn)在是75頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ChemiSystem

GeneandProteinExpressionPicogramLevelSensitivityDetection2-4TimesLongerThanFilmCooled(-35C)CCDCamera8-BitMaximumSignal-to-NoiseRatioChemiImager4400ChemiDocMultiGenius450,000pixels現(xiàn)在是76頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一BioChemiSystemGeneandProteinQuantitationMid-FemtogramLevelSensitivitySameDetectionTimeasFilmCooled(-40C)DigitalCCDCamera12,14and16-BitAcquisitionFluorChem8800VersaDoc3000440CF1.45millionpixels現(xiàn)在是77頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一OptiChemiSystemDetailedProteinQuantitationLow-FemtogramLevelSensitivityOneHalftheDetectionTimeasFilmCooled(-85C)DigitalCCDCamera14and16-BitPerformanceFujiLAS-1000VersaDoc5000LumiImager1.40millionpixels現(xiàn)在是78頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一FUJIFILMLAS-1000CCDphotoelement舉例現(xiàn)在是79頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Tropix公司是化學(xué)發(fā)光技術(shù)專業(yè)廠家，專門從事化學(xué)發(fā)光相關(guān)儀器、應(yīng)用試劑的生產(chǎn)和研發(fā)。在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)方面擁有355項(xiàng)專利。TropixTR717化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀（AppliedBiosystems）現(xiàn)在是80頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一1.靈敏度：數(shù)字光子計(jì)數(shù)器

可檢測(cè)5×10-21摩爾AP分子，定量線性范圍達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)采用光導(dǎo)纖維探頭和屏蔽技術(shù)，孔間信號(hào)相互干擾小于3×10-5，光電倍增管檢測(cè)器波長(zhǎng)范圍：380nm～630nm2.靈活性

96孔或384孔微板，可編程讀板方式具有兩個(gè)RS232接口，可兼容目前市售的全自動(dòng)機(jī)械手臂控溫范圍：室溫以上5℃～42℃專利的特氟隆（Teflon）材質(zhì)進(jìn)樣器，快速均勻混合反應(yīng)液，保證結(jié)果精確性3.應(yīng)用的廣泛性報(bào)告基因分析，探針雜交和免疫分析：TropixTR717化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀特性（AppliedBiosystems）現(xiàn)在是81頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一紫外與熒光光譜在蛋白質(zhì)

研究中的應(yīng)用現(xiàn)在是82頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一主要內(nèi)容UV/vis

基礎(chǔ)、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)、應(yīng)用

Fluorescence

基礎(chǔ)、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)、

常規(guī)熒光、淬滅、熒光共振能量傳遞(FRET)現(xiàn)在是83頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一譜學(xué)方法現(xiàn)在是84頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一10100Kcal/molBondsbreakLightusedforvisionandphotosynthesisElectromagneticspectrumNuclearspinvibrationsElectronictransitionsThelongerthewavelength,thelowertheenergy.現(xiàn)在是85頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一基本原理1-LambertLawThefractionoflightabsorbedbyatransparentmediumisindependentoftheincidentintensity,andeachsuccessivelayerofthemediumabsorbsanequalfractionofthelightpassingthroughit.

Log10(I0/I)=kl現(xiàn)在是86頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一基本原理2-Beer’sLawTheamountoflightabsorbedisproportionaltothenumberofmoleculesofthechromophorethroughwhichthelightpasses.

k=c現(xiàn)在是87頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一DeviationsfromtheBeer-Lambertlaw強(qiáng)吸收

高濃度現(xiàn)在是88頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一噪聲與誤差現(xiàn)在是89頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一WavelengthAbsorbanceConcentrationABAB波長(zhǎng)選擇現(xiàn)在是90頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一等吸收點(diǎn)(Isosbesticpoint)等吸收點(diǎn)常作為體系中只有兩種成分(狀態(tài))的指示

可作為參比波長(zhǎng)

若有等吸收點(diǎn),則不需要為為每個(gè)譜作基線現(xiàn)在是91頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一單光路現(xiàn)在是92頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一雙光路現(xiàn)在是93頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一雙波長(zhǎng)現(xiàn)在是94頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一二極管陣列檢測(cè)器現(xiàn)在是95頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一二極管陣列光譜儀動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在是96頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一常規(guī)吸收光譜實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)樣品準(zhǔn)備波長(zhǎng)選擇池子選擇掃描速度選擇帶寬選擇石英、玻璃、塑料慢快若樣品不穩(wěn)定若噪聲大，分辨率低等窄寬若噪聲大合適的濃度，正確的參比現(xiàn)在是97頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一紫外/可見(jiàn)光譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用濃度測(cè)定

構(gòu)象變化研究

相互作用研究現(xiàn)在是98頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一蛋白質(zhì)主鏈的紫外吸收肽鍵在<250nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)有較大吸收

現(xiàn)在是99頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一蛋白質(zhì)濃度測(cè)定190nm10000l/mol.cm

190nm比280nm大~100倍

但溶劑吸收也較大現(xiàn)在是100頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一溶劑的吸收現(xiàn)在是101頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一蛋白質(zhì)中氨基酸的紫外吸收光譜1mM0.1mM0.1mM二硫鍵在250nm附近有弱吸收現(xiàn)在是102頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是103頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一確定蛋白質(zhì)的消光系數(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的消光系數(shù)

ProtParam:/tools/protparam.html現(xiàn)在是104頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Tyr的吸收譜與pH有關(guān)pHtitrationcanbeusedtodetermine

-

whetherTyrisinternalorexternal

-polarityofenvironmentmaxatpH6:274nmmaxatpH13:295nm現(xiàn)在是105頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一環(huán)境極性的影響B(tài)lueshiftofspectrainpolarsolventWeakerabsorptionofTyrinpolarsolvent現(xiàn)在是106頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一蛋白質(zhì)構(gòu)象變化研究AbsorptionspectraofPoly-L-LysHCl:randomcoilatpH6.0,25oC(bold);-HelixatpH10.8,25oC(dotted);-strandatpH10.8,52oC(dashed).現(xiàn)在是107頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一蛋白質(zhì)折疊/變性研究現(xiàn)在是108頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一熒光光譜現(xiàn)在是109頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一0330TheFranck-Condonprinciple:transitionsareverticalinbothabsorptionandemissionTheFranck-Condonfactoristhesameforabsorptionandfluorescence00011003063060Exceptions:-verylonglivedS1state:emissionoccursfromadifferentgeometry.-Reactionsfromtheexcitedstate.現(xiàn)在是110頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一量子產(chǎn)率F=發(fā)射的光子數(shù)/吸收的光子數(shù)

現(xiàn)在是111頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一熒光強(qiáng)度IF=I0(1-10-cl)F

若cl很小，則近似：IF=I0(cl)FInnerfiltereffect

現(xiàn)在是112頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Innerfiltereffect所以，實(shí)驗(yàn)中，A,EX<0.1現(xiàn)在是113頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一RamanandRayleighScatteringTwopotentialsourcesofbackgroundradiationareRamanandRayleighscattering.Bothofthesephenomenaariseduetovibrationalchangesinducedinmoleculesbyincidentradiation.Bothcanalsobedescribedasscatteredlight.TheRamanlinesareofdifferentfrequencyfromtheincidentlightandusuallyoflongerwavelength.Rayleighradiationisscatteredlightofthesamefrequencyastheincidentlight.現(xiàn)在是114頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一RayleighScattering強(qiáng)度與r6/4成正比不能通過(guò)減空白來(lái)消除

選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)從比激發(fā)波長(zhǎng)大(10nm)處開(kāi)始收譜減少帶寬現(xiàn)在是115頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Ramanscattering因水中O-H收縮(3300cm-1):

1/

RA=1/EX–0.00033現(xiàn)在是116頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一EnvironmentalSensitivityFluorophorescanbeaffectedbyalargenumberofenvironmentalfactorsincludingsuchparametersaspH,ionicstrength,non-covalentinteractions,lightintensity,temperatureandsoon.

Boththeexcitationandemissionwavelengthsandthequantumyieldcanallbechangedbyenvironmentalfactors.現(xiàn)在是117頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一溫度熒光一般隨溫度上升而減弱熒光實(shí)驗(yàn)需要恒溫現(xiàn)在是118頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一2waysofmeasuringfluorescenceEmissionspectrum-excitationλconstant,measurefluorescenceintensityofemissionagainstλ,I.e.spectrumofemittedlight.Excitationspectrum–measurefluorescenceintensityatdifferentexcitationλ,similartoabsorptionspectra.現(xiàn)在是119頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ExcitationspectrumExcitationspectrumshouldcorrespondcolselywiththeabsorptionspectrumofthemoleculethatisresponsibleforthefluorescence.Excitationspectrumrevealswhetherthesampleishomogeneous,andwhetherallfluorescencefeaturesresultfromasinglemolecule.現(xiàn)在是120頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ExperimentsSpectralshifts:Intrinsic,

Extrinsic

FluorescenceFluorescencequenching:Internal,ExternalFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)Rotationofmolecules:fluorescenceanisotropyFluorescencelifetime…..現(xiàn)在是121頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ProteinintrinsicfluorescenceTrpfluorescencecanbeselectivelyexcitedat295-305nm.(toavoidexcitationofTyr)現(xiàn)在是122頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Trpisthedominantintrinsicfluorophoreinproteins現(xiàn)在是123頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Trpfluorescence

isverysensitivetoitslocalenvironmentItispossibletoseechangesinemissionspectrainresponsetoconformationalchanges,subunitassociation,substratebinding,denaturation,andanythingthataffectsthelocalenvironmentsurrondingtheindolering.Also,Trpappearstobeuniquelysensitivetocollisionalquenching,eitherbyexternallyaddedquenchers,orbynearbygroupsintheprotein.現(xiàn)在是124頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一LocalelectricfieldscausespectralshiftsGasphasemm*solventSolventcanaffectthegroundstateandexcitedstatemoleculescausingspectralshiftExample:Hbondingtotryptophan.Changesitsabsorptionbyabout10nm現(xiàn)在是125頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一FluorescenceoftryptophandependsuponthedipolarnatureofthesolventCa-parvalbumin:tryptophanisburied,305nmCa-freeparvalbumin:tryptophanisexposedtosolventTryptophaninvarioussolvents:hexane,trehaloseglass,glycerol,waterFluorescencespectralshiftscanbeverylarge現(xiàn)在是126頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Tyrfluorescence若蛋白質(zhì)只含TYR,不含TRP：

蛋白質(zhì)變性后，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)?，F(xiàn)在是127頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一GFPisisolatedfromthePacificjellyfishAequoreavictoriaandnowplayscentralrolesinbiochemistryandcellbiologyduetoitswidespreaduseasaninvivoreporterofgeneexpression,celllineage,protein-proteininteractionsandproteintrafficking

GFPcanbefusedtoanotherproteineitherN-orC-terminally.ThisisduetothefactthatbothterminiofGFPappearratherflexibleonthesurfaceofthebeta-can,sothatGFP'sstructureisnotsignificantlydistortedordestroyedbythefusedprotein.RibbondiagramoftheGreenFluorescentProtein(GFP)drawnfromthewild-typecrystalstructure.Theburiedchromophore,whichisresponsibleforGFP'sluminescence,isshowninfullatomicdetail.GreenFluorescentProtein(GFP)現(xiàn)在是128頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Differentcolourformsof

GFPAdditionallyseveraldifferentcolourformsof

GFP

havebeenproduced.

blue,

cyan,

green,and

yellow

FPorBFP,CFP,GFPandYFP.現(xiàn)在是129頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是130頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Fluorescenceemissionspectraofequalconcentrationsof1,8-ANSinethanol:watermixtures.Thelabelsadjacenttoeachcurveindicatethepercentageofethanolinthesolventmixture.ProteinExtrinsicfluorescenceANS(1-anilinonaphthalene-8-sulfonicacid)1-苯胺基萘-8-磺酸strongfluorescenceenhancementwhenitsexposuretowaterislowered現(xiàn)在是131頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Fluorescenceenhancementof1,8-ANS,uponbindingtoprotein.Theimageshowsaqueoussolutionsof1,8-ANSexcitedbyultravioletlight.Additionofprotein(bovineserumalbumin)tothesolutioninthecuvetteontheleftresultsinintensebluefluorescence.Thefluorescenceofuncomplexedfreedyeinthecuvetteontherightisnegligibleincomparison.1,8-ANSisasensitiveprobeforpartiallyfoldedintermediatesinprotein-foldingpathways.MoltenglobuleintermediatesarecharacterizedbyparticularlyhighANSfluorescenceintensitiesduetotheexposureofhydrophobiccoreregionsthatareinaccessibletothedyeinthenativestructure.現(xiàn)在是132頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ANSbindingofsHSP16.5inGdnHCl

現(xiàn)在是133頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一TitrationofANSfluorescenceat475nm

現(xiàn)在是134頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Haemoglobinisacomplexofasmallprostheticgroupwiththeproteinapohaemoglobin.TheextrinsicfluorANSfluoresceswhenaddedtosolutionsofapohaemoglobinbutnotwithhaemoglobin.Theadditionofhaemtotheapohaemoglobin-ANScomplexeliminatesthefluorescencebydisplacingANS.ThistellsusthatANSandthehaemgroupbindtothesamesite.SinceANSisonlyfluorescentinhighlynon-polarenvironments,thehaemmustbindtoahighlynon-polarsite.ThiswouldgivevaluablecluesintheinterpretationofX-raydiffractionpatterns.E.g.youwouldknowthatacertainconfigurationofaminoacidscouldbethepointofinteractionbetweenhaemandproteinwhenbuildingthestructure.Extrinsicfluorescenceexamples現(xiàn)在是135頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一FluorescenceQuenchingInternalquenchingduetointrinsicstructuralfeaturee.g.structuralrearrangement.Externalquenchinginteractionoftheexcitedmoleculewithanothermoleculeinthesampleorabsorptionofexcitingoremittedlightbyanotherchromophoreinsample.現(xiàn)在是136頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一IntramolecularquenchingTyroftenisquenchedbynearbytryptophanesTrpfluorescencecanbequenchedbyneighbouringprotonatedacidgroups.IfthepKmeasuredbymonitoringtrpfluorescenceisthesameasthepKforaknownionisablegroup(e.g.acarboxyl)thenthegroupmustbenearthetrp.現(xiàn)在是137頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一ExternalquenchingAcrylamide,I-,Cs+現(xiàn)在是138頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Stern-VolmerequationFluorescencequenchingisafunctionof:TheexcitedstatelifetimeThediffusion-limitedquenchingconstantTheconcentrationofthequencherTheSternVolmerslope:

KSV=skQF0/F

=1+tskQ[Q]Stern-VolmerequationAsafirstproximationthevalueofKSVrevealsthedegreeOfexposuretothesolventofaTrpresidue.現(xiàn)在是139頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一,0M,1M,2M,3M,4M,5M,6MStern-VolmerplotatvariousGdnHClconcentrationsAcrylamidequenchingofTrpfluorescence

現(xiàn)在是140頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Stern-Volmerconstants

現(xiàn)在是141頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一FluorescenceResonanceEnergyTransferKnownasfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)orF?rsterenergytransfer.Itistheradiationlesstransferofexcitationenergyfromadonortoanacceptor.Animportantconsequenceofthistransferisthatthereisnoemissionoflightbythedonor.Theacceptormayormaynotbefluorescent.FRETisadistance-dependentinteractionwheretheenergytransferoccurstypicallyoveradistanceof1-10nm.ThedistancedependentnatureofFRETishighlightedbythefactthatitisproportionaltotheinversesixthpoweroftheintermolecularseparation.

現(xiàn)在是142頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一Ifthefluorophores(extrinsicorintrinsic)haveuniquelocationswithintheproteinorcomplex,itispossibleforemissionlightenergyfromAtobeabsorbedbyBandtobeemittedaspartofB’semissionspectrumA/QFluorAλ2λ1AbsorbanceemissionA/Qλ(nm)FluorBλ2λ3AbsorbanceemissionFluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)現(xiàn)在是143頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一FRETisdependentonthedistance,R,betweenthetwofluors.Usedtomeasuredistancesinproteins,membranes,¯omolecularassemblies10to80?apart.Efficiencyoftheenergytransfer(E)fromdonortoacceptor(AtoB)definedbyE=R06

R06+R6

R=distancebetweenA&B,R0isaconstantcalculatedfromabsorptionandemissionspectra.Ecanbecalculatedfromfluorescenceintensity(F)

E=Fda/FdFda=Finthepresenceofacceptor,Fd=Fintheabsenceofacceptor.OnceEisknown,Rcanbecalculatedfromthefirstequation

ifR0isknown.FRETisusedasa‘spectroscopicruler’現(xiàn)在是144頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一theC-terminalsubdomainofthemoleculeformsanensembleofcompactlooselyfoldedconformationswithnative-likefeatures.FRET應(yīng)用實(shí)例現(xiàn)在是145頁(yè)\一共有151頁(yè)\編輯于星期一IntramolecularandintermolecularFRET.(a)IntramolecularFRETcanoccurwhenboththedonorandacceptorchromophoresareonthesamehostmolecule,whichundergoesatransition,forexample,between‘open’and‘closed’conformations.IneachsquareboxcorrespondingtoCFPorYFP(shownincyanoryellow,respectively),adiagonallinerepresentsthechromophore.TheamountofFRETtransferredstronglydependsontherelativeorientationanddistancebetweenthedonorandacceptorchromophores:theparallelorientationandtheshorterdistance(<100?)generallyyieldlargerFRET.(b)IntermolecularFRETcanoccurbetweenonemolecule(proteinA)fusedtothedonor(CFP)andanothermolecule(proteinB)fusedtotheacceptor(YFP).Whenthetwoproteinsbindt