生物分離工程電泳

生物分離工程電泳1第1頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳在生化分離中的應(yīng)用分離和純化手段（實(shí)驗(yàn)室）

蛋白、酶、核酸純化基礎(chǔ)理論研究

醋酸纖維薄膜電泳分析血清蛋白

瓊脂對(duì)流免疫電泳分析病人血清，早期診斷肝癌

高壓電泳分離肽段，研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)；

凝膠電泳技術(shù)分離分析酶，蛋白質(zhì)，核酸2第2頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳原理指帶電粒子在電場(chǎng)中朝與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象CATHODEANODE+--+3第3頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六帶電顆粒小離子：Cl-,甘氨酸離子

生物大分子：蛋白質(zhì)、核酸等

蛋白質(zhì)分子是由氨基酸組成的，而氨基酸帶有可解離的氨基和羧基，是典型的兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下就會(huì)解離而帶電

4第4頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六用支持體的電泳技術(shù)1.濾紙電泳2.醋酸纖維薄膜電泳3.薄層電泳4.非凝膠性支持體區(qū)帶電泳(淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)5.凝膠支持體區(qū)帶電泳(聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠)不用支持體的電泳技術(shù)Tiselius或微量電泳

操作形式：1.區(qū)帶電泳2.等速電泳3.等電點(diǎn)電泳電泳形式分類(lèi)5第5頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電泳速度v=EZe/(6пrη)+--Z，rEf’fE:電場(chǎng)強(qiáng)度,V/cmZ:

溶質(zhì)的荷電荷數(shù)η：溶液粘度e:1.610-19C1.粒子在電場(chǎng)中所受的力:

f=EZe2.粒子在液體中泳動(dòng)所受的阻力：根據(jù)Stoke定律f′=6пrηv平衡時(shí)：f=f’恒定泳動(dòng)速度:溶質(zhì)的遷移率：u0=v/E=Ze/(6пrη)6第6頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六區(qū)帶電泳7第7頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響泳動(dòng)速度的因素FrictionCharge外加電流電壓分子量分子形狀分子的等電點(diǎn)Voltage+--+8第8頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響泳動(dòng)速度的因素-1

帶電顆粒的性質(zhì)

所帶凈電荷的數(shù)量

顆粒大小

形狀

v=EZe/(6пrη)恒定泳動(dòng)速度:9第9頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響泳動(dòng)速度的因素-2

粒子的pI和溶液pH值

protein白蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白pI4.05.065.17.1白蛋白

>

α2球蛋白

>β球蛋白

>γ球蛋白血清中的四種蛋白pH8.6的電泳緩沖液中電泳，泳動(dòng)速度：10第10頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響泳動(dòng)速度的因素-3

外加電流電壓

U，E，v(1)常壓電泳:

U=100~500V，E=2~10V/cm

t=幾小時(shí)至數(shù)天

適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)(2)高壓電泳：U=500~1000V，E=50~200V/cm

t=幾分鐘

分離氨基酸，肽，核苷酸，糖類(lèi)等小分子物質(zhì)

由于電壓升高，電流也隨之增大，故需冷卻裝置

v=EZe/(6пrη)恒定泳動(dòng)速度:11第11頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響泳動(dòng)速度的因素-4

溶液的離子強(qiáng)度I=(∑cizi2)/2

—保持足夠緩沖能力前提下，離子強(qiáng)度要最小—溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動(dòng)速度越慢，反之越快

—最適離子強(qiáng)度0.02–0.2

12第12頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響泳動(dòng)速度的因素-5

電滲作用

在電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)濾紙電泳CellulosepH=8.6電泳血清蛋白+-γ球蛋白-濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負(fù)電荷與帶電顆粒一樣可以吸引正離子介質(zhì)向陰極移動(dòng)γ球蛋白:顆粒大，凈電荷少13第13頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電滲作用—石英毛細(xì)管電泳

CapillaryElectrophoresis

pH>3內(nèi)表面帶負(fù)電毛細(xì)管管壁分布有

大量的硅烷醇（Si-OH）陽(yáng)離子被吸附在管壁而形成了雙電層

V=V(電滲流)＋V(電泳)V(正)>V(中)>V(負(fù))14第14頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六影響泳動(dòng)速度的因素-6

對(duì)支持物的選擇

支持物均勻，吸附力小，否則電場(chǎng)強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶的分離

瓊脂糖和淀粉在電場(chǎng)作用下易電離帶負(fù)電荷，產(chǎn)生電滲流，應(yīng)用范圍受限制。聚丙烯酰胺凝膠常用。15第15頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六Example1

計(jì)劃在0.82v/cm的電位梯度下，用凝膠電泳的方法將兩種胞外蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，這兩種蛋白質(zhì)的遷移率分別為4.110-5和5.110-5cm2/V.s。如果開(kāi)始時(shí)混合物在凝膠上寬度為0.2cm，估計(jì)把這兩種蛋白質(zhì)分開(kāi)需多長(zhǎng)時(shí)間？在估算時(shí)，可忽略擴(kuò)散的影響。

u0=v/E=eZ/（6пrη）解：溶質(zhì)的遷移率為：16第16頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六凝膠電泳17第17頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

凝膠電泳法鑄膠電泳染色脫色凝膠電泳樣本處理Trypsin濃縮層膠體分離層膠體取出膠體染色脫色18第18頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六Pierce商品供應(yīng)預(yù)鑄膠片梯度或固定濃度膠體10,12.15樣本槽中性pH緩沖液拋棄式塑料外殼膠體1mm厚度19第19頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)組成1電泳系統(tǒng)pH膠體濃度緩沖液上層(負(fù)極)緩沖液2樣本溶液3濃縮層膠體6.84分離層膠體膠體5下層(正極)緩沖液Tris-HClTris-HClTris-glycineTris-glycineTris-glycine8.38.38.38.35%7.5~20%---●膠體不連續(xù)性有濃縮樣品的作用20第20頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六濃縮層內(nèi)的等速電泳21第21頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六濃縮層膠體中的三個(gè)主要作用角色Glycine:Negativecharged

Nonetcharge

Chlorideion:Proteins:小分子大分子22第22頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六SDSGelElecrtophoresis23第23頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六SDS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量PAGE凝膠電泳分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、形狀及凈電荷

在PAGE中加入一定量的SDS

蛋白質(zhì)分子的遷移速度主要取決于分子量大小24第24頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六SDS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量SDS：陰離子去污劑、水溶液中以單體和分子團(tuán)存在。能破壞蛋白質(zhì)分子之間及與其他分子間的非共價(jià)鍵，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，使蛋白質(zhì)喪失了原有電荷狀態(tài)，形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)。25第25頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六SDS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量操作：分離膠12%濃縮膠5%加樣電泳染色、脫色凝膠干燥確定分子量26第26頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六樣品分子量的確定M為蛋白質(zhì)分子量、m相對(duì)遷移率、b為斜率、K為截距。一定條件下K和b為常數(shù)，根據(jù)遷移率可求得分子量。lgMw=b*mR+K

蛋白質(zhì)分子量在15000-200000之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)手呈線性關(guān)系：27第27頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六樣品分子量的確定相對(duì)遷移距離=蛋白質(zhì)遷移距離/燃料遷移距離

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)(lgMr)為縱座標(biāo)，相對(duì)遷移距離為橫座標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。28第28頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三種不同性質(zhì)蛋白質(zhì)的電泳比較MolecularWeightpINativePAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternaryStructureXYZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastXYZ--+29第29頁(yè)，共30頁(yè)，2023年，2月20日，星期六單元體分子量的測(cè)定：SD