植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)專家講座

植物病原細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第1頁試驗(yàn)一植物病原細(xì)菌慣用培養(yǎng)基

制作與滅菌

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第2頁1.了解細(xì)菌培養(yǎng)基種類；2.掌握慣用細(xì)菌培養(yǎng)基配方和制作方法；3.掌握培養(yǎng)基滅菌方法。一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第3頁二、試驗(yàn)內(nèi)容和操作方法

（1）配方：牛肉膏3ｇ，蛋白胨10ｇ，NaCl5ｇ，瓊脂20ｇ，蒸餾水1000ｍL。1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)：分離和培養(yǎng)最慣用（2）配制過程：將牛肉膏、蛋白胨、NaCl溶于蒸餾水后，調(diào)整pH7.2，加入瓊脂溶化后分裝于三角瓶和試管。（一）培養(yǎng)基配制植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第4頁2.Hugh和Leifson（HL）培養(yǎng)基：細(xì)菌好氧性和厭氧性測定蛋白胨2.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀0.2g瓊脂3.0g蒸餾水1000.0mlpH7.4~7.8溴百里酚蘭（1.6％酒精溶液1.5ml）待培養(yǎng)基融化，并調(diào)pH后，裝于試管中，每支試管裝9ml

滅菌。培養(yǎng)基凝固后，用接種針蘸細(xì)菌懸浮液針刺接種，一直刺到管底。分別在培養(yǎng)2、4和7d后觀察統(tǒng)計。好氧性細(xì)菌，只在開管上部生長；兼性厭氧性細(xì)菌，則在開管上下部都能生長；厭氧性細(xì)菌，則只能在開管下部和閉管中生長。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第5頁（1）配方：NH4H2PO41.0ｇ，氯化鉀0.2ｇ，MgSO4.7H2O0.2ｇ，蒸餾水1000ｍL，溴百里酚蘭（1.6%酒精溶液）1.5mL;1%碳素化合物。3.Ayers培養(yǎng)基：碳素化合物產(chǎn)酸試驗(yàn)

單糖（葡萄糖、半乳糖）；雙糖（麥芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。有細(xì)菌不產(chǎn)酸和氣，有只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，少數(shù)植物病原細(xì)菌既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第6頁（3）分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中，每管10mL左右。假如測定氣體產(chǎn)生，加上杜氏發(fā)酵小玻管后滅菌。產(chǎn)酸時培養(yǎng)液變黃，產(chǎn)堿時變藍(lán)，產(chǎn)氣則小玻管內(nèi)培養(yǎng)液被部分排出，出現(xiàn)空隙。（2）配制過程：將NH4H2PO4、氯化鉀、MgSO4.7H2O溶于蒸餾水，調(diào)整pH7.0后加入溴百里酚蘭，最終加入碳素化合物（也可分別滅菌后加入）植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第7頁4.MR和VP試驗(yàn)：對葡萄糖分解能力

（1）配方：蛋白胨5ｇ，葡萄糖5ｇ，磷酸氫二鉀5ｇ，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鉀溶于蒸餾水，調(diào)整pH7.0-7.2，每管分裝5mL即可。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第8頁5.硝酸鹽還原（1）配方：硝酸鉀1.0ｇ，蛋白胨5.0ｇ，酵母膏3.0ｇ，蒸餾水1000ｍL，pH7.0-7.2（2）配制過程：將硝酸鉀、蛋白胨、酵母膏稱好后，溶解于蒸餾水后，調(diào)整pH。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第9頁6.半胱氨酸培養(yǎng)液：測定產(chǎn)H2S能力（1）配方：蛋白胨10ｇ，硫酸鈉0.1g，半胱氨酸0.1g，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將半胱氨酸、蛋白胨、硫酸鈉稱好后，溶解于水中，調(diào)整pH7.0-7.3即可。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第10頁7.吲哚試驗(yàn)（1）配方：蛋白胨20.0ｇ，磷酸氫二鈉2.0g，葡萄糖10.0g，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將蛋白胨等稱好后，溶解于蒸餾水，調(diào)整pH7.0-7.2即可。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第11頁8.明膠液化（1）配方：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0ｇ，明膠10-12%，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將牛肉浸膏、蛋白胨溶解于蒸餾水中，調(diào)整pH7.0-7.2后，將明膠溶解于此溶液中，即可分裝于試管中。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第12頁9.淀粉水解試驗(yàn)（1）配方：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨17.5ｇ，淀粉1.5g，瓊脂15-20g，蒸餾水1000ｍL。（2）配制過程：將牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉稱好后，溶解于蒸餾水中，加入稱好瓊脂，待融化后調(diào)整pH7.0-7.2。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第13頁10.石蕊牛乳反應(yīng)

（1）配方：脫脂牛乳1000ｍL，石蕊液（4%）15-20mL。（2）配制過程：提前配制石蕊液植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第14頁（二）培養(yǎng)基滅菌上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中要求條件及時進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃20~30min，以確保滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后馬上擺放成斜面，斜面長度普通以不超出試管長度1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第15頁明膠培養(yǎng)基滅菌12-15分鐘。石蕊牛乳培養(yǎng)基間歇滅菌3次，每次通蒸汽20-30分鐘。滅菌方法

滅菌是指殺死或毀滅一定環(huán)境中全部微生物，滅菌方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本試驗(yàn)主要介紹物理方法一個，即加熱滅菌。

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第16頁加熱滅菌包含濕熱和干熱滅菌兩種。經(jīng)過加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而到達(dá)殺菌目標(biāo)。高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是基于水沸點(diǎn)伴隨蒸汽壓力升高而升高原理設(shè)計。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第17頁當(dāng)蒸汽壓力到達(dá)1.05kg/cm2時，水蒸氣溫度升高到121℃，經(jīng)20～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上各種微生物和它們孢子或芽孢。普通培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。操作方法和注意事項(xiàng)以下:

加水

打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。注意水要加夠，預(yù)防滅菌過程中干鍋。

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第18頁裝料、加蓋

滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采取對角式均勻擰緊鍋蓋上螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。

排氣打開放氣閥。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當(dāng)有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈。

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第19頁升壓、保壓和降壓

當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。當(dāng)壓力上升至所需壓力時，控制電壓以維持恒溫，并開始計算滅菌時間，待時間到達(dá)要求（普通培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停頓加熱，待壓力降至靠近“0”時，打開放氣閥。注意不能過早過急地排氣，不然會因?yàn)槠績?nèi)壓力下降速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外。

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第20頁干熱滅菌法

經(jīng)過使用干熱空氣殺滅微生物方法叫干熱滅菌。普通是把待滅菌物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160～170℃維持1～2h。

干熱滅菌法慣用于空玻璃器皿、金屬器具滅菌。凡帶有膠皮物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第21頁1細(xì)菌（NA）和真菌(PDA)慣用培養(yǎng)基配方和制作過程有何異同點(diǎn)？2試述高壓蒸汽滅菌操作方法和注意事項(xiàng)。三、作業(yè)植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第22頁試驗(yàn)二植物病原細(xì)菌分離

和致病性測定植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第23頁二、試驗(yàn)內(nèi)容和操作方法

（1）首先要選擇經(jīng)典、新鮮病組織;（2）以滅菌剪將病斑剪下，略帶健康組織，大小約0.5～1公分左右，放在滅菌載玻片中央，加無菌水1d。加上滅菌蓋玻片，靜置約10min左右，觀察是否有云霧狀自破口處涌出（一）細(xì)菌溢現(xiàn)象觀察

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第24頁（1）斑點(diǎn)型：如棉花角斑病。A.剪取新鮮經(jīng)典病斑，約1cm見方。（二）植物病原細(xì)菌分離1.細(xì)菌懸浮液配制（不一樣癥狀類型分離材料選擇和表面消毒）植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第25頁B.表面消毒：將切取組織塊在70％乙醇中浸一下馬上取出，然后用表面消毒劑進(jìn)行表面消毒，能夠采取0.1％升汞，15″－2min或0.5％次亞氯酸鹽如漂白粉（1：9稀釋液）2minC.消毒后用滅菌水洗滌3次，將病組織放在另一個培養(yǎng)皿滅菌水中，剪破中心或以滅菌玻璃棒研碎病組織靜置20－30分鐘，等細(xì)菌游出。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第26頁（2）萎蔫型如茄青枯病將莖部剪成1－2寸長，表面用70％酒精輕拭，在火焰上表面消毒，以滅菌刀縱剖，選擇輕微變色病部，以滅菌刀切出薄片或以解剖針挑出病健交界處組織（能夠不再消毒），加滅菌水浸泡20-30分鐘。假如莖部較粗，也能夠在表面消毒后用解剖刀橫斷莖部，用夾子或手緊壓莖部橫斷面，擠出溢膿或汁液。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第27頁（3）腫瘤組織

軟瘤比較輕易分離；木質(zhì)瘤能夠磨碎后接種在向日葵、番茄等幼株上長出瘤后再分離。因?yàn)榧?xì)菌位于表皮細(xì)胞和木質(zhì)部之間，所以應(yīng)用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒，再在滅菌皿中實(shí)施解剖后以滅菌玻棒將其搗碎，靜置浸泡24h。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第28頁（4）腐爛組織較簡單，選擇近病部交界處以接種環(huán)挑取少許腐爛組織，稀釋。（5）種子帶菌分離

選擇病種子，以0.1％升汞液表面消毒1－2min，滅菌水洗滌，再將此種子在70％酒精中浸幾分鐘，洗滌2－3次，取出放在研缽中磨碎，離心取上清液。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第29頁2.分離方法A.倒平板：注意培養(yǎng)基溫度不能太高，不然冷凝水太多，細(xì)菌在水中游動而影響單個分散菌落形成。（1）平板劃線分離法：被普遍采取植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第30頁B.用接種環(huán)蘸取上述配制好菌懸液，在已凝固平板培養(yǎng)基表面劃線假如菌液濃度大，培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動角度減小，增加劃線次數(shù)劃4條線后，將接種環(huán)滅菌，培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動90°，從第2條線開始劃4－5條線植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第31頁（2）培養(yǎng)皿稀釋分離法0原液1取1環(huán)菌液0.5ｍL滅菌水2混勻后取1環(huán)3混勻后取1環(huán)4混勻后取1環(huán)5混勻后取1環(huán)植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第32頁3.培養(yǎng)

普通放置在28－30℃溫箱中倒置培養(yǎng)，時間2～3d。將冷卻至45℃左右培養(yǎng)基倒入裝有稀釋菌液培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使菌液和培養(yǎng)基混勻，待其凝固后培養(yǎng)。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第33頁4.細(xì)菌純化

挑取分離出經(jīng)典單菌落平板劃線培養(yǎng)（2皿），如此重復(fù)1－2次，最終，在均勻一致平板中，挑取經(jīng)典菌落移植在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長成后在4℃環(huán)境中保留菌種。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第34頁1.配制107-108CFU/mL細(xì)菌懸浮液，菌齡48小時左右；（二）致病性測定

2.指示植物選擇：普通用煙草，在假單胞和黃單胞菌屬上較適用。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第35頁3.接種方法：用注射器將細(xì)菌液從煙草下表皮注入葉肉細(xì)胞間。用滅菌水作陰性對照，同屬HR陽性菌株作陽性對照。4.培養(yǎng)條件：接種后植物應(yīng)保持在25℃，相對濕度較高（85%）條件下。5.結(jié)果觀察：在24～48h表現(xiàn)枯斑為陽性反應(yīng)，3d左右出現(xiàn)黃斑為陰性反應(yīng)。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第36頁三作業(yè)：1.簡述本試驗(yàn)中植物病原細(xì)菌分離步驟及其操作注意事項(xiàng)2.煙草過敏性反應(yīng)試驗(yàn)?zāi)軌虼_定細(xì)菌致病性嗎？為何？植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第37頁試驗(yàn)三植物病原細(xì)菌形態(tài)觀察

1.了解革蘭氏染色判定快速判定方法；2.掌握革蘭氏染色和鞭毛染色方法；3.掌握細(xì)菌培養(yǎng)性狀描述特征。

一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第38頁二、試驗(yàn)內(nèi)容和操作方法

1.結(jié)晶紫草酸銨染色（一）革蘭氏染色

（1）試劑A.結(jié)晶紫草酸銨染劑：溶液Ⅰ：結(jié)晶紫2.0g，酒精（95%）20mL混合溶液Ⅰ和Ⅱ，過濾，貯藏于試劑瓶中，24h后使用。溶液Ⅱ：草酸銨0.8g，蒸餾水80mL植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第39頁C.復(fù)染劑原液：番紅O2.5g，95%酒精100mL復(fù)染劑：原液10mL，蒸餾水90mLB.魯戈爾碘液：碘1.0g，碘化鉀2g蒸餾水300mL。將碘和碘化鉀在研缽中研和，慢慢加水并繼續(xù)研和直至碘和碘化鉀溶解，然后加水稀釋到300mL，盛入棕色試劑瓶，放暗處備用。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第40頁（2）染色程序A.配制細(xì)菌懸浮液：菌齡16hB.在潔凈載玻片上涂片、風(fēng)干，不要加熱，然后在火焰上經(jīng)過2次，固定玻片。C.結(jié)晶紫染色1分鐘，水洗數(shù)秒鐘，吸干。D.碘液處理1分鐘，水洗，吸干。E.用95%酒精褪色約30秒。水洗，吸干F.番紅O復(fù)染10秒，水洗，吸干G.加1滴香柏油，在油鏡下鏡檢，紅色為革蘭氏陰性菌，紫色為革蘭氏陽性菌。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第41頁2.氫氧化鉀溶解試驗(yàn)（1）試劑：3％氫氧化鉀（2）方法：取1－2滴3％氫氧化鉀溶液置于潔凈玻片上，用牙簽取新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物與氫氧化鉀混合，充分?jǐn)嚢?0－20秒，假如液滴變粘稠并可拉出絲狀物體，表示測試菌為革蘭氏陰性菌，反之則為革蘭氏陽性菌。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第42頁1.試劑（二）鞭毛染色（西薩－基爾法）

（1）媒染劑：單寧酸10g，ALCL3.6H2O18g，ZnCL210g，堿性品紅1.5g，60%酒精40mL在研缽中加入酒精和上述各種成份，充分研磨后，再加入其余酒精。使用前用蒸餾水稀釋2倍，染色時過濾，濾液直接滴在涂片上。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第43頁溶液Ⅰ：堿性品紅0.3g，酒精（95%）10mL溶液Ⅰ和Ⅱ分別配制后混合。溶液Ⅱ：苯酚（結(jié)晶）5g，蒸餾水95mL（2）染液：2.染色步驟（1）載玻片準(zhǔn)備：選取新或沒有傷痕，先用洗潔精浸泡洗滌，用清水洗凈后，再放入酸酒精（硫酸與酒精等量混合）中浸泡24-48h，取出后用清水洗凈，再用蒸餾水洗，瀝干水后，浸泡在95%酒精中備用。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第44頁（2）配制細(xì)菌懸浮液，菌齡很主要，普通適溫培養(yǎng)16-24h。用吸管沿試管壁緩緩加入無菌水5mL，，靜置30分鐘左右，配成菌懸液。（3）涂片：取浸在酒精中載玻片，在火焰上燒去酒精，平放，用吸管吸收細(xì)菌懸浮液（以上層為好）在載玻片一端滴一滴，然后將載玻片稍稍傾斜，使菌懸液從一端緩緩流向另一端，使涂片自然風(fēng)干。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第45頁（4）媒染劑過濾后，直接將濾液滴在涂片上，處理5-7分鐘（5）用水輕輕洗去染媒劑，甩去載玻片上剩下水，在空氣中干燥后，再加苯酚品紅染劑染色5分鐘。（6）水洗，在空氣中干燥后，加1滴香柏油，在油鏡下觀察鞭毛數(shù)量和著生位置。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第46頁1.革蘭氏染色反應(yīng)和鞭毛染色在植物病原細(xì)菌判定中有何作用？為何？2.細(xì)菌鞭毛染色對菌齡要求比較嚴(yán)格，在操作過程中也要注意動作輕柔，為何？3觀察和統(tǒng)計NA平板上細(xì)菌菌落性狀、菌體形狀、運(yùn)動性和革蘭氏染色結(jié)果。三作業(yè)植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第47頁試驗(yàn)四

植物病原細(xì)菌生理生化測定

1.掌握無菌操作技術(shù)；2.了解各種生理生化性狀測定慣用試劑配制方法；3.掌握各種生理生化性狀觀察方法。一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第48頁二、試驗(yàn)內(nèi)容和方法

1.產(chǎn)酸和產(chǎn)氣試驗(yàn)（一）碳素化合物利用1）接菌培養(yǎng)：普通每5mL培養(yǎng)液接種0.1mL108CFU/ml菌懸液，適溫下培養(yǎng)3-4周。2）結(jié)果觀察：產(chǎn)酸：培養(yǎng)液變?yōu)辄S色產(chǎn)堿：培養(yǎng)液變?yōu)樗{(lán)色CK：培養(yǎng)液為草綠色變色產(chǎn)氣：杜氏發(fā)酵小玻管出現(xiàn)空隙CK：杜氏發(fā)酵小玻管不出現(xiàn)空隙產(chǎn)氣植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第49頁（1）配方：NH4H2PO41.0ｇ，氯化鉀0.2ｇ，MgSO4.7H2O0.2ｇ，蒸餾水1000ｍL，溴百里酚蘭（1.6%酒精溶液）1.5mL;1%碳素化合物。Ayers培養(yǎng)基：碳素化合物產(chǎn)酸試驗(yàn)

單糖（葡萄糖、半乳糖）；雙糖（麥芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。

有細(xì)菌不產(chǎn)酸和氣，有只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，少數(shù)植物病原細(xì)菌既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第50頁（3）分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中，每管10mL左右。測定氣體產(chǎn)生時，加上杜氏發(fā)酵小玻管后滅菌。（2）配制過程：將NH4H2PO4、氯化鉀、MgSO4.7H2O溶于蒸餾水，調(diào)整pH7.0后加入溴百里酚蘭，最終加入碳素化合物（也可分別滅菌后加入）植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第51頁

3）MR試驗(yàn)結(jié)果觀察：取上述培養(yǎng)液5ml，加甲基紅試劑2~3滴，呈顯著紅色為陽性，呈黃色為陰性。2.甲基紅(MR)和VP(產(chǎn)3-羥基丁酮)試驗(yàn)1）接菌培養(yǎng)：普通每5mL培養(yǎng)液接種0.1mL108CFU菌懸液，適溫下培養(yǎng)1周。2）甲基紅試劑配制：甲基紅0.1g溶解于300ml95%酒精中，然后用蒸餾水稀釋至500ml。

4）VP試驗(yàn)結(jié)果觀察：每毫升加0.1mL40%KOH溶液,置48-50℃水浴處理2h，充分搖動后觀察結(jié)果。在4h內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽性反應(yīng)。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第52頁測定亞硝酸，每試管加試劑A和試劑B各1ml如呈紅色，表示有亞硝酸根。1）接菌：在培養(yǎng)液中接菌后培養(yǎng)1周（二）氮素化合物分解2）Griess-Llosvary試劑測定法試劑A：對氨基苯磺酸8.0g，5mol/L醋酸（286.0ml冰醋酸加715.0ml水）1000ml試劑B：二甲基-α-萘胺6ml，5mol/L醋酸1000ml1.硝酸鹽還原植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第53頁1）醋酸鉛濾紙條制備：將濾紙剪成5mm×50mm小條浸在5%醋酸鉛溶液中，空氣中干燥后，在120℃烘箱中滅菌1h。2）接菌：將細(xì)菌接種于試管中培養(yǎng)液中后，用上述制備濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間，使紙條懸在培養(yǎng)液面上，但不要碰到培養(yǎng)液，25℃培養(yǎng)2周。3）結(jié)果觀察：紙條變黑表示有硫化氫產(chǎn)生，為陽性反應(yīng)。2.硫化氫產(chǎn)生植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第54頁1）草酸濾紙條制備：將濾紙剪成5mm×50mm小條浸在飽和草酸溶液中，空氣中干燥后，在120℃烘箱中滅菌1h。2）接菌：將細(xì)菌接種于試管中培養(yǎng)液中后，用上述制備濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間，使紙條懸在培養(yǎng)液面上，但不要碰到培養(yǎng)液，適溫培養(yǎng)1周。3）結(jié)果觀察：紙條變淡紅色表示有吲哚產(chǎn)生，為陽性反應(yīng)。3.吲哚產(chǎn)生植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第55頁1）接菌：采取穿刺法接菌后，放在適溫中培養(yǎng)1-3周。以不接菌試管為對照。（三）大分子化合物利用2）結(jié)果觀察：將經(jīng)過培養(yǎng)接菌試管取出后，放在4℃冰箱中，看其是否凝固，如不凝固，則說明明膠分解而造成液化，為陽性反應(yīng)。1.明膠液化植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第56頁A.酸產(chǎn)生：石蕊牛乳變成粉紅色，表示從乳糖產(chǎn)酸1）接菌：將培養(yǎng)基接種細(xì)菌于28℃培養(yǎng)1-3周，以不接種石蕊牛乳做對照。2）結(jié)果觀察：2.石蕊牛乳反應(yīng)B.凝固：產(chǎn)酸到達(dá)pH4.7發(fā)生凝塊，如產(chǎn)氣凝塊斷裂；凝乳酶作用而凝固，凝塊收縮與乳清分離。C.胨化：牛乳變清，往往從表層開始D.堿產(chǎn)生：石蕊牛乳變藍(lán)色，胨化時常呈堿性E.石蕊還原：石蕊變?yōu)闊o色植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第57頁

在平板上加碘液后，培養(yǎng)基為深蘭色，菌落周圍有沒有色透明圈者為陽性。1）接菌：將細(xì)菌接種于淀粉瓊脂平板上，適溫下培養(yǎng)24-48小時。2）結(jié)果觀察：3.淀粉水解試驗(yàn)植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第58頁四、細(xì)菌好氧性和厭氧性測定蛋白胨2.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀0.2g瓊脂3.0g蒸餾水1000.0mlpH7.4~7.8溴百里酚蘭（1.6％酒精溶液1.5ml）待培養(yǎng)基融化，并調(diào)pH后，裝于試管中，每支試管裝9ml

滅菌。培養(yǎng)基凝固后，用接種針蘸細(xì)菌懸浮液針刺接種，一直刺到管底。分別在培養(yǎng)2、4和7d后觀察統(tǒng)計。

好氧性細(xì)菌，只在開管上部生長；兼性厭氧性細(xì)菌，則在開管上下部都能生長；厭氧性細(xì)菌，則只能在開管下部和閉管中生長。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第59頁1）試劑：1%二甲基對苯二胺鹽酸鹽或1%四甲基對苯二胺鹽酸鹽。（五）其它生理生化試驗(yàn)2）測定方法：1.氧化酶試驗(yàn)A.Kovacs：在培養(yǎng)皿內(nèi)放一張濾紙，濾紙上加3-4滴試劑使其濕潤，用牙簽挑取24h菌苔涂在濾紙上，60秒內(nèi)變成紫色為陽性反應(yīng)，60秒后或不便色為陰性。B.濾紙條法：用濾紙條蘸少許菌苔，加1d試劑，馬上呈粉紅色為陽性植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第60頁1）試劑：3%過氧化氫2）測定方法：挑取固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48h菌苔，置于潔凈玻片上，滴加過氧化氫。2.過氧化氫酶（接觸酶）試驗(yàn)3）結(jié)果觀察：在半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生為陽性，不產(chǎn)生氣泡為陰性。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第61頁三作業(yè)：1若有吲哚和硫化氫產(chǎn)生，其試驗(yàn)試管口上濾紙條會發(fā)生什么樣顏色改變，為何？2在石蕊牛乳不能和其它細(xì)菌培養(yǎng)基一起滅菌，為何？反應(yīng)中會出現(xiàn)各種不一樣反應(yīng)，試分析其發(fā)生原因？3觀察和統(tǒng)計細(xì)菌氧化發(fā)酵試驗(yàn)、MR試驗(yàn)以及接觸酶試驗(yàn)結(jié)果。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第62頁試驗(yàn)五

植物病原細(xì)菌PCR分子判定

1了解PCR反應(yīng)原理；掌握PCR反應(yīng)操作方法。一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第63頁二、PCR擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第64頁1、PCR技術(shù)基本原理類似于DNA天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與目標(biāo)序列兩端互補(bǔ)寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個反應(yīng)步驟組成：①模板DNA變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成雙鏈DNA解離，使之成為單鏈（方便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備）；②模板DNA與引物退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)序列配對結(jié)合；植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第65頁③引物延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新與模板DNA鏈互補(bǔ)半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可取得更多“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目標(biāo)基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第66頁2TheprocedureofPCR5’5’3’3’d.NTPsTaqPrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’componentdenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’(94℃)

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第67頁extension5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’repeatedanneal(72℃)

(50℃)

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第68頁5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’2cycles4copies3cycles8copies5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第69頁10×反應(yīng)緩沖液（含Mg2＋）5.0ldNTP混合物，10mmol/L1.0l上游引物，20mol/L1.0l下游引物，20mol/L1.0l模板DNA1.0lTaq

plusDNA聚合酶，5U/l0.5l加雙蒸水至終體積為50l

3反應(yīng)體系取一0.5mlPCR薄壁管，依次加入以下試劑：

植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第70頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第71頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第72頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第73頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第74頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第75頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第76頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第77頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第78頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第79頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第80頁植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第81頁

M1234

3kb2kb0.8%agrosegelelectrophoresisoffulllengthPCRproductfromY160M:DNAmarker;1:Y160;2:positivecontrol;34:CK-2.7kb植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第82頁引物量：每條引物濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要結(jié)果為好，引物濃度偏高會引發(fā)錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體機(jī)會。

酶及其濃度：當(dāng)前有兩種TaqDNA聚合酶供給，一個是從棲熱水生桿菌中提純天然酶，另一個為大腸菌合成基因工程酶。催化一經(jīng)典PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引發(fā)非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量降低。4PCR反應(yīng)操作注意事項(xiàng)：植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第83頁dNTP質(zhì)量與濃度

dNTP質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有親密關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保留不妥易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris。HCL緩沖液將其PH調(diào)整到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保留。屢次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一個濃度不一樣于其它幾個時(偏高或偏低)，就會引發(fā)錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離Mg2+濃度降低。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第84頁模板(靶基因)核酸模板核酸量與純化程度，是PCR成敗是否關(guān)鍵步驟之一。Mg2+濃度

Mg2+對PCR擴(kuò)增特異性和產(chǎn)量有顯著影響，在普通PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶活性，使反應(yīng)產(chǎn)物降低。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第85頁

PCR反應(yīng)條件選擇

PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時間設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點(diǎn)。①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是造成PCR失敗最主要原因。普通情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會造成PCR失敗。植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)第86頁②退火(復(fù)性)溫度與時間：主要原因。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。因?yàn)槟０錎NA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間碰撞。退火溫度與時間，取決于引物長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列長度。③延伸溫度與時間：PCR反應(yīng)延伸溫度普通選擇在