代謝組學的研究方法和研究流程

代謝組學研究方法和究流程分子微生物學112300003

林兵隨著人類基因組計劃等重大科學項目的實,基組學、轉(zhuǎn)錄組學及蛋白質(zhì)組學在研究人類生命科學的過程中發(fā)揮了重要的作,與此同時,代謝組（metabolomics20世紀90年中期產(chǎn)生并迅速地發(fā)展起,基因組學錄組學白組學共同組成系統(tǒng)生物學?；蚪M學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等各種組在命科學領(lǐng)域中發(fā)揮了重要的作用,它們分別從調(diào)控生命程的不同層面進行研究,使人們能夠從分子水平研究生命現(xiàn)象探生命的本質(zhì)逐步統(tǒng)地認識生命發(fā)展的規(guī)律組手段加上生物信息學,成為系統(tǒng)生物學的重要組成部分。代謝組學的出現(xiàn)和發(fā)展是必要,同時也是必須的基因組學和蛋白質(zhì)組學在生命科學研究中的缺點和不足,代謝組學正好可以進行彌補組學研究的是生命個體對外源性物質(zhì)藥或毒物的激變化或遺傳修飾所做出的所有代謝應,并檢測這種應答的全貌及其動態(tài)變化組方法為生命科學的發(fā)展提供了有力的現(xiàn)代化實驗技術(shù)手,同時也為新藥臨床前安全性評價與實踐提供了新的技術(shù)支持與保障。1

代謝組學概念及發(fā)展代謝組學最初是由英國帝國理工大JeremyN教提出,他為代謝組學是將人體作為一個完整的系統(tǒng),機體的生理病理過程作為一個動態(tài)的系統(tǒng)來研究,并且將代謝組學定義為生物體對病理生理或基因修飾等刺激產(chǎn)生的代謝物質(zhì)動態(tài)應答的定量測定。2000年德國馬普所的iehn等出了代謝組學的概,但是Nicholson提出的代謝組學不同,他將代謝組學定位為一靜態(tài)的過,也可以稱為代謝物組,即限定條件下的特定生物樣品中所有代謝產(chǎn)物的定性定量分析。同F(xiàn)還將代謝組學按照研究目的的不同分為類代謝物靶標分,代謝輪(譜分析代謝學代指紋分析?，F(xiàn)在代謝組學在國內(nèi)外的研究都在迅速地發(fā)展,科家們對代謝組學這一概念也進行了完善作出了科學的定義:代組學是對一生物系統(tǒng)的細胞在給定時間和條件下所有小分子代謝物質(zhì)的定性定量分析,從定量描生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其對內(nèi)因和外因變化應答規(guī)律的科學。與基因組學轉(zhuǎn)錄組學蛋質(zhì)學相,代謝組學的主要研究思想是全局觀點與傳統(tǒng)的代謝研究相,代謝學融合了物理學學分析化學等多學科知,利現(xiàn)代化的先進的儀器聯(lián)用分析技術(shù)對機體在特定的條件下整個代謝產(chǎn)物譜的變化進行檢測,并通過特殊的多元統(tǒng)計分析方法研究整體的生物學功能狀況代謝組學的研究對象是人體或動物體的所有代謝產(chǎn),而些謝產(chǎn)物的產(chǎn)生都是由機體的內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)生反應生成,因此,代謝物的變化也就揭示了內(nèi)源性物質(zhì)或是基因水平的變化,這研究對象從微觀的基因變?yōu)楹暧^的代謝物,宏代謝表型的研究使得科學研究的對象范圍縮小而且更加直觀易理,這也是代謝組研究的優(yōu)勢之一。代謝組學的優(yōu)勢主要包括:對體損傷小所得到的信息量大,相于基因組學和蛋白質(zhì)組學檢測更加容易代組學發(fā)展的時間較,且由于代謝組學的分析對象是無偏向性的樣品中所有的小分子物質(zhì),因此對分析手段的要求比較高,在數(shù)據(jù)處理和模式識別上也不成,存在些不足之處生物體代謝物組變化,穩(wěn)性較難控制當機體的生理和藥理效應超敏時,受物即使沒有相關(guān)毒性,也能引起明顯的代謝變化,導致假陽性結(jié)果。

代謝組學應用領(lǐng)域大致可以分為以7方面(植功能基因組研究主要擬南芥為研究模,也包括一些轉(zhuǎn)基因作物的研究。(2)疾病斷根據(jù)代謝物特圖譜診斷腫瘤、糖尿病等疾病。(制業(yè)即新藥臨床前安全性評主要通過高通量比對預測藥物的毒性和有效,通過全面分析來發(fā)現(xiàn)新的生物指示劑。(微物領(lǐng)域。(毒學研究包利用代謝組學平臺研究環(huán)境毒理及藥物毒理。(食及營養(yǎng)學,即究食品進入體內(nèi)的營養(yǎng)成分及其與體內(nèi)代謝物的相互作用。(7在中藥現(xiàn)代化及其機理上研究。2

代謝組學研究方法代謝組學的研究過程一般包括代謝組數(shù)據(jù)的采集據(jù)處理多量數(shù)據(jù)分析標記物識別和途徑分析等步驟,集生物樣(如尿液織胞和培養(yǎng)液)對其進行生物反應滅活預處理再運用先進的分析手段如核磁共振譜或色譜等檢測樣品中所有代謝物的種類、含量、狀,從而得到原始的大量的反映生物樣品信息的實驗數(shù),而后使用多變量數(shù)據(jù)分析方法對獲得的多維復雜數(shù)據(jù)進行降維和信息挖掘,從些復雜大量的信息中篩選出最主要的最能反映代謝物變化的主要成分,再過模式識別將其與標準的代謝物譜進行比對,或根據(jù)代謝物譜在時程上的變化來尋找生物標記物,研相關(guān)代謝物變化涉及的代謝途徑和變化規(guī),闡述生物體對相應刺激的響應機制由不同分析手段各有其特點在同應用領(lǐng)域使用的分析方法也是有所不同的。核核磁共(nuclearmagneticresonance,NMR機結(jié)構(gòu)測定的四大譜學之,作一種分析物質(zhì)的手段由其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣,并具有迅速確辨率高等優(yōu)點而得以迅速發(fā)展和廣泛應用代謝組學發(fā)展的早期NMR技術(shù)被廣泛應用在毒性代謝組學的研究中NMR的優(yōu)在能夠?qū)悠穼崿F(xiàn)無創(chuàng)性偏向的檢,具有好的客觀性和重現(xiàn)性樣不需要煩瑣處,具有較高的通量和較低的單位樣品檢測成本。此,-NMR對氫化合物均有響應,能成樣品中大多數(shù)化合物的檢測,滿代謝組學中的對盡可能多的化合物進行檢測的目標。NMR雖然可對復雜樣品如尿液、液等進行非破壞性分,與質(zhì)譜法相比它的點是檢測靈敏度相對較低采現(xiàn)有成熟的超低溫探頭技,其測靈敏度在納克級水平)態(tài)范圍有限很同時測定生物體中共存的濃度相差較大的代謝產(chǎn);同時購置器所需的投資也較大。為了改進檢靈敏度較低的缺,可采高分辨核磁共振技術(shù)或使用多維核磁共振技術(shù)和液相色-核共振聯(lián)(魔旋轉(zhuǎn)magicanglespinning,MAS)核磁共振技術(shù)是0世紀0年初發(fā)展起來的一種新型的核磁共振技,在代謝組學的研究中魔旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜技術(shù)已被成功地應用到研究生物組織,因為生物組織在核磁共振實驗中會由于磁化率不均勻子動受限等因素而引起譜線增寬些素利用固體核磁共振中的AS方法可以消除。如大鼠肝臟、哺乳動物腎臟以及大鼠睪丸組織等。質(zhì)GC是代謝組學常用的方法先主要應用于植物組學研究著}工程和分析技術(shù)的快速發(fā)展其微生物代謝學的應用越來越引起關(guān)注—MS的分離效率高易于使用且較為經(jīng)濟是用標準電子轟(EI)式后用范圍和重復性都進一步提高。但是GC—MS需要對揮發(fā)性較低的謝物進行衍生化預處理一步驟會耗費額外的時間

至引起樣品的變化限—MS無法分析熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)和分子量較大的代謝產(chǎn)物。近來，多維分離技術(shù)如二級氣相色譜飛行時間質(zhì)(GC—GC—TOF—MS)，檢測范圍更廣，但由于實際應用困難和花費較高等問題使其并未普遍使用。篇關(guān)于微生物代謝組學的文獻報道了應用種同GC—MS術(shù)，分析腸系膜明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖過程中脂肪酸、氨基酸和糖類以監(jiān)測微生物污染。LC—MS無需進行樣品的衍生化處，檢測范圍廣，可以作的充，非常適合于生物樣本中低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的代謝物LC與電噴霧(質(zhì)連用可以分析大部分極性代謝物，此外，離子配(IP)LC—MS、親水相互作用液相色譜HILIC—MS、反相C—MSI等可以進行不同種類謝物的及時定量分析Brerau等利用HILIC—MS獲得了大腸桿菌和釀酒酵母饑餓脅迫應答的代謝指紋圖譜，測68胞內(nèi)代謝物的濃度發(fā)生了改變。LC—ESI—MS—MS分析被用于測量葡萄糖沖擊下的釀酒酵母的糖分解和三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物。CE—MS分離樣品效率比普通的色質(zhì)譜聯(lián)用要高得多需極少的進液量(nL)而且其測試時問短試成本低在生物代謝組領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用Ohashi等221通過CE—TOF—MS大腸桿菌的陰離子和陽離子代謝產(chǎn)物進行了全面分析和定量，鑒別出主要代謝物中的75個親水中問體其中198個代謝物進行了定量等運用反相電滲流EOF)CE高效分離了輔A、有機酸、核苷酸和磷酸糖Soga等用E—MS系統(tǒng)研究了枯草桿菌在芽孢發(fā)生過程中的代謝譜的變化過程別1692種謝物鑒別出其中的50種。3

代謝組學研究流程代謝組學研究的技術(shù)平臺一般流程包括樣品制備謝物的檢測和分析鑒定數(shù)分析與模型建立。下圖為代謝組學的流程圖自動進樣數(shù)據(jù)分析與樣品的提取

樣品預處理

化合物的分離

檢測及鑒定

可視化，建模與仿真1

微生物代謝物樣品的制備一般分為微生物培養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的提取研對象、目的和采用的分析技術(shù)不同需的樣品提取和預處理方法各異存一種普適性的標準化方法。在樣品淬滅和代謝物的提取過程中，應遵循的原則是：(1)滅工藝最好可以立即凍結(jié)細胞代謝(2)在淬滅過程中要細胞膜無明顯損傷免胞內(nèi)代謝物外泄提取過程中應該盡可能多的提取胞內(nèi)代物謝產(chǎn)物不應該遇到任何物理或化學修飾得的樣品基質(zhì)應與所選擇的分析方法相容甲醇和液氮是最常用的淬滅方法在取方面由于特定的提取條件往往僅適合某些類化合物，目前尚無一種能夠適合所有代謝產(chǎn)物的提取方法。應該根據(jù)不同的化合物選擇不同的提取方法，并對提取條件進行優(yōu)化。

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生命科學領(lǐng)域的巨大進步與先進分析技術(shù)密不可分，進行代謝組學研究首要解決的是分析方法上的理論和技術(shù)問題的酶法定量胞內(nèi)外代謝物只能分析一個樣品中的一個或幾個代謝物，且需要的樣品體積大胞內(nèi)代謝物’濃度一般很低，在淬滅或提取過程中又會被稀釋所的樣品體積一般少些都將嚴重影響酶法定量的可靠性謝學定量胞內(nèi)外代謝物的分析方法要求具有高靈敏度通量和無偏向性的特點分復雜的胞內(nèi)外產(chǎn)物時所用的分析方法是分重要的般根據(jù)樣品的特性和試驗目的選擇最合適的分析方法。目前最常用的分離分析手段是氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用GC—MS)、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（—MS)、毛細管電泳質(zhì)譜聯(lián)(CE—MS)及核磁共振NMR)。3

在代謝組學研究中，大多數(shù)是從檢測到的代謝產(chǎn)物信息中進行兩(如基因突變前后的響應)或多類如同表型問代謝產(chǎn)物判分類以及生物標記物的發(fā)現(xiàn)于物樣品的組成復雜在到分析對象的原譜圖后先需要對數(shù)據(jù)進行預處(歸一化和濾噪除干擾因素留用信息據(jù)解析可分為如下3個本步驟提出色譜分（如GC—M