單孢分離流程

PDA培養(yǎng)基制作（參考《《植病研究方法》p46-47》）取250ml三角瓶4個(gè)，分別量取200毫升蒸餾水倒入三角瓶；稱(chēng)PDA粉7.8克g倒入已加入200毫升蒸餾水的三角瓶中，搖勻，加鋁箔，3次重復(fù)；再稱(chēng)取8克g倒入已加入200毫m升蒸餾水的三角瓶中，搖勻，加鋁箔，標(biāo)記。放入高壓滅菌鍋中待滅菌。20毫升25%乳酸的配置用5ml的加樣槍取15毫升蒸餾水（3槍?zhuān)┘尤敫稍锏?0ml試劑瓶中；取5毫升乳酸（1槍?zhuān)┚徛⑷?0毫升m試劑瓶的蒸餾水中，吸吐幾次混勻，加蓋，加鋁箔，標(biāo)記。（注I：先取水再注乳酸，節(jié)省槍頭一個(gè)）放入高壓滅菌鍋中待滅菌。濕熱滅菌溫度：121°C保持25分鐘min.200微升仲槍頭和1000微升仲槍頭，裝盒，盒蓋，包報(bào)紙，有橡膠圈勒緊；加鋁箔蓋的配置好的PDA培養(yǎng)基4瓶；加鋁箔蓋的200毫升ml蒸餾水3瓶；加鋁箔蓋的25%乳酸20毫ml升30毫升ml試劑瓶；需要滅菌的其他材料。加入蒸餾水，旋緊鍋蓋，關(guān)閉放汽閥和安全閥，升壓到紅線(xiàn)區(qū)，打開(kāi)安全閥，放凈冷氣，重新升壓至額定溫度，保持25分鐘，停止加熱；待氣壓表回零；先開(kāi)安全閥，再開(kāi)放氣閥，最后選開(kāi)鍋蓋，取出滅過(guò)菌的培養(yǎng)基等放置超凈臺(tái)中冷卻備用。超凈工作臺(tái)4.1酒精燈2個(gè)，培養(yǎng)岫90毫米30個(gè)，①60毫米26個(gè)，手術(shù)刀、剪刀、鑷子各1把、接種環(huán)1個(gè)，記號(hào)筆，95%酒精瓶1個(gè)。滅菌時(shí)間：使用前，啟動(dòng)紫外燈空氣用品滅菌22-50分鐘（期間人員遠(yuǎn)離）。用無(wú)水乙醇配成75%酒精（3:1=3份酒精加1份蒸餾水水）用于表面消毒。5超靜工作臺(tái)內(nèi)操作待滅菌的PDA培養(yǎng)基冷卻至56度。C,加入25%乳酸200微升，搖勻后馬上倒入培養(yǎng)皿中（待冷卻后制成PDA平板）。注：乳酸起抑制細(xì)菌生長(zhǎng)作用。直徑④90毫米mm培養(yǎng)皿20個(gè)，在每個(gè)培養(yǎng)皿中PDA培養(yǎng)基約10毫升（用于初步培養(yǎng)和劃線(xiàn)）直徑④60毫米m培養(yǎng)皿26個(gè)，在每個(gè)培養(yǎng)皿中約加6毫升PDA培養(yǎng)基（用于單細(xì)胞培養(yǎng)）。劃線(xiàn)接種環(huán)表面滅菌：將接種環(huán)蘸上75%酒精過(guò)火（酒精燈外焰），重復(fù)3次，待冷卻到室溫，蘸取霉層，在平板上劃線(xiàn),（目的是將分生抱子有足夠間距地分開(kāi)）。劃線(xiàn)在超凈工作臺(tái)中，酒精燈的下風(fēng)向安全區(qū)內(nèi)進(jìn)行；左手拿PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿打開(kāi)蓋，右手拿接種環(huán)。過(guò)火表面滅菌后，待冷卻到室溫，也可以先接觸PDA培養(yǎng)基強(qiáng)制降溫并使接種環(huán)表面濕潤(rùn)；蘸取僵果表面褐腐菌，在PDA培養(yǎng)基表面上輕輕劃同方向的3條線(xiàn)為一組，每劃完一組，接種環(huán)酒精燈過(guò)火滅菌一次；重復(fù)劃線(xiàn)3組，每組第一條線(xiàn)與上一組最后一條線(xiàn)相搭接；第四組劃Z型。或重復(fù)4組，第五組劃M(mǎn)型。3注：每次劃線(xiàn)起點(diǎn)要和上一次末端連線(xiàn)劃。（《植病研究方法》p180圖12-1）6培養(yǎng)室溫下過(guò)夜（23-24C）默認(rèn)值12-20小時(shí)。（或放入設(shè)置好的培養(yǎng)箱中23-25C）；7挑單抱解剖刀蘸75%酒精，酒精燈上過(guò)火表面滅菌，重復(fù)三次，冷卻到室溫；在40-45倍X解剖鏡下，從PDA培養(yǎng)基中用解剖刀刀尖把單菌絲前端或已萌發(fā)的單個(gè)分生抱子切成小塊，用刀尖挑出（單抱）轉(zhuǎn)