我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析專家講座

我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析試講：張昕亮我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第1頁【摘要】目標(biāo)

測定我國人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白G基因序列，并對其進行生物信息學(xué)分析。方法RT-PCR擴增3株病毒糖蛋白G基因，分別克隆至pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，進行測序。應(yīng)用DNAstarMegAlign軟件分析3株病毒糖蛋白同源性，AntheProt5.0及DNAstarProtean軟件分析3株病毒糖蛋白結(jié)構(gòu)及潛在B細胞抗原表位差異。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第2頁狂犬病是由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV）引發(fā)人獸共患疾病，一旦發(fā)病，幾乎100％死亡，疫苗接種是預(yù)防該病主要辦法。當(dāng)前，我國人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒株主要有aG、CTN-1V和PV2061株，其中aG株和CTN-1V株為我國自行分離并傳代適應(yīng)，PV2061株起源于法國巴斯德株。上述病毒株生產(chǎn)人用狂犬病疫苗經(jīng)臨床應(yīng)用顯示，含有良好保護效果。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第3頁

我國人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用原始種子4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒糖蛋白（Glycoprotein，G）全基因序列進行測定，分析3株病毒糖蛋白氨基酸序列同源性我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第4頁1.材料與方法

1.1菌毒株

狂犬病病毒原始種子批4aGV、CTN-1V和PV2061均由中國食品藥品檢定研究院病毒一室保留；感受態(tài)大腸桿菌DH5α。

1.2主要試劑

QIAampViralRNAMiniKit

ReverseTranscriptionSystem

TaKaRaLATaq誖DRR002A

EZNA誖GelExtractionKit

pGEM-Tvectorsystem我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第5頁1.3引物設(shè)計及合成

依據(jù)GenBank中登錄aG、CTN、PV株病毒M、L區(qū)基因序列，應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計位于M區(qū)及L區(qū)上下游引物，見表1。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第6頁我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第7頁1.4病毒G區(qū)基因擴增

用QIAampViralRNAMiniKit提取病毒RNA，

ReverseTranscriptionSystem提供隨機引物逆轉(zhuǎn)錄

合成cDNA第一鏈，再以其為模板，PCR擴增目標(biāo)基因。

反應(yīng)體系為：cDNA2μl，10×buffer5μl，2.5mmol／L

dNTP4μl，上下游引物各2μl（10pmol／L），LATaq

1μl，去離子水補足體積至50μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，53℃30s，72℃2min，共30個循環(huán)；72℃再延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖

凝膠電泳判定，EZNA誖GelExtractionKit純化回收。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第8頁1.5克隆測序

將PCR純化產(chǎn)物與pGEM-Tvector連接，轉(zhuǎn)化

感受態(tài)大腸桿菌DH5α，藍白斑篩選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR判定后，送北京三博遠志生物技術(shù)有限企業(yè)測序，每個片段最少送6個陽性克隆。1.6病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DNAstar中MegAlign軟件分析3株病

毒糖蛋白基因序列及氨基酸序列同源性；應(yīng)用

AntheProt5.0及DNAstar中Protean軟件分析3株病毒糖蛋白結(jié)構(gòu)及潛在B細胞抗原表位差

異。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第9頁2.結(jié)果2.1病毒G區(qū)基因擴增產(chǎn)物判定應(yīng)用配對引物分別擴增4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒G區(qū)基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見約2300bp特異條帶，大小與預(yù)期相符；應(yīng)用3對引物分別擴增4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒G區(qū)基因，僅配對引物擴增出對應(yīng)條帶。盡管應(yīng)用aG-MGL-F／R引物對PV2061株病毒G區(qū)基因進行擴增時有條帶出現(xiàn)，但該條帶大小及擴增產(chǎn)物濃度均與目標(biāo)片段顯著不符，為非特異性擴增。所以3對引物均含有特異性，與其它毒株無特異性配對。見圖1。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第10頁圖1

4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒糖蛋白基因擴增產(chǎn)

物電泳圖我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第11頁2.2

4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒糖蛋白基因序列同源性分析4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白測序結(jié)果已提交到GenBank，登錄號分別為JN234411、JN234418和JN234424。測序結(jié)果表明，3株病毒均為基因Ⅰ型狂犬病病毒；其基因組M-G區(qū)間序列長度均為5bp，CTN-1V株M-G區(qū)間序列為CTTTT，4aGV與PV2061株為CTATT；3株病毒G區(qū)全序列均含有5′端AACA和3′端polyA尾結(jié)構(gòu)，其中CTN-1V、4aGV株G區(qū)基因長度為2067bp，PV2061株為1675bp，基因同源性為76.0％～88.4％；3株病毒G區(qū)ORF基因均為1575bp，基因同源性為84.4％～91.5％；CTN-1V、4aGV株G-L區(qū)間序列長度為24bp，PV2061株為423bp。對推導(dǎo)3株病毒糖蛋白氨基酸序列同源性分析表明，3株病毒糖蛋白均由524個氨基酸組成，同源性為90.5％～92.2％，見表2。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第12頁我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第13頁2.3糖蛋白信號肽分析

對4aGV、CTN-1V和PV2061株糖蛋白信號肽分析發(fā)覺，三者前19位氨基酸均存在潛在信號肽結(jié)構(gòu)，其中第19位氨基酸為三者潛在信號肽斷裂位點，4aGV株病毒糖蛋白第17位氨基酸為潛在信號肽斷裂位點，見圖2。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第14頁我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第15頁2.4糖蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析對4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸結(jié)構(gòu)進行跨膜區(qū)域分析，結(jié)果顯示，3株病毒糖蛋白分別在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潛在可折疊螺旋疏水性區(qū)域，可判斷為顯著跨膜區(qū)域，見圖3。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第16頁圖3

4aGV（A）、CTN-1V（B）和PV2061株（C）糖蛋白潛在跨膜區(qū)域預(yù)測

我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第17頁2.5糖蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用AntheProt5.0軟件中Gibrat法對4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示，4aGV、CTN-1V和PV2061株糖蛋白氨基酸殘基均富含潛在α螺旋、β折疊及卷曲結(jié)構(gòu)，其百分比分別為30％、31％、39％，28％、30％、41％和29％、30％、41％，3株病毒糖蛋白發(fā)生扭曲、折疊幾率較高，易形成豐富二級結(jié)構(gòu)，見圖4。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第18頁我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第19頁2.6糖蛋白B細胞抗原表位預(yù)測結(jié)合4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白一級、二級及局部特殊結(jié)構(gòu)，選取各株病毒糖蛋白親水性強，無α螺旋、β片層規(guī)則結(jié)構(gòu)，并含有β轉(zhuǎn)角可塑性較大區(qū)域及表面可能性和抗原指數(shù)高區(qū)域，分別得到3株病毒株糖蛋白潛在B細胞抗原表位區(qū)域，三者表位位置與數(shù)量相同，見圖5和表3。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第20頁我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第21頁我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第22頁信號肽結(jié)構(gòu)常指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移（定位）N-末端氨基酸序列，其最少含有1個帶正電荷氨基酸，中部有一高度疏水區(qū)以經(jīng)過細胞膜，并含有種屬特異性。4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒在N-末端前19位氨基酸均存在潛在信號肽結(jié)構(gòu)，可引導(dǎo)病毒糖蛋白在細胞膜上表示。另外，3株病毒潛在信號肽結(jié)構(gòu)氨基酸同源性僅為78.9％～94.7％，這可能是在傳代減毒過程中，病毒對不一樣傳代基質(zhì)細胞適應(yīng)表征，反過來也間接影響了3株病毒在Vero細胞中適應(yīng)程度。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第23頁Benmansour等［11］經(jīng)過對中和單克隆抗體逃逸株點突變研究，對糖蛋白中和抗原位點進行了初步定位，證實了糖蛋白含有3個中和抗原位點，且均為空間依賴型抗原位點，但當(dāng)前仍缺乏病毒糖蛋白線性表位研究資料，所以本研究對4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白二級結(jié)構(gòu)進行了深入分析，結(jié)果顯示，3株病毒糖蛋白均易發(fā)生扭曲、折疊，在多個區(qū)域存在α螺旋、β折疊及卷曲結(jié)構(gòu)，形成豐富二級結(jié)構(gòu)，并在多個位點存在潛在B細胞抗原位點。盡管當(dāng)前尚無準(zhǔn)確率較高抗原位點預(yù)測方法，但本研究分析結(jié)果仍可作為確定糖蛋白潛在優(yōu)勢表位參考。另外，本研究應(yīng)用特異性引物擴增不一樣株病毒糖蛋白全基因，并結(jié)合對應(yīng)糖蛋白編碼區(qū)序列同源性分析，可初步實現(xiàn)病毒株快速判定。我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第24頁研究結(jié)果4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒均屬基因Ⅰ型狂犬病病毒；其糖蛋白G區(qū)基因同源性為76.0％～88.4％，G區(qū)ORF基因同源性為84.4％～91.5％，氨基酸序列同源性為90.5％～92.2％；3株病毒糖蛋白前19位氨基酸中均存在潛在信號肽結(jié)構(gòu)，其中第19位氨基酸為三者潛在信號肽斷裂位點，第17位氨基酸為4aGV株病毒糖蛋白潛在信號肽斷裂位點；3株病毒糖蛋白分別在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潛在可折疊螺旋疏水性區(qū)域，為顯著跨膜區(qū)域；

4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸殘基均富含潛在α螺旋、β折疊及卷曲結(jié)構(gòu)，其百分比分別為30％、31％、39％，28％、30％、41％和29％、30％、41％，易發(fā)生扭曲、折疊，形成豐富二級結(jié)構(gòu)；

3株病毒糖蛋白潛在B細胞抗原表位位置與數(shù)量相同我國人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第25頁

糖蛋白含有