第五章食品生物技術(shù)實1

#第五章食品生物技術(shù)實驗實驗 脈胞菌固體發(fā)酵B生產(chǎn)胡蘿卜素1.實驗?zāi)康牧私饷}孢菌生長特性;學(xué)習(xí)胡蘿卜素固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝。2.實驗原理P胡蘿卜素（6 ）是共軛雙鍵化合物，分子式為，分子量為.熔點℃，p胡蘿卜素的晶體是深紅紫至暗紅色有光澤的斜六面體，稀溶液呈橙黃色至黃色。遇氧、熱及光不穩(wěn)定，在弱堿下較穩(wěn)定，是一種脂溶性色素，屬于類胡蘿卜素的一種。廣泛存在于植物、藻類和真菌中，動物和人體內(nèi)不能合成必須從外界攝入。p胡蘿卜素有各種順反不同的立體構(gòu)型，全反式的結(jié)構(gòu)如圖1所示。國內(nèi)外生產(chǎn)p胡蘿卜素可通過化學(xué)合成、植物提取和微生物發(fā)酵等種方法。微生物（真菌、細(xì)菌和藻類）發(fā)酵法生產(chǎn)p胡蘿卜素，從品質(zhì)、技術(shù)、資源和成本等因素考慮優(yōu)于上述兩種方法，未來此方法將是發(fā)展方向。所有類胡羅卜素的生物合成途徑都是來源于類異戊二烯或類萜途徑。但是大多數(shù)生物合成的類胡羅卜素是化合物。已經(jīng)證明：類胡羅卜素的生物合成是由一系列步驟完成的，這一途徑中的中間產(chǎn)物的數(shù)量和組成在不同的生物中可能有所變化。在真菌中，類胡羅卜素是由甲羥戊酸的生物途徑合成的。甲羥戊酸的代謝物是由乙酰基變化經(jīng)過羥甲基戊二酰形成的。乙酰輔酶是最初的底物前體，經(jīng)過四個階段的反應(yīng)合成p胡蘿卜素。其類胡羅卜素分子合成過程為個乙酰輔酶分子通過失去個分子的羧基團(tuán)而縮合成二羥基甲基戊酸（），在酶的作用下形成異戊二烯焦磷酸（），并異構(gòu)化形成二甲基丙烯焦磷酸脂（ ）,再于分子的作用生成二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸（ ）。在的基礎(chǔ)上，形成了八氫番茄紅素，隨后又逐步發(fā)生脫氫形成番茄紅素（ ）最后番茄紅素再經(jīng)兩端的環(huán)合作用形成p胡蘿卜素及其他類胡蘿卜素。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)B胡蘿卜素，具有條件溫和、易操作、易控制、可行性強(qiáng)等特點。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)脈孢菌的孢子中含有豐富的類胡蘿卜素，其中以B胡蘿卜素為主。同時，根據(jù)類胡羅卜素的生物合成途徑，添加生物合成的發(fā)酵底物的前體物質(zhì)，可提高B胡蘿卜素的產(chǎn)率。脈孢菌（ ）是腐生菌，在馬鈴薯瓊脂上生長良好。菌落最初白色、粉粒狀，很快變?yōu)榈S色、絨毛狀。菌落成熟后，上層覆蓋成團(tuán)塊的分生孢子。分生孢子聚成團(tuán)，淡黃色到橙紅色。菌絲體透明，四周蔓延，有橫隔。生孢子的菌絲不規(guī)律地向空中生長，即氣生菌絲有橫隔，呈雙叉式分枝。分生孢子成鏈，有孢隔，球形或近似球形，光滑，它的子囊有8個孢子；橘黃色到橙紅色，孢子直徑10-微1米2。3.實驗儀器、裝置與流程⑴菌種：脈孢菌（ ）。⑵儀器、裝置：紫外可見分光光度計、高速離心機(jī)、凈化工作臺、康氏震蕩器、霉菌培養(yǎng)箱、發(fā)酵曲盤、三角瓶。⑶試劑：P胡蘿卜素標(biāo)樣、鹽酸、丙酮。⑷培養(yǎng)基及其制備：種子培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基0豆渣5麩皮添加量 5培養(yǎng)基含水量為 8自然。添加發(fā)酵前體培養(yǎng)基（ ）：豆渣，麩皮添加量5培養(yǎng)基含水量為8添加番茄汁（濃度），H然。⑷實驗流程：4．實驗步驟及方法⑴種子培養(yǎng)：將活化完成的脈孢菌制成孢子菌懸液，轉(zhuǎn)接到三角瓶直接進(jìn)行發(fā)酵，或轉(zhuǎn)接到三角瓶作為種曲進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接到曲盤中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)B胡蘿卜素。取只 三角瓶，裝入發(fā)酵培養(yǎng)基（豆渣5麩皮添加量5培養(yǎng)基含水量為，自然），裝量為75g。用層紗布包扎瓶口，再加牛皮紙包扎。置滅菌鍋中，在 下滅菌。將成熟的斜面，在無菌條件下，住入無菌水，震蕩成孢子懸浮液（濃度個）。待發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后冷卻到 °時，分別將孢子接入三角瓶中，接種量為2%，標(biāo)好記號。將三角瓶置于霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度為°,相對濕度為8下的飽和濕度，培養(yǎng)時間 。⑵發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵采用曲盤發(fā)酵，曲盤規(guī)格是（32x15x2.8cm）。取滅菌后的曲盤6只,其中3只分別裝入滅菌后的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（豆渣85，%麩皮添加量，培養(yǎng)基含水量為 ，自然）；另外3只分別裝入添加發(fā)酵前體培養(yǎng)基（豆渣85，%麩皮添加量15，%培養(yǎng)基含水量為77-8，添0加%番茄汁（濃度），自然），裝量分別為500g。將發(fā)酵后的三角瓶種子，按照10的%接種量均勻地接入曲盤中，接種后曲盤中的發(fā)酵培養(yǎng)基盡量平整，并在曲盤上面蓋上四層無菌紗布放置霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)溫度為°,相對濕度為8下的飽和濕度，培養(yǎng)時間°每隔觀察發(fā)酵生長狀態(tài)，發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行B胡蘿卜素的提取及測定。⑶P胡蘿卜素的提?。好}孢菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)B胡蘿卜素，其產(chǎn)物存在于孢子中，故提取必須經(jīng)過破壁處理。實驗采用熱酸破壁法。①B胡蘿卜素的破壁和提取的原理：脈孢菌的孢子壁結(jié)構(gòu)組成成分大致與其細(xì)胞壁相同，都是由幾丁質(zhì)和葡聚糖等構(gòu)成而形成緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。利用鹽酸對孢子壁中的某些多糖與蛋白質(zhì)成分作用，破壞網(wǎng)狀的共價鍵，使得原來結(jié)構(gòu)緊密的孢壁變得疏松，再經(jīng)過沸水浴和驟冷處理，孢壁結(jié)構(gòu)得以破壞，孢內(nèi)物質(zhì)溶出，便于提取。P胡蘿卜素是脂溶性的色素，需用有機(jī)溶劑來提取。而它在丙酮中溶解度較大，而丙酮具有低毒、低沸點以及具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，所以，丙酮是較好的提取劑。②破壁及提取的方法：精確稱取 干燥（干燥溫度°）后的發(fā)酵基質(zhì)，于三角瓶中，TOC\o"1-5"\h\z加入 （ ）,在常溫下避光放置振蕩器上振蕩。沸水浴 ，迅速冷卻。將破壁好的孢子懸液，轉(zhuǎn)入離心管中，進(jìn)行離心（ ） ，棄去上清液，加入適量的蒸餾水?dāng)嚢杷春螅?，再進(jìn)行離心（ ） ，棄上清液，重復(fù)水洗、離心一次。將完成離心的提取物中加入 丙酮，充分?jǐn)嚢枋沟肂胡蘿卜素迅速擴(kuò)散進(jìn)入丙酮相中，然后離心（ ） ，收集上清液，重復(fù)操作直到提取液變?yōu)闊o色為止，合并提取液并記下提取液的總體積。再用紫外可見分光光度計在 下測量合并液的吸光值。5.測定方法⑴P胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：①標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精取 0胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)樣品，放入比色管中，用丙酮定容至滿刻度。用移液管移取該溶液，轉(zhuǎn)入 容量瓶中，然后，用丙酮定容至滿刻度，則該溶液中0胡蘿卜素的濃度即為Mm②.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取支比色管（土1最小刻度為 ）依次移取標(biāo)準(zhǔn)溶液 00 0 0 0 ，搖勻后，用蒸餾水稀釋至 ，此時的溶液分別相當(dāng)于0胡蘿卜素濃度為（M ）：、、、、. 。然后在 下用紫外分光光度計分別測定吸光值，根據(jù)數(shù)據(jù)列表擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取得率計算：發(fā)酵基質(zhì)提取得率可由以下公式計算得出。提取得率（用/g發(fā)酵基質(zhì)）=cwC--提取液中0-胡蘿卜素的濃度（用/ml）V提取液總體積（ml）K---稀釋因子W發(fā)酵基質(zhì)重量（g）④注意事項0-胡蘿卜素對光、熱、氧氣、酸不穩(wěn)定，故在操作過程中，應(yīng)盡量避開這些不穩(wěn)定因素。.6.實驗結(jié)果與討論將不同發(fā)酵培養(yǎng)基的基質(zhì)進(jìn)行0-胡蘿卜素測定，實驗結(jié)果添入下表，比較兩種不同發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)物的得率。表1比較不同發(fā)酵培養(yǎng)基中0胡