南方根結(jié)線蟲在不同茉莉酸含量番茄株系中發(fā)育狀態(tài)觀察

南方根結(jié)線蟲在不同茉莉酸含量番茄株系中發(fā)育狀李小曼瀏楊;劉潔;王紹輝;趙文超【摘要】[目的]探究內(nèi)源茉莉酸對番茄中南方根結(jié)線蟲生長發(fā)育的影響.[方法]以番茄野生型株系CM、過量表達前系統(tǒng)素轉(zhuǎn)基因番茄35S::PS(35S::prosystemin)和茉莉酸合成缺失突變體spr2為試驗材料,采用石蠟切片的方法，觀察接種南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)后不同時間各株系內(nèi)線蟲的發(fā)育.[結(jié)果]接種南方根結(jié)線蟲J25d和7d,CM、35S::PS和spr2根系中線蟲發(fā)育無顯著差異;接種J214d,21d和28d,35S::PS根系中線蟲發(fā)育較CM根系中線蟲和spr2根系中線蟲緩慢.[結(jié)論]茉莉酸在一定程度上可以抑制南方根結(jié)線蟲在番茄中的發(fā)育.％[objective]Toinvestigatetheeffectsofjasmonicacidonthegrowthanddevelopmentofrootknotnematodesintomato.[Methods]TomatoCM(widetipe),JAoverexpressedtransgenictomatoline35S::prosystemin(35S::PS)andJAbiosyntheticmutant(spr2)wereusedtoinoculateRKNJ2.ThedevelopmentstatusofnematodesinCM,35S::PSandspr2wasobservedbyparaffinsections.[Results]AfterinoculationRKNJ25and7d,wefoundtherewerenosignificantdifferencesinnematodedevelopmentstatusamongCM,35S::PSandspr2,andafterinoculationRKNJ214,21and28d,thenematodesdevelopmentintherootof35S::PSwereslowerthanthatinCMrootsandspr2roots.[Conclusion]Jasmonicacidcouldinhibitthedevelopmentofrootknotnematodeintomatotosomeextent.【期刊名稱】《北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報》【年(卷)，期】2017(032)004【總頁數(shù)】4頁(P61-64)【關(guān)鍵詞】番茄;茉莉酸;根結(jié)線蟲;發(fā)育狀態(tài)【作者】李小曼瀏楊;劉潔;王紹輝;趙文超【作者單位】北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206;北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206;北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206;北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206;北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206【正文語種】中文【中圖分類】S432番茄最早產(chǎn)于厄瓜多爾、秘魯、維多利亞等地，為茄科番茄屬，一年生或多年生草本植物［1］。一直到19世紀人們才發(fā)現(xiàn)番茄可以食用并且營養(yǎng)豐富。隨后便在世界各地被普遍種植，到現(xiàn)在為止已成為我國重要的水果型蔬菜之一。近年來隨著設(shè)施蔬菜栽培的越來越多，面積逐漸加大，受溫室內(nèi)環(huán)境和復(fù)種指數(shù)影響致使根結(jié)線蟲病的危害日益加重，一般情況減產(chǎn)10%~15%，嚴重時減產(chǎn)30%~40%，甚至絕收［2］。根結(jié)線蟲病傳播迅速，繁殖時間短，所以根結(jié)線蟲病發(fā)生后不及時治理，可能會影響農(nóng)作物的生產(chǎn)，嚴重危害我國蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［3］。茉莉酸(JA)作為一種防御類的激素，在植物受到根結(jié)線蟲侵染時，誘導(dǎo)抗性基因的表達，提高抗病性。Cooper等［4］研究發(fā)現(xiàn)對番茄外源噴施JA可以在高溫下提高Mi基因介導(dǎo)的對根結(jié)線蟲的防御響應(yīng)。Fujimoto等［5］表明用0.5mmol/L或更高濃度的茉莉酸甲酯對植物葉面進行處理，可以顯著的降低根結(jié)線蟲的侵染并且這個效果可以持續(xù)一周左右。Gleason等［6］發(fā)現(xiàn)在擬南芥中外源噴施茉莉酸甲酯可以顯著的降低根結(jié)線蟲弓I起的根結(jié)的數(shù)量。Fan等［7］研究表明接種根結(jié)線蟲后，相較于CM,spr2更敏感且不能誘導(dǎo)葉片中抗性基因PI-II基因高效表達。夕卜源噴施茉莉酸甲酯后，發(fā)現(xiàn)spr2對根結(jié)線蟲的敏感度降低且葉片中PI-II基因表達量顯著升高，說明夕卜源噴施茉莉酸甲酯在一定程度上能夠提高植株對根結(jié)線蟲的抗性。但均未說明JA對根結(jié)線蟲發(fā)育的影響。本試驗以番茄野生型CM，過表達前系統(tǒng)素轉(zhuǎn)基因番茄35S::PS以及茉莉酸合成缺失突變體spr2為試驗材料，接種南方根結(jié)線蟲J2，觀察接種后5、7、14、21、28d三個株系中線蟲發(fā)育情況，為研究JA調(diào)節(jié)根結(jié)線蟲抗性機理奠定基礎(chǔ)。1.1植物材料番茄材料野生型(WT)為CM(SolanumlycopersicumcvCastlemart)，以CM為背景的內(nèi)源茉莉酸含量高的過量表達前系統(tǒng)素轉(zhuǎn)基因番茄35S:PS(35S：prosystemin)和茉莉酸合成缺失突變體spr2。各株系的原始種子由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所(北京)李傳友研究員惠贈。1.2方法1.2.1番茄的種植和管理番茄的種植參照Hu等［8］的方法，略有改動，如下：播種前將種子浸泡在55°C的溫水中4h，然后放在鋪有潤濕的雙層濾紙上，放到26°C的恒溫箱中2d左右露白。1.2.2南方根結(jié)線蟲的接種及繁育試驗中所用根結(jié)線蟲為實驗室自繁，方法如下：用于繁殖根結(jié)線蟲的株系為易感株系。待其長到4~5片葉時，將根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)接種到植株根系，接種大約50d，待其根部有大量淡黃色的卵塊時，取出根系。將取出的植株的根小心地洗干凈，挑取上面卵塊，然后將卵塊放入1%的NaClO溶液中消毒30s，之后去離子水洗3次，將NaClO溶液沖洗干凈。再放在26C恒溫箱中孵化，大約3d可收集已孵化出的J2,并計算其密度，以便用于接種試驗。接種根結(jié)線蟲的方法參照馬金慧等［9］的方法，略有改動：番茄長到4~5片真葉時接種。接種量為500頭/株，并將表面覆蓋基質(zhì)。對照組應(yīng)用同樣的方式注入相同體積的清水，并用基質(zhì)覆蓋。接種完成后，稍稍噴灑一些清水，保持濕潤。1.2.3石蠟切片的制作與觀察采用石蠟切片的方法觀察侵染后不同時間線蟲的發(fā)育情況，參照劉雪嬌等［10］的方法，略有改動：（1）取材與固定：選取接種線蟲后5、7、14、21、28d長勢相同的4株植株的根結(jié)剪下，放入FAA固定液（50%酒精：冰醋酸：醛=18:1:1）中，固定24h。（2）脫水與透明：將固定好的材料加入70%、85%、95%、100%、100%的乙醇中，每級30min（根據(jù)根結(jié)大小而定）梯度脫水，脫水后加入到體積1:1酒精與二甲苯混合液中30min后換二甲苯浸泡30min，呈透明狀。（空氣越干燥越好）⑶脫蠟和染色：脫蠟：二甲苯2次，每次10min后，之后放入1:1二甲苯：乙醇15min,100%乙醇5min（2次），依次95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇，50%乙醇，30%乙醇，去離子水各5min。染色：入甲苯胺藍溶液染色，室溫10min，之后蒸餾水洗10min,100%酒精脫水2min,1:1二甲苯：乙醇1min，二甲苯1min。1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用Excel進行數(shù)據(jù)記錄和處理，采用Graph-padPrism6進行圖表制作，利用Duncan氏多重比較法進行差異顯著性分析，不同的字母代表在0.05水平差異顯著。3個生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)4個樣本。如圖所示，接種南方根結(jié)線蟲J25d時，CM、35S::PS、spr2株系中南方根結(jié)線蟲均為J2（圖1,A5d,B5d,C5d）,南方根結(jié)線蟲體寬分別為14.85pm.15.07pm和13.87pm（圖2）;接種南方根結(jié)線蟲J27d時，CM、35S::PS、spr2株系中南方根結(jié)線蟲均已經(jīng)膨大（圖1,A7d,B7d,C7d）,體寬分別為26.54pm.24.57pm和26.47pm,無明顯差異（圖2）;接種南方根結(jié)線蟲J214d時，CM、35S::PS、spr2株系中南方根結(jié)線蟲體寬分別為93.91pm、61.95pm和96.37pm（圖2）,35S:PS根中南方根結(jié)線的體寬顯著小于CM和spr2根中南方根結(jié)線蟲的體寬(圖1,A14d,B14d,C14d)。接種南方根結(jié)線蟲J221d時，CM、35S::PS、spr2株系中南方根結(jié)線蟲體寬分別為181.43pm.153.32pm和206.48pm(S2),此時CM和spr2根中南方根結(jié)線蟲部分已發(fā)育為雌蟲，呈梨形(圖1,A21d,C21d),但是spr2根中南方根結(jié)線的體寬明顯大于CM根中南方根結(jié)線蟲的體寬；35S::PS中南方根結(jié)線蟲發(fā)育為三齡幼蟲(J3)或四齡幼蟲(J4)。接種南方根結(jié)線蟲J228d時，CM、35S::PS、spr2株系中南方根結(jié)線蟲體寬分別為214.23pm.184.50pm和238.23pm(圖2),此時CM和spr2根中南方根結(jié)線蟲大部分已發(fā)育為成熟的雌蟲(圖1,A28d,C28d),spr2根中南方根結(jié)線蟲的體寬顯著大于CM根中南方根結(jié)線蟲的體寬。而35S::PS根中南方根結(jié)線蟲只有少部分發(fā)育為雌蟲(圖1,B28d),說明35S:PS根中線蟲發(fā)育較緩慢。在線蟲和植物長期互作的過程中，植物會產(chǎn)生一些防御反應(yīng)來抵御線蟲的入侵：(1)病程相關(guān)基因的表達；(2)分泌根系分泌物來趨避線蟲，減少線蟲的入侵；(3)抑制巨細胞的發(fā)育，不能形成取食位點；(4)抑制線蟲的發(fā)育，或者使成熟的雌蟲不產(chǎn)卵或者不完全產(chǎn)卵［11］。王雪等［12］研究感病大豆品種和抗病大豆品種的根系分泌物對大豆包囊線蟲的趨避性。將線蟲J2和浸有分泌物的濾紙片對峙放置，24h后發(fā)現(xiàn)在0-1cm的區(qū)間內(nèi)，感病植株J2的分布律最高為17.7%，其次為清水對照，分布率為2.5%而抗病植株J2的分布率為0，說明感病植株的根系分泌物可以吸引線蟲而抗病植株的根系分泌物則排斥線蟲。董林林［13］表明植物根系分泌物中的低濃度的月桂酸可吸引南方根結(jié)線蟲并將其致死，高濃度的月桂酸和棕櫚酸則可以趨避線蟲。Nyczepir等［13］研究表明，桃抗病砧木‘Guardian'可以抑制J2發(fā)育,使其不能發(fā)育為成熟的雌蟲而失去產(chǎn)卵能力。陳雪峰等［14］研究發(fā)現(xiàn)抗病植株接種7d后，大多數(shù)仍為J2，接種14d時發(fā)育為J3，接種21d時，線蟲未發(fā)育仍為J3；而感病植株中，線蟲從5d開始發(fā)育，接種14d時線蟲已發(fā)育為J4,接種21d時，部分線蟲已經(jīng)發(fā)育為成熟的雌蟲。研究還表明抗病植株中線蟲發(fā)育緩慢是由于巨細胞發(fā)育程度弓I起的，后期巨細胞不能提供線蟲生長發(fā)育所需的營養(yǎng)致使線蟲不能發(fā)育，使植物最終表現(xiàn)為抗病。茉莉酸響應(yīng)根結(jié)線蟲侵染時的防御反應(yīng)的研究主要集中在葉片中相關(guān)抗性基因的表達、保護酶的活性等方面，而茉莉酸對線蟲發(fā)育影響的研究較少。Nahar[15]等研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸、茉莉酸和乙烯(ET)可以誘導(dǎo)水稻的防御系統(tǒng)來抵御線蟲的侵染；用三種激素處理植物根部，發(fā)現(xiàn)茉莉酸和乙烯可以誘導(dǎo)病程相關(guān)基因OsPRla和OsPRlb表達；隨后用茉莉酸合成缺失突變體和乙烯不敏感突變體接種根結(jié)線蟲，發(fā)現(xiàn)乙烯誘導(dǎo)的系統(tǒng)防御反應(yīng)需要完成的茉莉酸途徑，但是茉莉酸誘導(dǎo)的系統(tǒng)防御反應(yīng)不受乙烯途徑的影響，說明茉莉酸在水稻防御根結(jié)線蟲中起到至關(guān)重要的作用。本試驗表明，內(nèi)源茉莉酸影響南方根結(jié)線蟲在番茄中的發(fā)育，接種南方根結(jié)線蟲J221d時，CM和spr2中線蟲部分已發(fā)育為雌蟲，而35S::PS中大部分線蟲處于三齡幼蟲或四齡幼蟲階段。那么，茉莉酸是如何影響線蟲發(fā)育？茉莉酸是否會通過影響根系分泌物的組成成分來影響線蟲的行為？根結(jié)線蟲侵染植株根部后，主要是在植株根部維管束周圍建立取食位點形成巨細胞，從中吸取營養(yǎng)來促進自身的生長發(fā)育，那么，茉莉酸是否會對巨細胞的發(fā)育產(chǎn)生影響？如果改變植株內(nèi)內(nèi)源茉莉酸的含量是否會影響到巨細胞的形成和發(fā)育？這些問題需要我們進一步去探究?！鞠嚓P(guān)文獻】喬寶建漲紹文.番茄史話[J].中國瓜菜,2009(4):62-63于力，朱為民,薛林寶，閻君.番茄根結(jié)線蟲病的研究進展[J].中國蔬菜,2006(11):35-38李戌清，鄭經(jīng)武,鄭積榮，等.番茄根結(jié)線蟲研究進展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012(4):748-752CooperWR,JiaL,GogginL.Effectsofjasmonate-induceddefensesonroot-knotnematodeinfectionofresistantandsusceptibletomatocultivars[J].JournalofChemicalEcology,2005,31(9):1953-1967FujimotoT,TomitakaY,AbeH,etal.Expressionprofileofjasmonicacid-inducedgenesandtheinducedresistanceagainsttheroot-knotnematode(Meloidogyneincognita)intomatoplants(Solanumlycopersicum)afterfoliartreatmentwithmethyljasmonate[J].JournalofPlantPhysiology,2011,168(10):1084-1097GleasonC,LeelarasameeN,etal.OPDAhaskeyroleinregulatingplantsusceptibilitytotheroot-knotnematodeMeloidogynehaplainArabidopsis[J].FrontiersinPlantScience,2016,7(e100026)FanJW,HuCL,ZhangLN,etal.Jasmonicacidmediatestomato'sresponsetorootknotnematodes[J].JournalofPlantGrowthRegulation,2015,34(1):196-205HuCL,ZhaoWC,FanJW,etal.ProtectiveenzymesandgenesrelatedtotheJApathwayareinvolvedintheresponsetoroot-knotnematodesathighsoiltemperaturesintomatoescarryingMi-1[J].Horticulture,Environment,and