獸藥殘留檢測技術(shù)激素類課件

第六章獸藥殘留檢測技術(shù)第八節(jié)激素類藥物殘留的危害分析與檢測方法一、概述獸用激素包括皮質(zhì)激素、同化激素。天然皮質(zhì)激素主要有可的松及氫化可的松。這類皮質(zhì)激素有較強的糖代謝及抗炎等作用,而對水、鹽代謝的作用較弱,所以稱其為糖皮質(zhì)激素。臨床上應(yīng)用廣泛。通常所說的皮質(zhì)激素即指這類激素。近年來,為了提高療效,降低副作用,而合成了一系列的糖皮質(zhì)激素衍生物。如潑尼松(強的松)與氫化潑尼松(強的松龍),糖原異生作用更強,對水鹽平衡的影響更弱。較小劑量常用于補充腎上腺皮質(zhì)功能缺乏,較大劑量則能抑制免疫過程中的多個環(huán)節(jié)，緩解炎癥。1、糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素的主要作用是能降低機體對內(nèi)外環(huán)境各種刺激的反應(yīng)性,具體表現(xiàn)在抗炎、免疫抑制、抗毒素和抗休克等方面。還可使血糖升高,蛋白質(zhì)分解加強,使血淋巴細胞、嗜酸性細胞減少,紅細胞、嗜中性粒細胞、血小板增高等。糖皮質(zhì)激素主要用于以下疾病:各種炎癥、嚴重感染及傳染病、過敏性疾病、風(fēng)濕病、休克、代謝疾病以及引產(chǎn)。皮質(zhì)激素會引起水分在體內(nèi)滯留,增加肉的重量,因而在畜牧業(yè)中有可能當(dāng)作增重劑而被濫用。濫用這類藥物后,肉品感官上多汁、肉瘦。因此飼養(yǎng)場中用皮質(zhì)激素作催長劑，屬于違禁使用。地塞米松別名氟美松,不溶于水,溶于無水乙醇。應(yīng)遮光保存?？寡准翱刂破つw過敏的作用比潑尼松龍更顯著,而對水、鈉潴留和促進鉀排泄作用較弱。目前地塞米松的應(yīng)用愈來愈廣泛,有取代潑尼松等其他合成皮質(zhì)激素的趨勢。肌注后吸收快,狗和鼠分別于0.5h和6h達血藥峰濃度。大部分在肝內(nèi)被代謝成羥基地塞米松及其葡萄糖苷結(jié)合物而滅活。氟輕松氟輕松為白色結(jié)晶性粉末,無臭,不溶于水,溶于乙醇。應(yīng)遮光、密封保存。氟輕松為外用皮質(zhì)激素中療效最顯著而副作用較小的一種,涂敷于局部對皮膚、黏膜的炎癥(搔癢及皮膚過敏反應(yīng)等有效。不但療效高,而且顯效快,使用很低濃度即有明顯作用,止癢作用尤其突出。本品主要用于各種皮膚病,如濕疹、過敏性皮炎、皮膚瘙癢等。對局部化膿創(chuàng)面,需同時配合新霉素等抗生素。倍他米松倍他米松為白色結(jié)晶性粉末,無臭,味苦,幾乎不溶于水,溶于乙醇。本品含有多種鹽類,如磷酸鈉鹽、二丙酸鹽、醋酸鹽等。均應(yīng)遮光保存。內(nèi)服吸收良好,生物利用度約為72%,血漿蛋白結(jié)合率64%,半衰期5.6h,4.8%的藥量自尿液排出。牛肌注80μg/kg,停藥二日,肝臟中母藥殘留量為5.4~7.8μg/kg;停藥八日,肝臟中母藥殘留量為10.9μg/kg,腎臟、肌肉和脂肪中母藥殘留量分別為2.3μg/kg、3.9μg/kg和4.4μg/kg。同化激素類藥物去氫睪酮、去氫甲睪酮、醋酸氯地孕酮、氯睪酮、乙烯雌醇、醋酸甲羥孕酮、醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮、諾甲醋孕酮、去甲睪酮、司坦唑醇、醋酸群勃龍等醋酸甲羥孕酮作用與黃體酮相似,孕激素活性強,無雌激素和雄激素活性,有抗雌激素作用。內(nèi)服、注射均有效。內(nèi)服在胃腸道吸收,在肝內(nèi)降解。肌內(nèi)注射后2~3天血藥濃度達到峰值。血藥峰值越高,藥物清除越快。肌注150mg后6~9個月血中才檢不出藥物。小牛肌注復(fù)方制劑(24mg醋酸甲羥孕酮、100mg苯甲酸雌二醇、200mg癸酸去甲睪酮)后停藥2天,血漿中醋酸甲羥孕酮濃度為1μg/kg,14天時降至30pg/kg。尿液在數(shù)天內(nèi)都能檢出,14天時醋酸甲羥孕酮濃度為37pg/kg。腎組織殘留相對較高,故作為殘留檢測的靶組織。醋酸美侖孕酮別名醋酸甲烯雌醇,為合成的避孕藥。內(nèi)服時孕激素作用約為黃體酮的75倍,無雌激素和雄激素活性,具有顯著排卵抑制作用。小母牛用藥后,母藥和代謝物主要由糞便排出。停藥6h,肝、脂肪、腎和肌肉組織中的殘留量分別為9~15μg/kg、7~8μg//kg、1.2~1.8μg/kg和0.5~1μg/kg。脂肪、肝、腎和肌肉中母藥殘留量分別占總殘留的80%、37%、30%和45%。美國FDA規(guī)定休藥期48h,但歐盟禁止使用。醋酸甲地孕酮本品為孕激素對垂體促性腺激素的釋放有一定的抑制作用,但比左炔諾孕酮和炔諾酮為弱。不具有雌激素和雄激素樣活性,但有明顯抗雌激素作用。與雌激素合用,抑制排卵。動物致畸試驗表明對家兔具有死胎率增加和致畸作用?？诜笊锇胨テ诿黠@比左炔諾孕酮為短,大部分代謝產(chǎn)物以葡萄糖醛酸酯形式排出。3、危害對人體危害較為嚴重的主要有甾類同化激素(包括雌酮、雌二醇、睪酮、皮質(zhì)酮等物質(zhì))及β2-受體激動劑(苯乙胺類)。這些存在于環(huán)境介質(zhì)中的激素量雖然很小,但大多具有生物富集作用,容易通過食物鏈在人體中富集,對人類及其他生物產(chǎn)生極其嚴重的危害。主要產(chǎn)生各種慢性、蓄積性毒性,如致癌、致畸、致突變等三致性毒性以及免疫毒性、發(fā)育毒性和生態(tài)毒性等。β2-受體激動劑類藥物可產(chǎn)生急性毒性作用。危害多具有隱蔽性,易造成實質(zhì)性危害而難以逆轉(zhuǎn)。糖皮質(zhì)激素的危害對人體的危害主要表現(xiàn)為抑制腎上腺皮質(zhì)功能,使腎上腺皮質(zhì)萎縮。另外,過多攝入,可使人產(chǎn)生多毛癥、滿月臉以及免疫力下降等毒副作用。對敏感型的個體可造成血管擴張,血壓降低而引起休克,甚至死亡。雄性激素及其同化激素的危害進人人體和動物體后,對其生殖功能產(chǎn)生嚴重的影響,甚至可能造成某些物種的絕種。通過食物鏈進行富集,在人體首先引起內(nèi)分泌失調(diào),危害生殖系統(tǒng),易出現(xiàn)生殖器病變。對男性的危害：表現(xiàn)為睪丸萎縮、胸部擴大、早禿、肝腎功能障礙或肝臟腫瘤。對女性的危害：可引起女性的不孕、早產(chǎn)、流產(chǎn)、月經(jīng)不調(diào)或女性男性化(肌肉增生、毛發(fā)增多)等現(xiàn)象。目前,在局部地區(qū)已開始出現(xiàn)人類生存危機現(xiàn)象,如發(fā)達國家約有20%的家庭沒有子女,而睪丸癌的患者明顯增加。對其他動物的危害激素污染對人類以外的其他動物影響更為顯著,如魚、鳥和哺乳動物的大量死亡,雌雄異變,生育和發(fā)育紊亂,免疫力下降等現(xiàn)象,可能均與此有關(guān)。1980年左右,美國一造紙廠廢水排出口下游的雌性魚雄性化,且雄性化后的魚與原先正常雌性魚進行交尾,原來正常雄性魚出現(xiàn)超雄化,并表現(xiàn)為攻擊性交尾行動。在日本,發(fā)現(xiàn)有雌海螺長有雄海螺的生殖器。雌性激素的危害雌性激素造成的環(huán)境污染,同樣可能造成某些物種的絕種。通過食物鏈產(chǎn)生的富集作用,可引起人體的內(nèi)分泌失調(diào),對男性的危害：使男性精子數(shù)量下降或出現(xiàn)女性化、性早熟、抑制骨骼發(fā)育等。對女性的危害：可引起女性性早熟、生殖器官畸形和癌變,這一效應(yīng)在其女性后代中表現(xiàn)更顯著。對人類后代的危害：這些激素透過胎盤,可引起用藥者子宮內(nèi)膜及女性后代的陰道宮頸癌變和男性后代的精子發(fā)育不良、生殖器畸形。二、樣品處理（一）皮質(zhì)激素的樣品處理（二）同化激素的樣品處理（一）皮質(zhì)激素1、皮質(zhì)激素樣品預(yù)處理液體樣品(奶、血液、尿液)提取前需要脫脂肪,通常在4℃、7000g離心,除去浮在上層的脂肪。組織樣品(肌肉、肝、腎)先要用切碎機或勻漿器進行組織破碎。水或醋酸鹽緩沖液常用于樣品的稀釋。肝臟或尿樣中的皮質(zhì)激素結(jié)合物較多,因此先用葡糖苷酸酶/硫酸酯酶水解。由于酶解反應(yīng)較慢,為保證水解完全,可在較高的溫度下來加速水解或延長孵育時間。用超臨界萃取法提取時,先要將組織樣品勻漿,再進行冷凍干燥。2、提取皮質(zhì)激素在一定的pH值條件下,一般用有機溶劑對樣品提取和除蛋白。例如,氯仿提取牛奶中的氫化可的松;二氯甲烷-正己烷(4+1)提取牛奶中游離的氫化可的松和21-醋酸酯;乙酸乙酯提取動物組織中的氫化波尼松、氟強的松龍、氟羥強的松龍、倍他米松,牛奶中的甲基強的松龍，牛奶中的氫化波尼松和地塞米松;含0.1mol/L氫氧化鈉的乙酸乙酯提取牛組織中的地塞米松;3、凈化粗提取液中含大量的內(nèi)源性干擾物質(zhì),為了消除或降低干擾并濃縮分析物,樣液需要凈化處理。凈化方法包括液-液萃取、固相萃取、免疫親和色譜及柱切換技術(shù)等。液-液萃取可以簡單的一次溶劑萃取,也可以多次溶劑萃取。萃取次數(shù)的多少,很大程度上取決于色譜的分離效率和選擇性。色譜的分離度和選擇性愈高,樣品的提取和凈化步驟可以簡略一些,還可以提高分析效率。液-液萃取法液-液萃取可以除去生物樣品中大部分雜質(zhì)和蛋白質(zhì)。例如,氫化波尼松、氟強的松龍、氟羥強的松龍和倍他米松的乙酸乙酯提取液,依次用稀酸溶液和稀堿溶液洗滌,可以除去堿性和酸性的水溶性雜質(zhì)。地塞米松的乙酸乙酯提取液,可以用氫氧化鈉溶液洗滌,以除去酚類雌激素。甲基強的松龍的初提液蒸發(fā)至干后,用乙腈溶解,加入正已烷提取,正已烷提取液再用飽和的硫酸鈉水溶液提取,最后用二氯甲烷提取。免疫親和柱色譜法免疫親和柱具有高的專一性,近年來發(fā)展迅速,已應(yīng)用于皮質(zhì)激素的生物樣品制備。例如,用兩種抗體結(jié)合的免疫親和柱,可以分離純化肝、牛奶、尿樣和糞樣中9種皮質(zhì)激素。免疫親和色譜與GC-負離子化學(xué)電離質(zhì)譜聯(lián)用,已用于馬組織中雙氟美松的確證分析。柱切換技術(shù)柱切換技術(shù)自動化程度高,在線濃縮和純化,大大簡化了樣品的前處理步驟。例如,牛組織中地塞米松測定時,樣液經(jīng)苯基柱初級分離后流至硅膠預(yù)富集柱中,通過柱切換,改變流動相將富集柱中的待測物洗脫至氰丙基分析柱中分離。超臨界CO2流體萃取法超臨界CO2流體萃取法具有低溫、快速、無溶劑萃取的優(yōu)點。例如,超臨界流體萃取法與HPLC聯(lián)用,用于牛組織中地塞米松殘留的測定。（二）同化激素的樣品處理1、樣品預(yù)處理：液體樣品(尿、血漿、膽汁、牛奶)在提取前,可用水或磷酸鹽緩沖液稀釋。半固體樣品(肌肉、肝、腎)在提取前需要均質(zhì)。脂肪樣可在40~60℃下加熱,使脂肪融化成液體。2、提取生物樣品中游離的類固醇激素可以用丙酮、乙醚、乙腈、堿性乙腈、四氫呋喃、叔丁基甲醚和氯仿-甲醇等有機溶劑提取。激素結(jié)合物的水溶性較大,不易被有機溶劑提取,可先將樣品水解后再提取游離激素。常用的水解方法有酶水解和堿水解兩種。酶水解通常使用葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶,前者可專一地水解葡糖苷酸結(jié)合物,后者可水解硫酸酯結(jié)合物。由于尿樣和組織中通常同時存在上述兩種結(jié)合物,常使用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.5~7.0,于37℃溫育過夜。堿水解通常使用氫氧化鈉溶液,由于合成類固醇常以酯制劑注入動物,水解后使酯類釋放出游離的類固醇。3、凈化粗提取液的凈化方法包括液-液萃取、固相萃取法、液相色譜、免疫親和色譜和超臨界流體色譜等。為了達到更好的純化效果,可將幾種方法結(jié)合應(yīng)用。液-液萃取法液-液萃取大多是去除水溶性提取液中的脂肪,例如,乙腈或甲醇提取液中加入正己烷或異辛烷,可脫去脂類物質(zhì)。脂肪樣中的激素(30種雄激素)可用正己烷提取,再用甲醇-醋酸鹽緩沖液(pH5.2)提取正己烷中的激素,同時去除脂類物質(zhì),水性提取液再用二氯甲烷抽提。當(dāng)乙腈粗提取液調(diào)節(jié)pH至13時,加入正己烷和二氯甲烷進行三相液-液萃取,極性和離子型酸性物質(zhì)進入水相,脂類等低極性物質(zhì)則進入上層正己烷相中,而中等極性物質(zhì)(如待測物：群勃龍和表群勃龍、去甲睪酮和美侖孕酮)進入中間乙腈相中。固相萃取法柱層析采用氧化鋁、硅膠和Celite吸附劑,可有效分離分析物和內(nèi)源性雜質(zhì),已應(yīng)用于肉樣中七種類固醇的純化。固相萃取法具有簡便、快速、經(jīng)濟等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于激素類藥物的凈化。正相柱常用硅膠、氧化鋁、氰基型和氨基型吸附劑,反相柱常用C18和C8吸附劑。C18固相萃取柱和AmberliteXAD-2離子交換柱適合純化親脂性或中性的同化激素。司坦唑醇在C18固相萃取柱上的回收率偏低,是由于它的結(jié)構(gòu)為吡唑環(huán)和雄(甾)烷環(huán)縮合而成,兩個活潑氫可解離,具有離子化的性質(zhì),可與固定相或玻璃的活性點發(fā)生吸附,但其在C8和苯磺酸型的混合固定相小柱中,凈化效果和回收率均佳。C18和硅膠的混合柱同樣被用來對粗提取液的純化。C8、硅膠和氨基型的混合固定相小柱被成功地應(yīng)用于肉中同化激素和異化激素的分離,激素按照極性、非極性和酚類性質(zhì)分段流出,然后再分別純化。固相萃取柱的凈化效果有時并不能滿足質(zhì)譜檢測的要求,因此有人將固相萃取法與色譜法相結(jié)合,對樣品提取液作更高的純化。另外,還有采用C18柱對樣液色譜分離,用自動餾分收集器收集分析物的餾分,餾分收集后吹干,然后衍生化GC分析。柱切換技術(shù)柱切換技術(shù)也被應(yīng)用于激素的生物樣品制備。例如,將牛肝提取液注入凝膠柱中,含同化激素的兩段餾分被切入到硅膠柱(富集柱)中,群勃龍和去甲睪酮激素在富集柱中被濃縮純化,洗脫后流入氰基柱中,再通過柱切換,流入硅膠分析柱中分離測定。醋酸美侖孕酮為中性、脂溶性的類固醇,固相萃取法對牛組織提取液中醋酸美侖孕酮的提取純化效果欠佳,故采用柱切換。其過程為粗提取液注入苯基柱中作初級分離,含分析物的餾分被切換到硅膠預(yù)富集柱中,濃縮提純后再通過柱切換洗脫至硅膠分析柱中分離測定;若收集餾分,可用于GC-MS分析。免疫親和柱色譜法免疫親和柱具有專一性高的優(yōu)點,但適合同化激素純化的免疫親和柱目前還不多。對于多殘留分析,可將幾種免疫親和固定相配伍使用。免疫親和柱已應(yīng)用于生物樣品中己烯雄酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的純化,以及肉和尿中去甲睪酮、睪酮和群勃龍的純化。此外,亦有報道采用在線免疫親和色譜法,對生物樣品中的去甲睪酮及其表代謝物進行純化。超臨界流體色譜法超臨界流體萃取可以在低溫條件下獲得無溶劑的提取物,且快速,但從生物樣品中分離激素的研究目前還很少。有報道采用超臨界流體萃取和超臨界流體色譜相結(jié)合,用來檢測豬腎中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚殘留。超臨界CO2提取時,同化激素被柱子保留,而非極性的內(nèi)源性物質(zhì)不被保留,然后換流動相來洗脫激素,串聯(lián)質(zhì)譜檢測。用超臨界CO2提取牛組織中7種促生長激素,發(fā)現(xiàn)極性藥物(地塞米松、曲安奈德、玉米赤霉醇)的回收率偏低,約44%~58%,非極性藥物(醋酸美侖孕酮、甲羥孕酮、己烯雌酚)的回收率相當(dāng)高,約83%~91%。由于共萃取物的干擾,群勃龍不能被檢測到,尤其是脂肪和肝臟樣品中的共萃取物,對群勃龍的色譜峰有嚴重干擾。因此,超臨界流體萃取法并不能取代所有的樣品處理方法。在超臨界流體萃取前后,還需要其他凈化方法加以處理。三、分析方法（一）皮質(zhì)激素分析方法有關(guān)動物性食品中皮質(zhì)激素類的殘留分析,文獻報道很少。皮質(zhì)激素類的殘留分析主要采用色譜法,包括薄層色譜法、液相色譜法和氣相色譜法。1、薄層色譜法薄層色譜法具有設(shè)備簡單、經(jīng)濟等優(yōu)點,適合生物樣品的篩選分析。早期采用苯肼硫酸溶液作顯色劑,后來采用其他一些顯色劑,如磷酸甲醇溶液、四唑藍、對甲苯磺酸和2,3,5-三苯基-2H-四唑氯。Vanoosthμyze等建立了一種高效薄層色譜法,能夠檢測注射部位中的29種皮質(zhì)激素。樣液滴注于Kieselgel60板上,以氯仿-甲醇作展開劑,展開后組分得到很好地分離,用2,4-二羥苯甲醛噴霧顯色,色澤差異明顯,366nm處熒光檢測分析物。2、氣相色譜法GC法分析動物源性食品中皮質(zhì)激素,早期采用TMS衍生化,OV-17275cm柱分離,電子捕獲檢測器檢測。例如,氫化波尼松、氟強的松龍、氟羥強的松龍和倍他米松TMS衍生化,采用N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺、三甲基甲硅烷咪唑和三甲基氯硅烷混合衍生劑進行硅烷化。目前,GC-MS得到了廣泛應(yīng)用。測定地塞米松時,用TMS-enol-TMS衍生化較好。例子：Delahaμt等報道了一種GC-MS法分析肝臟、牛奶、尿樣和糞樣中的5種皮質(zhì)激素(氫化波尼松、甲基強的松龍、地塞米松,雙氟美松和異氟烷)。⑴不同樣品的提取肝臟樣品：取5g肝樣加10mL醋酸鹽緩沖液均質(zhì),加入Helixpomatia混合酶,于60℃孵育2h,水解結(jié)束后,用20mL乙腈提取,離心,取出上清液并加入8mL正己烷和2mL二氯甲烷混合,離心,取出中間乙腈相層并蒸發(fā)至干,殘余物用1mL乙醇溶解,過C18固相萃取柱。⑴不同樣品的提取牛奶樣品：取10mL牛奶,于4℃離心,除去浮在上面的脂肪并將剩下的脫脂奶用等量的水稀釋,過C18固相萃取柱。尿樣：取5mL尿樣,加入2mLpH4.8醋酸鹽緩沖液和Helixpomatia混合酶,于37℃孵育過夜,水解結(jié)束后,加入5mL磷酸緩沖鹽,過C18固相萃取柱。糞樣：取5g糞樣,加入10mL醋酸鹽緩沖液和35mL乙醚,振搖,離心后取出乙醚相并蒸發(fā)至干,殘余物用3mL乙醇溶解,加入12mL水和5mL正己烷,振搖,靜止分層后取出水相,過C18固相萃取柱。⑵不同提取樣品的凈化牛奶、尿和糞便樣液過C18固相萃取柱后,依次用5mL水、5mL丙酮-水(20+80)、5mL甲醇-水(20+80)、5mL二氯甲烷-正己烷(20+80)和5mL乙酸乙酯-正己烷(10+90)淋洗,用3mL乙酸乙酯洗脫皮質(zhì)激素,洗脫液蒸發(fā)至干后,用0.5mL乙醇和5ml磷酸緩沖鹽溶液溶解殘余物,過免疫親和柱凈化。肝臟樣液過C18固相萃取柱后,依次用5mL水、5mL丙酮-水(20+80)、5mL甲醇-水(20+80)和5mL正已烷淋洗,用1mL乙酸乙酯洗脫。經(jīng)過固相萃取柱凈化后,將洗脫液的pH值調(diào)至7~7.5,再過免疫親和柱(含地塞米松和氫化波尼松抗體的凝膠)純化,用水淋洗柱子,3mL甲醇-水(80+20)洗脫。取部分洗脫液,加入氯鉻酸吡啶氧化,氧化的皮質(zhì)激素衍生物進行GC-MS分析。Courtheyn等對氯鉻酸吡啶氧化法作了改進,簡化了樣品前處理步驟,采用負離子化學(xué)電離GC-MS法測定尿液和糞便中地塞米松含量,以二氟美松作內(nèi)標(biāo),測定結(jié)果與酶聯(lián)免疫法一致,該方法檢測限<0.1μg/L。3、液相色譜法反相液相色譜（RP-HPLC）和正相液相色譜（NP-HPLC）均可用于皮質(zhì)激素的分析。由于皮質(zhì)激素有較強的紫外吸收,因此紫外檢測法常被廣泛采用,檢測波長一般設(shè)在254nm。但對于動物源食品中殘留的某些皮質(zhì)激素及其代謝物,則必須制備成衍生物后,進行熒光檢測。HPLC-MS技術(shù)在皮質(zhì)激素分析中也有應(yīng)用,例如,LC-APCI-MS對牛組織中地塞米松的鑒別測定。Goto等報道了NP-HPLC法同時分離測定血清中的地塞米松和氫化可的松。這種方法包括用9-蒽腈進行柱前熒光衍生化,衍生物經(jīng)固相萃取柱凈化,以除去過量的衍生劑及內(nèi)源性的類固醇雜質(zhì),色譜分離后用熒光檢測。Prasad等采用NP-HPLC法同時測定血漿中氫化可的松、可的松、地塞米松、強的松、氫化波尼松和甲基強的松龍殘留,最低檢測限為10μg/L。Santos-Montes采用RP-HPLC測定尿中的皮質(zhì)醇和可的松。Schild采用RP-HPLC測定血漿中的地塞米松。Fluri等研究了電噴霧電離LC-MS測定人尿中9種糖皮質(zhì)激素的方法。崔曉亮等采用超高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧四極桿質(zhì)譜法同時測走牛奶中12種糖皮質(zhì)激素的殘留。VandeHauwe等報道了電噴霧電離LC-MS/MS法測定牛組織中地塞米松和二氟美松殘留量。Sangiorgi等采用大氣壓化學(xué)電離LC-MS/MS測定牛尿中7種糖皮質(zhì)激素。VandeHauwe等報道了采用電噴霧電離LC-MS/MS分析牛肝中11種糖皮質(zhì)激素。（二）同化激素分析方法生物樣品中同化激素類的分析主要采用色譜法,包括薄層色譜法、氣相色譜法和液相色譜法。1、薄層色譜法薄層色譜法具有快速、經(jīng)濟等優(yōu)點,適合殘留分析的初篩。例如,用于雌激素的多殘留篩選。為了提高薄層色譜分析的靈敏度和選擇性,在顯色劑研究上做了大量的工作,一些與雌酮、雌二醇、己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉烯醇發(fā)生顯色反應(yīng)的染料被相繼報道。重氮基染料與雌激素反應(yīng),形成重氮基衍生物、酚基和二羥基苯甲酸內(nèi)酯類的雌激素衍生物,它們的色澤強度各不相同。此外,科林斯紅和快藍BB與激素反應(yīng)成鹽后,具有很強的色澤。2、氣相色譜法在20世紀70年代GC-MS已被用于同化激素的分析。20世紀80年代出現(xiàn)的毛細管GC使GC-MS結(jié)構(gòu)簡化、儀器成本下降。毛細管GC和SIM檢測方式使GC-MS發(fā)展成為一種成熟的、集高效分離、高靈敏度檢測和結(jié)構(gòu)鑒定為一體的分析技術(shù)。目前,GC-MS已成為同化激素殘留分析中普遍采用的方法。SIM檢測：選擇離子監(jiān)測技術(shù)同化激素及其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中含有多個羥基或酮基等極性基團,為高極性、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定差的化合物,GC法難以直接分析,因此需衍生化使形成易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的衍生物,以提高其色譜性能。由于它們的結(jié)構(gòu)中含羥基和酮基,常用的衍生方法包括硅烷化、?；碗炕?。例子：1992年,Daeseleire等報道了GC-MS法測定牛肉和牛尿中多種同化激素(去甲睪酮、睪酮、雌二醇、炔雌醇、孕酮、群勃龍、玉米赤霉醇、己烯雌酚、去氫睪酮、美雄酮、甲睪酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羥孕酮、氯睪酮、醋酸氯睪酮)的殘留。樣品用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶水解,經(jīng)液-液萃取和固相萃取柱凈化,再通過HPLC純化,分別收集含分析物的五段餾分,衍生后GC-MS檢測。1997年,Hartmann等報道了GC-MS法測定牛肉組織中類固醇激素,包括雄烯二酮、雄酮、睪酮、孕酮、雌酮、雌二醇、脫氫表雄酮、二氫睪酮、表睪酮、羥孕酮、孕烯醇酮、雌三醇、甲基睪酮和甲羥孕酮。2003年,Dickson等采用GC-MS法篩選和確證牛尿中己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和玉米赤霉醇的殘留。2005年,Seo等報道了GC-MS法同時測定肌肉中多種促生長激素(雌二醇及其代謝物、睪酮、孕酮、玉米赤霉醇、已烯雌酚)。3、液相色譜法HPLC比GC更常用于激素的分析。雌性激素的分析：分析極性較大的雌激素結(jié)合物常采用陰離子交