獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)激素類(lèi)課件

第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第八節(jié)激素類(lèi)藥物殘留的危害分析與檢測(cè)方法一、概述獸用激素包括皮質(zhì)激素、同化激素。天然皮質(zhì)激素主要有可的松及氫化可的松。這類(lèi)皮質(zhì)激素有較強(qiáng)的糖代謝及抗炎等作用,而對(duì)水、鹽代謝的作用較弱,所以稱(chēng)其為糖皮質(zhì)激素。臨床上應(yīng)用廣泛。通常所說(shuō)的皮質(zhì)激素即指這類(lèi)激素。近年來(lái),為了提高療效,降低副作用,而合成了一系列的糖皮質(zhì)激素衍生物。如潑尼松(強(qiáng)的松)與氫化潑尼松(強(qiáng)的松龍),糖原異生作用更強(qiáng),對(duì)水鹽平衡的影響更弱。較小劑量常用于補(bǔ)充腎上腺皮質(zhì)功能缺乏,較大劑量則能抑制免疫過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)，緩解炎癥。1、糖皮質(zhì)激素糖皮質(zhì)激素的主要作用是能降低機(jī)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境各種刺激的反應(yīng)性,具體表現(xiàn)在抗炎、免疫抑制、抗毒素和抗休克等方面。還可使血糖升高,蛋白質(zhì)分解加強(qiáng),使血淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞減少,紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、血小板增高等。糖皮質(zhì)激素主要用于以下疾病:各種炎癥、嚴(yán)重感染及傳染病、過(guò)敏性疾病、風(fēng)濕病、休克、代謝疾病以及引產(chǎn)。皮質(zhì)激素會(huì)引起水分在體內(nèi)滯留,增加肉的重量,因而在畜牧業(yè)中有可能當(dāng)作增重劑而被濫用。濫用這類(lèi)藥物后,肉品感官上多汁、肉瘦。因此飼養(yǎng)場(chǎng)中用皮質(zhì)激素作催長(zhǎng)劑，屬于違禁使用。地塞米松別名氟美松,不溶于水,溶于無(wú)水乙醇。應(yīng)遮光保存?？寡准翱刂破つw過(guò)敏的作用比潑尼松龍更顯著,而對(duì)水、鈉潴留和促進(jìn)鉀排泄作用較弱。目前地塞米松的應(yīng)用愈來(lái)愈廣泛,有取代潑尼松等其他合成皮質(zhì)激素的趨勢(shì)。肌注后吸收快,狗和鼠分別于0.5h和6h達(dá)血藥峰濃度。大部分在肝內(nèi)被代謝成羥基地塞米松及其葡萄糖苷結(jié)合物而滅活。氟輕松氟輕松為白色結(jié)晶性粉末,無(wú)臭,不溶于水,溶于乙醇。應(yīng)遮光、密封保存。氟輕松為外用皮質(zhì)激素中療效最顯著而副作用較小的一種,涂敷于局部對(duì)皮膚、黏膜的炎癥(搔癢及皮膚過(guò)敏反應(yīng)等有效。不但療效高,而且顯效快,使用很低濃度即有明顯作用,止癢作用尤其突出。本品主要用于各種皮膚病,如濕疹、過(guò)敏性皮炎、皮膚瘙癢等。對(duì)局部化膿創(chuàng)面,需同時(shí)配合新霉素等抗生素。倍他米松倍他米松為白色結(jié)晶性粉末,無(wú)臭,味苦,幾乎不溶于水,溶于乙醇。本品含有多種鹽類(lèi),如磷酸鈉鹽、二丙酸鹽、醋酸鹽等。均應(yīng)遮光保存。內(nèi)服吸收良好,生物利用度約為72%,血漿蛋白結(jié)合率64%,半衰期5.6h,4.8%的藥量自尿液排出。牛肌注80μg/kg,停藥二日,肝臟中母藥殘留量為5.4~7.8μg/kg;停藥八日,肝臟中母藥殘留量為10.9μg/kg,腎臟、肌肉和脂肪中母藥殘留量分別為2.3μg/kg、3.9μg/kg和4.4μg/kg。同化激素類(lèi)藥物去氫睪酮、去氫甲睪酮、醋酸氯地孕酮、氯睪酮、乙烯雌醇、醋酸甲羥孕酮、醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮、諾甲醋孕酮、去甲睪酮、司坦唑醇、醋酸群勃龍等醋酸甲羥孕酮作用與黃體酮相似,孕激素活性強(qiáng),無(wú)雌激素和雄激素活性,有抗雌激素作用。內(nèi)服、注射均有效。內(nèi)服在胃腸道吸收,在肝內(nèi)降解。肌內(nèi)注射后2~3天血藥濃度達(dá)到峰值。血藥峰值越高,藥物清除越快。肌注150mg后6~9個(gè)月血中才檢不出藥物。小牛肌注復(fù)方制劑(24mg醋酸甲羥孕酮、100mg苯甲酸雌二醇、200mg癸酸去甲睪酮)后停藥2天,血漿中醋酸甲羥孕酮濃度為1μg/kg,14天時(shí)降至30pg/kg。尿液在數(shù)天內(nèi)都能檢出,14天時(shí)醋酸甲羥孕酮濃度為37pg/kg。腎組織殘留相對(duì)較高,故作為殘留檢測(cè)的靶組織。醋酸美侖孕酮?jiǎng)e名醋酸甲烯雌醇,為合成的避孕藥。內(nèi)服時(shí)孕激素作用約為黃體酮的75倍,無(wú)雌激素和雄激素活性,具有顯著排卵抑制作用。小母牛用藥后,母藥和代謝物主要由糞便排出。停藥6h,肝、脂肪、腎和肌肉組織中的殘留量分別為9~15μg/kg、7~8μg//kg、1.2~1.8μg/kg和0.5~1μg/kg。脂肪、肝、腎和肌肉中母藥殘留量分別占總殘留的80%、37%、30%和45%。美國(guó)FDA規(guī)定休藥期48h,但歐盟禁止使用。醋酸甲地孕酮本品為孕激素對(duì)垂體促性腺激素的釋放有一定的抑制作用,但比左炔諾孕酮和炔諾酮為弱。不具有雌激素和雄激素樣活性,但有明顯抗雌激素作用。與雌激素合用,抑制排卵。動(dòng)物致畸試驗(yàn)表明對(duì)家兔具有死胎率增加和致畸作用。口服后生物半衰期明顯比左炔諾孕酮為短,大部分代謝產(chǎn)物以葡萄糖醛酸酯形式排出。3、危害對(duì)人體危害較為嚴(yán)重的主要有甾類(lèi)同化激素(包括雌酮、雌二醇、睪酮、皮質(zhì)酮等物質(zhì))及β2-受體激動(dòng)劑(苯乙胺類(lèi))。這些存在于環(huán)境介質(zhì)中的激素量雖然很小,但大多具有生物富集作用,容易通過(guò)食物鏈在人體中富集,對(duì)人類(lèi)及其他生物產(chǎn)生極其嚴(yán)重的危害。主要產(chǎn)生各種慢性、蓄積性毒性,如致癌、致畸、致突變等三致性毒性以及免疫毒性、發(fā)育毒性和生態(tài)毒性等。β2-受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物可產(chǎn)生急性毒性作用。危害多具有隱蔽性,易造成實(shí)質(zhì)性危害而難以逆轉(zhuǎn)。糖皮質(zhì)激素的危害對(duì)人體的危害主要表現(xiàn)為抑制腎上腺皮質(zhì)功能,使腎上腺皮質(zhì)萎縮。另外,過(guò)多攝入,可使人產(chǎn)生多毛癥、滿月臉以及免疫力下降等毒副作用。對(duì)敏感型的個(gè)體可造成血管擴(kuò)張,血壓降低而引起休克,甚至死亡。雄性激素及其同化激素的危害進(jìn)人人體和動(dòng)物體后,對(duì)其生殖功能產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,甚至可能造成某些物種的絕種。通過(guò)食物鏈進(jìn)行富集,在人體首先引起內(nèi)分泌失調(diào),危害生殖系統(tǒng),易出現(xiàn)生殖器病變。對(duì)男性的危害：表現(xiàn)為睪丸萎縮、胸部擴(kuò)大、早禿、肝腎功能障礙或肝臟腫瘤。對(duì)女性的危害：可引起女性的不孕、早產(chǎn)、流產(chǎn)、月經(jīng)不調(diào)或女性男性化(肌肉增生、毛發(fā)增多)等現(xiàn)象。目前,在局部地區(qū)已開(kāi)始出現(xiàn)人類(lèi)生存危機(jī)現(xiàn)象,如發(fā)達(dá)國(guó)家約有20%的家庭沒(méi)有子女,而睪丸癌的患者明顯增加。對(duì)其他動(dòng)物的危害激素污染對(duì)人類(lèi)以外的其他動(dòng)物影響更為顯著,如魚(yú)、鳥(niǎo)和哺乳動(dòng)物的大量死亡,雌雄異變,生育和發(fā)育紊亂,免疫力下降等現(xiàn)象,可能均與此有關(guān)。1980年左右,美國(guó)一造紙廠廢水排出口下游的雌性魚(yú)雄性化,且雄性化后的魚(yú)與原先正常雌性魚(yú)進(jìn)行交尾,原來(lái)正常雄性魚(yú)出現(xiàn)超雄化,并表現(xiàn)為攻擊性交尾行動(dòng)。在日本,發(fā)現(xiàn)有雌海螺長(zhǎng)有雄海螺的生殖器。雌性激素的危害雌性激素造成的環(huán)境污染,同樣可能造成某些物種的絕種。通過(guò)食物鏈產(chǎn)生的富集作用,可引起人體的內(nèi)分泌失調(diào),對(duì)男性的危害：使男性精子數(shù)量下降或出現(xiàn)女性化、性早熟、抑制骨骼發(fā)育等。對(duì)女性的危害：可引起女性性早熟、生殖器官畸形和癌變,這一效應(yīng)在其女性后代中表現(xiàn)更顯著。對(duì)人類(lèi)后代的危害：這些激素透過(guò)胎盤(pán),可引起用藥者子宮內(nèi)膜及女性后代的陰道宮頸癌變和男性后代的精子發(fā)育不良、生殖器畸形。二、樣品處理（一）皮質(zhì)激素的樣品處理（二）同化激素的樣品處理（一）皮質(zhì)激素1、皮質(zhì)激素樣品預(yù)處理液體樣品(奶、血液、尿液)提取前需要脫脂肪,通常在4℃、7000g離心,除去浮在上層的脂肪。組織樣品(肌肉、肝、腎)先要用切碎機(jī)或勻漿器進(jìn)行組織破碎。水或醋酸鹽緩沖液常用于樣品的稀釋。肝臟或尿樣中的皮質(zhì)激素結(jié)合物較多,因此先用葡糖苷酸酶/硫酸酯酶水解。由于酶解反應(yīng)較慢,為保證水解完全,可在較高的溫度下來(lái)加速水解或延長(zhǎng)孵育時(shí)間。用超臨界萃取法提取時(shí),先要將組織樣品勻漿,再進(jìn)行冷凍干燥。2、提取皮質(zhì)激素在一定的pH值條件下,一般用有機(jī)溶劑對(duì)樣品提取和除蛋白。例如,氯仿提取牛奶中的氫化可的松;二氯甲烷-正己烷(4+1)提取牛奶中游離的氫化可的松和21-醋酸酯;乙酸乙酯提取動(dòng)物組織中的氫化波尼松、氟強(qiáng)的松龍、氟羥強(qiáng)的松龍、倍他米松,牛奶中的甲基強(qiáng)的松龍，牛奶中的氫化波尼松和地塞米松;含0.1mol/L氫氧化鈉的乙酸乙酯提取牛組織中的地塞米松;3、凈化粗提取液中含大量的內(nèi)源性干擾物質(zhì),為了消除或降低干擾并濃縮分析物,樣液需要凈化處理。凈化方法包括液-液萃取、固相萃取、免疫親和色譜及柱切換技術(shù)等。液-液萃取可以簡(jiǎn)單的一次溶劑萃取,也可以多次溶劑萃取。萃取次數(shù)的多少,很大程度上取決于色譜的分離效率和選擇性。色譜的分離度和選擇性愈高,樣品的提取和凈化步驟可以簡(jiǎn)略一些,還可以提高分析效率。液-液萃取法液-液萃取可以除去生物樣品中大部分雜質(zhì)和蛋白質(zhì)。例如,氫化波尼松、氟強(qiáng)的松龍、氟羥強(qiáng)的松龍和倍他米松的乙酸乙酯提取液,依次用稀酸溶液和稀堿溶液洗滌,可以除去堿性和酸性的水溶性雜質(zhì)。地塞米松的乙酸乙酯提取液,可以用氫氧化鈉溶液洗滌,以除去酚類(lèi)雌激素。甲基強(qiáng)的松龍的初提液蒸發(fā)至干后,用乙腈溶解,加入正已烷提取,正已烷提取液再用飽和的硫酸鈉水溶液提取,最后用二氯甲烷提取。免疫親和柱色譜法免疫親和柱具有高的專(zhuān)一性,近年來(lái)發(fā)展迅速,已應(yīng)用于皮質(zhì)激素的生物樣品制備。例如,用兩種抗體結(jié)合的免疫親和柱,可以分離純化肝、牛奶、尿樣和糞樣中9種皮質(zhì)激素。免疫親和色譜與GC-負(fù)離子化學(xué)電離質(zhì)譜聯(lián)用,已用于馬組織中雙氟美松的確證分析。柱切換技術(shù)柱切換技術(shù)自動(dòng)化程度高,在線濃縮和純化,大大簡(jiǎn)化了樣品的前處理步驟。例如,牛組織中地塞米松測(cè)定時(shí),樣液經(jīng)苯基柱初級(jí)分離后流至硅膠預(yù)富集柱中,通過(guò)柱切換,改變流動(dòng)相將富集柱中的待測(cè)物洗脫至氰丙基分析柱中分離。超臨界CO2流體萃取法超臨界CO2流體萃取法具有低溫、快速、無(wú)溶劑萃取的優(yōu)點(diǎn)。例如,超臨界流體萃取法與HPLC聯(lián)用,用于牛組織中地塞米松殘留的測(cè)定。（二）同化激素的樣品處理1、樣品預(yù)處理：液體樣品(尿、血漿、膽汁、牛奶)在提取前,可用水或磷酸鹽緩沖液稀釋。半固體樣品(肌肉、肝、腎)在提取前需要均質(zhì)。脂肪樣可在40~60℃下加熱,使脂肪融化成液體。2、提取生物樣品中游離的類(lèi)固醇激素可以用丙酮、乙醚、乙腈、堿性乙腈、四氫呋喃、叔丁基甲醚和氯仿-甲醇等有機(jī)溶劑提取。激素結(jié)合物的水溶性較大,不易被有機(jī)溶劑提取,可先將樣品水解后再提取游離激素。常用的水解方法有酶水解和堿水解兩種。酶水解通常使用葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶,前者可專(zhuān)一地水解葡糖苷酸結(jié)合物,后者可水解硫酸酯結(jié)合物。由于尿樣和組織中通常同時(shí)存在上述兩種結(jié)合物,常使用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.5~7.0,于37℃溫育過(guò)夜。堿水解通常使用氫氧化鈉溶液,由于合成類(lèi)固醇常以酯制劑注入動(dòng)物,水解后使酯類(lèi)釋放出游離的類(lèi)固醇。3、凈化粗提取液的凈化方法包括液-液萃取、固相萃取法、液相色譜、免疫親和色譜和超臨界流體色譜等。為了達(dá)到更好的純化效果,可將幾種方法結(jié)合應(yīng)用。液-液萃取法液-液萃取大多是去除水溶性提取液中的脂肪,例如,乙腈或甲醇提取液中加入正己烷或異辛烷,可脫去脂類(lèi)物質(zhì)。脂肪樣中的激素(30種雄激素)可用正己烷提取,再用甲醇-醋酸鹽緩沖液(pH5.2)提取正己烷中的激素,同時(shí)去除脂類(lèi)物質(zhì),水性提取液再用二氯甲烷抽提。當(dāng)乙腈粗提取液調(diào)節(jié)pH至13時(shí),加入正己烷和二氯甲烷進(jìn)行三相液-液萃取,極性和離子型酸性物質(zhì)進(jìn)入水相,脂類(lèi)等低極性物質(zhì)則進(jìn)入上層正己烷相中,而中等極性物質(zhì)(如待測(cè)物：群勃龍和表群勃龍、去甲睪酮和美侖孕酮)進(jìn)入中間乙腈相中。固相萃取法柱層析采用氧化鋁、硅膠和Celite吸附劑,可有效分離分析物和內(nèi)源性雜質(zhì),已應(yīng)用于肉樣中七種類(lèi)固醇的純化。固相萃取法具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于激素類(lèi)藥物的凈化。正相柱常用硅膠、氧化鋁、氰基型和氨基型吸附劑,反相柱常用C18和C8吸附劑。C18固相萃取柱和AmberliteXAD-2離子交換柱適合純化親脂性或中性的同化激素。司坦唑醇在C18固相萃取柱上的回收率偏低,是由于它的結(jié)構(gòu)為吡唑環(huán)和雄(甾)烷環(huán)縮合而成,兩個(gè)活潑氫可解離,具有離子化的性質(zhì),可與固定相或玻璃的活性點(diǎn)發(fā)生吸附,但其在C8和苯磺酸型的混合固定相小柱中,凈化效果和回收率均佳。C18和硅膠的混合柱同樣被用來(lái)對(duì)粗提取液的純化。C8、硅膠和氨基型的混合固定相小柱被成功地應(yīng)用于肉中同化激素和異化激素的分離,激素按照極性、非極性和酚類(lèi)性質(zhì)分段流出,然后再分別純化。固相萃取柱的凈化效果有時(shí)并不能滿足質(zhì)譜檢測(cè)的要求,因此有人將固相萃取法與色譜法相結(jié)合,對(duì)樣品提取液作更高的純化。另外,還有采用C18柱對(duì)樣液色譜分離,用自動(dòng)餾分收集器收集分析物的餾分,餾分收集后吹干,然后衍生化GC分析。柱切換技術(shù)柱切換技術(shù)也被應(yīng)用于激素的生物樣品制備。例如,將牛肝提取液注入凝膠柱中,含同化激素的兩段餾分被切入到硅膠柱(富集柱)中,群勃龍和去甲睪酮激素在富集柱中被濃縮純化,洗脫后流入氰基柱中,再通過(guò)柱切換,流入硅膠分析柱中分離測(cè)定。醋酸美侖孕酮為中性、脂溶性的類(lèi)固醇,固相萃取法對(duì)牛組織提取液中醋酸美侖孕酮的提取純化效果欠佳,故采用柱切換。其過(guò)程為粗提取液注入苯基柱中作初級(jí)分離,含分析物的餾分被切換到硅膠預(yù)富集柱中,濃縮提純后再通過(guò)柱切換洗脫至硅膠分析柱中分離測(cè)定;若收集餾分,可用于GC-MS分析。免疫親和柱色譜法免疫親和柱具有專(zhuān)一性高的優(yōu)點(diǎn),但適合同化激素純化的免疫親和柱目前還不多。對(duì)于多殘留分析,可將幾種免疫親和固定相配伍使用。免疫親和柱已應(yīng)用于生物樣品中己烯雄酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的純化,以及肉和尿中去甲睪酮、睪酮和群勃龍的純化。此外,亦有報(bào)道采用在線免疫親和色譜法,對(duì)生物樣品中的去甲睪酮及其表代謝物進(jìn)行純化。超臨界流體色譜法超臨界流體萃取可以在低溫條件下獲得無(wú)溶劑的提取物,且快速,但從生物樣品中分離激素的研究目前還很少。有報(bào)道采用超臨界流體萃取和超臨界流體色譜相結(jié)合,用來(lái)檢測(cè)豬腎中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚殘留。超臨界CO2提取時(shí),同化激素被柱子保留,而非極性的內(nèi)源性物質(zhì)不被保留,然后換流動(dòng)相來(lái)洗脫激素,串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。用超臨界CO2提取牛組織中7種促生長(zhǎng)激素,發(fā)現(xiàn)極性藥物(地塞米松、曲安奈德、玉米赤霉醇)的回收率偏低,約44%~58%,非極性藥物(醋酸美侖孕酮、甲羥孕酮、己烯雌酚)的回收率相當(dāng)高,約83%~91%。由于共萃取物的干擾,群勃龍不能被檢測(cè)到,尤其是脂肪和肝臟樣品中的共萃取物,對(duì)群勃龍的色譜峰有嚴(yán)重干擾。因此,超臨界流體萃取法并不能取代所有的樣品處理方法。在超臨界流體萃取前后,還需要其他凈化方法加以處理。三、分析方法（一）皮質(zhì)激素分析方法有關(guān)動(dòng)物性食品中皮質(zhì)激素類(lèi)的殘留分析,文獻(xiàn)報(bào)道很少。皮質(zhì)激素類(lèi)的殘留分析主要采用色譜法,包括薄層色譜法、液相色譜法和氣相色譜法。1、薄層色譜法薄層色譜法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),適合生物樣品的篩選分析。早期采用苯肼硫酸溶液作顯色劑,后來(lái)采用其他一些顯色劑,如磷酸甲醇溶液、四唑藍(lán)、對(duì)甲苯磺酸和2,3,5-三苯基-2H-四唑氯。Vanoosthμyze等建立了一種高效薄層色譜法,能夠檢測(cè)注射部位中的29種皮質(zhì)激素。樣液滴注于Kieselgel60板上,以氯仿-甲醇作展開(kāi)劑,展開(kāi)后組分得到很好地分離,用2,4-二羥苯甲醛噴霧顯色,色澤差異明顯,366nm處熒光檢測(cè)分析物。2、氣相色譜法GC法分析動(dòng)物源性食品中皮質(zhì)激素,早期采用TMS衍生化,OV-17275cm柱分離,電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)。例如,氫化波尼松、氟強(qiáng)的松龍、氟羥強(qiáng)的松龍和倍他米松TMS衍生化,采用N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺、三甲基甲硅烷咪唑和三甲基氯硅烷混合衍生劑進(jìn)行硅烷化。目前,GC-MS得到了廣泛應(yīng)用。測(cè)定地塞米松時(shí),用TMS-enol-TMS衍生化較好。例子：Delahaμt等報(bào)道了一種GC-MS法分析肝臟、牛奶、尿樣和糞樣中的5種皮質(zhì)激素(氫化波尼松、甲基強(qiáng)的松龍、地塞米松,雙氟美松和異氟烷)。⑴不同樣品的提取肝臟樣品：取5g肝樣加10mL醋酸鹽緩沖液均質(zhì),加入Helixpomatia混合酶,于60℃孵育2h,水解結(jié)束后,用20mL乙腈提取,離心,取出上清液并加入8mL正己烷和2mL二氯甲烷混合,離心,取出中間乙腈相層并蒸發(fā)至干,殘余物用1mL乙醇溶解,過(guò)C18固相萃取柱。⑴不同樣品的提取牛奶樣品：取10mL牛奶,于4℃離心,除去浮在上面的脂肪并將剩下的脫脂奶用等量的水稀釋,過(guò)C18固相萃取柱。尿樣：取5mL尿樣,加入2mLpH4.8醋酸鹽緩沖液和Helixpomatia混合酶,于37℃孵育過(guò)夜,水解結(jié)束后,加入5mL磷酸緩沖鹽,過(guò)C18固相萃取柱。糞樣：取5g糞樣,加入10mL醋酸鹽緩沖液和35mL乙醚,振搖,離心后取出乙醚相并蒸發(fā)至干,殘余物用3mL乙醇溶解,加入12mL水和5mL正己烷,振搖,靜止分層后取出水相,過(guò)C18固相萃取柱。⑵不同提取樣品的凈化牛奶、尿和糞便樣液過(guò)C18固相萃取柱后,依次用5mL水、5mL丙酮-水(20+80)、5mL甲醇-水(20+80)、5mL二氯甲烷-正己烷(20+80)和5mL乙酸乙酯-正己烷(10+90)淋洗,用3mL乙酸乙酯洗脫皮質(zhì)激素,洗脫液蒸發(fā)至干后,用0.5mL乙醇和5ml磷酸緩沖鹽溶液溶解殘余物,過(guò)免疫親和柱凈化。肝臟樣液過(guò)C18固相萃取柱后,依次用5mL水、5mL丙酮-水(20+80)、5mL甲醇-水(20+80)和5mL正已烷淋洗,用1mL乙酸乙酯洗脫。經(jīng)過(guò)固相萃取柱凈化后,將洗脫液的pH值調(diào)至7~7.5,再過(guò)免疫親和柱(含地塞米松和氫化波尼松抗體的凝膠)純化,用水淋洗柱子,3mL甲醇-水(80+20)洗脫。取部分洗脫液,加入氯鉻酸吡啶氧化,氧化的皮質(zhì)激素衍生物進(jìn)行GC-MS分析。Courtheyn等對(duì)氯鉻酸吡啶氧化法作了改進(jìn),簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟,采用負(fù)離子化學(xué)電離GC-MS法測(cè)定尿液和糞便中地塞米松含量,以二氟美松作內(nèi)標(biāo),測(cè)定結(jié)果與酶聯(lián)免疫法一致,該方法檢測(cè)限<0.1μg/L。3、液相色譜法反相液相色譜（RP-HPLC）和正相液相色譜（NP-HPLC）均可用于皮質(zhì)激素的分析。由于皮質(zhì)激素有較強(qiáng)的紫外吸收,因此紫外檢測(cè)法常被廣泛采用,檢測(cè)波長(zhǎng)一般設(shè)在254nm。但對(duì)于動(dòng)物源食品中殘留的某些皮質(zhì)激素及其代謝物,則必須制備成衍生物后,進(jìn)行熒光檢測(cè)。HPLC-MS技術(shù)在皮質(zhì)激素分析中也有應(yīng)用,例如,LC-APCI-MS對(duì)牛組織中地塞米松的鑒別測(cè)定。Goto等報(bào)道了NP-HPLC法同時(shí)分離測(cè)定血清中的地塞米松和氫化可的松。這種方法包括用9-蒽腈進(jìn)行柱前熒光衍生化,衍生物經(jīng)固相萃取柱凈化,以除去過(guò)量的衍生劑及內(nèi)源性的類(lèi)固醇雜質(zhì),色譜分離后用熒光檢測(cè)。Prasad等采用NP-HPLC法同時(shí)測(cè)定血漿中氫化可的松、可的松、地塞米松、強(qiáng)的松、氫化波尼松和甲基強(qiáng)的松龍殘留,最低檢測(cè)限為10μg/L。Santos-Montes采用RP-HPLC測(cè)定尿中的皮質(zhì)醇和可的松。Schild采用RP-HPLC測(cè)定血漿中的地塞米松。Fluri等研究了電噴霧電離LC-MS測(cè)定人尿中9種糖皮質(zhì)激素的方法。崔曉亮等采用超高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)走牛奶中12種糖皮質(zhì)激素的殘留。VandeHauwe等報(bào)道了電噴霧電離LC-MS/MS法測(cè)定牛組織中地塞米松和二氟美松殘留量。Sangiorgi等采用大氣壓化學(xué)電離LC-MS/MS測(cè)定牛尿中7種糖皮質(zhì)激素。VandeHauwe等報(bào)道了采用電噴霧電離LC-MS/MS分析牛肝中11種糖皮質(zhì)激素。（二）同化激素分析方法生物樣品中同化激素類(lèi)的分析主要采用色譜法,包括薄層色譜法、氣相色譜法和液相色譜法。1、薄層色譜法薄層色譜法具有快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),適合殘留分析的初篩。例如,用于雌激素的多殘留篩選。為了提高薄層色譜分析的靈敏度和選擇性,在顯色劑研究上做了大量的工作,一些與雌酮、雌二醇、己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉烯醇發(fā)生顯色反應(yīng)的染料被相繼報(bào)道。重氮基染料與雌激素反應(yīng),形成重氮基衍生物、酚基和二羥基苯甲酸內(nèi)酯類(lèi)的雌激素衍生物,它們的色澤強(qiáng)度各不相同。此外,科林斯紅和快藍(lán)BB與激素反應(yīng)成鹽后,具有很強(qiáng)的色澤。2、氣相色譜法在20世紀(jì)70年代GC-MS已被用于同化激素的分析。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的毛細(xì)管GC使GC-MS結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化、儀器成本下降。毛細(xì)管GC和SIM檢測(cè)方式使GC-MS發(fā)展成為一種成熟的、集高效分離、高靈敏度檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定為一體的分析技術(shù)。目前,GC-MS已成為同化激素殘留分析中普遍采用的方法。SIM檢測(cè)：選擇離子監(jiān)測(cè)技術(shù)同化激素及其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基或酮基等極性基團(tuán),為高極性、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定差的化合物,GC法難以直接分析,因此需衍生化使形成易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的衍生物,以提高其色譜性能。由于它們的結(jié)構(gòu)中含羥基和酮基,常用的衍生方法包括硅烷化、?；碗炕＠樱?992年,Daeseleire等報(bào)道了GC-MS法測(cè)定牛肉和牛尿中多種同化激素(去甲睪酮、睪酮、雌二醇、炔雌醇、孕酮、群勃龍、玉米赤霉醇、己烯雌酚、去氫睪酮、美雄酮、甲睪酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羥孕酮、氯睪酮、醋酸氯睪酮)的殘留。樣品用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶水解,經(jīng)液-液萃取和固相萃取柱凈化,再通過(guò)HPLC純化,分別收集含分析物的五段餾分,衍生后GC-MS檢測(cè)。1997年,Hartmann等報(bào)道了GC-MS法測(cè)定牛肉組織中類(lèi)固醇激素,包括雄烯二酮、雄酮、睪酮、孕酮、雌酮、雌二醇、脫氫表雄酮、二氫睪酮、表睪酮、羥孕酮、孕烯醇酮、雌三醇、甲基睪酮和甲羥孕酮。2003年,Dickson等采用GC-MS法篩選和確證牛尿中己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和玉米赤霉醇的殘留。2005年,Seo等報(bào)道了GC-MS法同時(shí)測(cè)定肌肉中多種促生長(zhǎng)激素(雌二醇及其代謝物、睪酮、孕酮、玉米赤霉醇、已烯雌酚)。3、液相色譜法HPLC比GC更常用于激素的分析。雌性激素的分析：分析極性較大的雌激素結(jié)合物常采用陰離子交