微生物生長繁殖與遺傳變異課件

第六章

微生物生長繁殖與遺傳變異

重點內(nèi)容提示：

·細菌等單細胞微生物的生長繁殖規(guī)律，在廢水處理等實際應(yīng)用中的指導(dǎo)意義。

·細菌等微生物遺傳變異的原理，利用微生物的變異性改變微生物菌種性能的途徑與方法?！?.微生物的生長繁殖及其特性幾個概念·生長：個體增大，細胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加；

·

繁殖：個體數(shù)量增多。

單細胞生物與多細胞生物生長與繁殖的差異？

單細胞——由于細胞分裂引起個體數(shù)目的增加；多細胞——通過無性或有性孢子使個體數(shù)目增加的過程?！わ@微鏡直接計數(shù)計數(shù)器計數(shù)比例計數(shù)法·間接法

平板菌落計數(shù)法（活菌計數(shù)法）

液體計數(shù)法（統(tǒng)計學(xué)原理）·

重量法細胞重量法：濕重與干重細胞含氮量DNA含量試比較各方法優(yōu)缺點，適用范圍？

·

微生物生長繁殖的測定方法

比濁法(懸浮細胞濃度)比例計數(shù)法已知霉菌孢子密度為8×108個/ml，根據(jù)顯微鏡視野中比例細菌密度為1×108個/ml優(yōu)點：測定過程快速；缺點：不能區(qū)分微生物的死活，且不太精確。不適用于絲狀菌體在計數(shù)區(qū)滴加菌液，蓋上特制蓋玻片，利用毛細作用讓菌液充滿計數(shù)區(qū)細菌計數(shù)區(qū)面積為1mm2，劃分為25個大方格，每個大方格又分為16個小格，計數(shù)區(qū)的深度為0.02mm。則每個大方格的體積是1/1250000ml，（1/25mm2×0.02mm）。計數(shù)時使用油鏡，一般數(shù)5個大方格的菌數(shù)后計算每個大方格的平均菌數(shù)。如圖所示，大方格中有14個細菌用每個大方格的平均菌數(shù)×1250000，即為每ml菌液含菌數(shù)。Peteroff-Hausser計菌器計數(shù)法優(yōu)點：直觀、快速、操作簡單；缺點：不能區(qū)分微生物的死活，不能計數(shù)運動強的活菌。不適用于絲狀菌體。

菌落形成單位（colony-formingunit，CFU）平板菌落計數(shù)法

優(yōu)點：活菌計數(shù)，不含死的微生物細胞；缺點：測定所需時間長，操作繁瑣，要求技術(shù)熟練。不適用于嚴格厭氧菌的培養(yǎng)。濾膜法優(yōu)點：活菌計數(shù)，不含死的微生物細胞；缺點：測定所需時間長，要求樣品中不含有過多的懸浮性固體。適用于微生物含量比較低的樣品測定。液體稀釋法（MPN法）以培養(yǎng)液培養(yǎng)，記錄長菌的管數(shù)總計：5－5－51ml1ml1ml√√√√√√√√√陽性：5－3－1最大可能數(shù)量表（mostprobablenumber，MPN）主要用于不能在平板培養(yǎng)基上形成菌落的微生物?！渭毎⑸锷L繁殖規(guī)律

·生長曲線（growthcurve）如何獲得？

根據(jù)測定生物量的方法不同，生長曲線分有：重量法、數(shù)量法、濃度法等。生長率上升階段生長率下降階段內(nèi)源呼吸階段時間細胞重量生長率上升階段：細胞適應(yīng)環(huán)境后快速生長繁殖的階段，增代時間最短。細胞重量迅速增加。生長率下降階段：指生長繁殖速率下降（減緩）的階段。內(nèi)源呼吸階段：利用細胞內(nèi)物質(zhì)維持生命，細胞重量減少。細胞代謝緩慢，趨向衰老死亡。

細胞數(shù)量法（緩慢、對數(shù)、穩(wěn)定和衰亡期）遲緩期衰亡期穩(wěn)定期對數(shù)期總菌數(shù)活菌數(shù)

對數(shù)生長期:所有細胞的生長繁殖速率以幾何級數(shù)（2n）的方式分裂，生長速率最快，世代時間G或倍增時間最短，細菌內(nèi)各成分按比例有規(guī)律地增加，細菌的代謝活性、酶活性高而穩(wěn)定，生活力強。關(guān)于G（世代時間）：

X2=X1·2n式中：n為繁殖代數(shù);

R為生長速率常數(shù)；影響因素：菌種特性營養(yǎng)成分營養(yǎng)物濃度培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)溫度的影響穩(wěn)定期：菌體產(chǎn)量達到最高點，新增長細胞數(shù)與死亡細胞量基本相等（R=0).由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境變化，逐步不適宜于細菌生長，導(dǎo)致生長速率降低直至零，結(jié)束對數(shù)生長期，進入穩(wěn)定生長期。

衰亡期：死細胞多于活細胞，內(nèi)源呼吸階段。營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細菌死亡速率逐步增加和活細菌逐步減少.·生長階段與污水生物處理指數(shù)期（生長率上升階段）

優(yōu)點：細菌代謝速度最快，凈化有機物的效率最高。缺點：菌體不易凝聚沉淀；凈化后有機物濃度不能達到排放標準；微生物污泥量大。

·穩(wěn)定期（生長率下降階段）

優(yōu)點：菌體沉降性能較好，處理有機物較為徹底。缺點：污泥量較大。

·衰亡期（內(nèi)源呼吸階段）優(yōu)點：有機物完全氧化，細胞沉降性能與出水水質(zhì)好，污泥量小。缺點；凈化效率慢，有機物質(zhì)濃度低。

·連續(xù)培養(yǎng)

·也稱開放培養(yǎng)（openculture）

·具體操作：細胞培養(yǎng)對數(shù)期后，以一定速率流入新鮮培養(yǎng)基，并利用溢流方式以同樣流速流出培養(yǎng)物。容器內(nèi)培養(yǎng)物達到動態(tài)平衡，微生物生長維持在某一對數(shù)生長期的生長速率?！?.微生物的遺傳變異

·遺傳變異概念與特性

正變：優(yōu)良性狀提高.如生產(chǎn)菌發(fā)酵周期縮短，產(chǎn)量提高；菌種降解物質(zhì)能力增強等。

負變：應(yīng)用功能下降.如生產(chǎn)菌發(fā)酵力退化，病原菌致病性增強，菌種降解物質(zhì)能力下降。變異株易發(fā)現(xiàn)：從形態(tài)、細胞結(jié)構(gòu)（芽孢、莢膜等）以及生理代謝特性等方面辨別與判斷。微生物遺傳保守程度：其大小由不同菌種決定。

·細菌等微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)

·遺傳物質(zhì)確定過程：1928年，英國細菌學(xué)家格里菲斯（Griffth）研究兩種肺炎雙球菌型的毒性。

1928年，Griffith進行了以下幾組實驗：（1）動物實驗

對小鼠注射活RII菌或死SIII菌————小鼠存活

對小鼠注射活SIII菌————————小鼠死亡

對小鼠注射活RII菌和熱死SIII菌———小鼠死亡

抽取心血 分離

活的SIII菌研究對象：Streptococcuspneumoniae（肺炎雙球菌）SIII型菌株：有莢膜，菌落表面光滑，有致病性

RII型菌株：無莢膜，菌落表面粗糙，無致病性（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（transformation）：F.GriffithGriffith

轉(zhuǎn)化試驗示意混合培養(yǎng)RII型活菌SIII型活菌SIII型熱死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死（2）細菌培養(yǎng)實驗（3）S型菌的無細胞抽提液試驗以上實驗說明：加熱殺死的SIII型細菌細胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進入RII型細胞并使RII型細胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)镾III型細胞。熱死SIII菌—————不生長

活RII菌—————長出RII菌

熱死SIII菌—————長出大量RII菌和10-6SIII菌活R菌+S菌無細胞抽提液——長出大量R菌和少量S菌+活RII菌平皿培養(yǎng)

1944年，O.T.Avery(埃弗里)等從熱死的S型肺炎雙球菌中提純了各種成分（DNA,蛋白質(zhì)，莢膜多糖等），并在離體條件下分別實驗。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)S型肺炎雙球菌的DNA具有使R型細胞產(chǎn)生毒性、小白鼠死亡的能力。

·DNA組成與構(gòu)成胸腺嘧啶thymine

核酸成分：堿基(嘧啶、嘌呤），戊糖，磷酸。胞嘧啶cytosine尿嘧啶uracil（存在于RNA中）鳥嘌呤guanine腺嘌呤Adenine

戊糖兩種戊糖:DNA所含的糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖為β-D-核糖。

糖與堿基構(gòu)成核苷(nucleoside)糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵。

磷酸與核苷構(gòu)成核苷酸核苷酸是核苷的磷酸酯。作為DNA或RNA結(jié)構(gòu)單元的核苷酸分別是5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷。

1953年，DNA的結(jié)構(gòu)通過x－射線觀察，確定是兩條走向相反的多核苷酸鏈構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。在這種結(jié)構(gòu)中，A-T、G-C之間以氫鍵等方式連接?！?/p>

微生物細胞中的核酸

·多數(shù)雙鏈DNA，少數(shù)單鏈DNA。少數(shù)病毒遺傳物質(zhì)為RNA。

·原核微生物除細胞核區(qū)外，在細胞質(zhì)中還存在攜帶少量基因的環(huán)狀DNA片段（質(zhì)粒）?！ふ婧宋⑸锏募毎耸荄NA與蛋白質(zhì)結(jié)合，存在于細胞核的染色體上。

核糖核酸（RNA）RNA分子量比DNA小，主要負責DNA遺傳信息的傳遞與翻譯表達等。

RNA為單鏈分子，根據(jù)RNA的功能，可以分為mRNA、tRNA和rRNA三種。mRNA(信使RNA)MessengerRNA

mRNA約占總RNA的5%，不同細胞mRNA鏈長和分子量差異大功能：將DNA的遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)合成基地–核糖核蛋白體上。

如DNA一條鏈上的堿基：ATGCGTTCCAC轉(zhuǎn)錄成mRNA的堿基：UACGCAAGGUG

遺傳密碼:mRNA分子上三個堿基（三聯(lián)密碼）決定一個氨基酸。tRNA(轉(zhuǎn)移RNA)

約占總RNA的10-15%。它在蛋白質(zhì)生物合成中識別氨基酸的密碼，并將相應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖核蛋白體上。

rRNA(核糖體RNA)

約占全部RNA的80%，是核糖核蛋白體的主要組成部分。rRNA的功能是與蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)?！せ蚺c性狀·基因：DNA分子上代表一個遺傳功能的片斷?！そY(jié)構(gòu)基因：決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的DNA片斷。·調(diào)節(jié)基因：控制結(jié)構(gòu)基因活動的DNA片斷?！げ倏v基因：與結(jié)構(gòu)基因一起，起“開關(guān)”作用。

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·性狀：表觀現(xiàn)象

·生物合成蛋白質(zhì)，以DNA為模板轉(zhuǎn)錄成mRNA，后tRNA根據(jù)mRNA三聯(lián)體密碼的信號將氨基酸進行運送，在核糖體上完成蛋白質(zhì)的合成。·微生物變異主要是由基因突變和基因重組造成的?；蛲蛔儼俗园l(fā)突變和誘發(fā)突變兩類?！ぷ园l(fā)突變:微生物自發(fā)突變頻率為10-4～10-6?！ふT發(fā)突變:用物理、化學(xué)因素使微生物遺傳信息改變，從而得到新的表觀現(xiàn)象?！こＳ玫恼T變劑：紫外線、x-射線等，亞硝酸、硫酸二乙酯、過氧化氫等化學(xué)試劑?！ぜ毦任⑸锏淖儺?/p>

·點突變

堿基置換（轉(zhuǎn)換、顛換）移碼突變DNA分子中缺失或增加少數(shù)幾個堿基對而引起造成突變點以后全部遺傳密碼轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)釋發(fā)生錯誤增添一個堿基ABCABCABCABCABCABCABCABCAB+ABCABCCBACBACBACBACBAABCBCABCABCABCABCABCABCA缺少一個堿基

基因重組（Generecombination）基因重組（或遺傳重組）：兩個不同性狀的個體（供體、受體）內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式。原核微生物的基因重組：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、原生質(zhì)體融合等。真核微生物的基因重組：有性雜交、準性雜交、轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合等。

幾個基本概念。轉(zhuǎn)化（Transformation）轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）。

接合（Conjugationbetweendifferentbacteria）。

原生質(zhì)體融合操作示意圖

去壁

[A+B-]

（高滲下）[A+B-]

PEG或電脈沖離心促融去壁

[A-B+]

（高滲下）[A-B+]

融合子（AA,BB,AB）長成菌落檢出[A+B+]融合子篩選優(yōu)良性狀的融合子影印接種[--]·基因工程及應(yīng)用什么是基因工程？例：固氮基因轉(zhuǎn)移到其他作物、蠶產(chǎn)絲蛋白基因引入細菌細胞；及人胰島素、動物生長激素基因工程菌等。環(huán)境工程中