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項(xiàng)目三絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備目前一頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)第1組第2組第3組第4組第5組第6組第7組第8組一、匯報(bào)交流方案目前二頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)二、討論確定方案SDS制備SHMTSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)是一種在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中加入SDS和巰基乙醇,以消除蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷和形狀對(duì)電泳遷移率影響的電泳技術(shù)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中待檢蛋白質(zhì)的遷移率主要依賴于其相對(duì)分子質(zhì)量,因此被廣泛用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。目前三頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)十二烷基硫酸鈉是一種陰離子去污劑,與蛋白質(zhì)結(jié)合可形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物,由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電,使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷,它的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原來(lái)的電荷量,因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。目前四頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中加入SDS和巰基乙醇,能掩蓋不同蛋白質(zhì)間的電荷差異,并引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化,從而導(dǎo)致變性后的蛋白質(zhì)分子在凝膠電泳中的遷移率取決于其相對(duì)分子質(zhì)量大小,而與其他因素(原有電荷、形狀)無(wú)關(guān)。通過(guò)這種電泳方式可將細(xì)胞中所有蛋白質(zhì)根據(jù)各自的相對(duì)分子質(zhì)量大小而分離開(kāi)來(lái)。目前五頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)電泳方向混合樣品電泳帶孔膠大分子小分子目前六頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)SHMT的電泳制備操作流程安裝電泳槽剝膠電泳上樣制膠染色目前七頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)三、關(guān)鍵操作試劑配制制膠剝膠目前八頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)四、方案實(shí)施清潔領(lǐng)取物料操作填寫(xiě)生產(chǎn)記錄清場(chǎng)與清潔目前九頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)SHMT的電泳制備安裝電泳槽剝膠電泳上樣制膠染色目前十頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)材料:大腸桿菌培養(yǎng)物懸液(含SHMT)器材:(1)夾心式垂直板電泳槽;(2)直流穩(wěn)壓電源(電泳儀);(3)培養(yǎng)皿及竹夾子;(4)長(zhǎng)針頭(8~10cm)及普通針頭;(5)注射器(10ml);(6)微量進(jìn)樣器(50μl);(7)細(xì)長(zhǎng)皮頭吸管;(8)移液管架;(9)棕色試劑瓶;(10)白色試劑瓶;(11)1ml、2ml、5ml吸量管;(12)卷紙1包;(13)大平皿,(14)移液槍(配20μl槍頭)。(一)材料與儀器目前十一頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)夾心垂直板電泳槽示意圖1:導(dǎo)線接頭2:下貯槽3:凹形橡膠框4:梳子5:固定螺絲6:上貯槽7:冷凝管凝膠模示意圖1:梳子2:長(zhǎng)玻璃板3:短玻璃板4:凹形橡膠框目前十二頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)目前十三頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)(二)試劑及配制(1)30%丙烯酰胺儲(chǔ)存液稱取丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺1g,加熱至37℃溶解,蒸餾水定容至100mL,裝于棕色瓶,4℃保存。(2)1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)緩沖液稱取Tris18.17g,加蒸餾水溶解,濃鹽酸調(diào)pH至8.8,定容至100mL。(3)1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)緩沖液稱取Tris12.12g,加蒸餾水溶解,濃鹽酸調(diào)pH至6.8,定容至100mL。目前十四頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)(4)10%SDS溶液稱取SDS10.0g,加蒸餾水,68℃助溶,定容至100mL。(5)10%過(guò)硫酸銨溶液稱取1.0g過(guò)硫酸銨,加水定容至10mL,4℃保存。(6)5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(pH8.3)稱取Tris15.1g、甘氨酸94g、SDS5g,加水定容至1L,室溫存放,使用時(shí)稀釋5倍使用。目前十五頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)(7)考馬斯亮藍(lán)R250染色液在45mL甲醇、45mL水和10mL冰乙酸的混合液中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250,用濾紙過(guò)濾染液以去除顆粒狀物質(zhì)。配制500mL。(8)脫色液75mL冰乙酸,50mL甲醇,875mL水,混勻即可。(9)2×SDS凝膠加樣緩沖液配5mL:取1mol/LTris-HCl(pH6.8)0.5mL,SDS0.2g,溴酚蘭10mg,甘油1mL,加水定容至5mL,與樣本混勻前加0.16gDTT。使用時(shí)與樣本l∶1(v/v)混勻。目前十六頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)(10)樣品處理大腸桿菌培養(yǎng)物懸液→離心(3000r/min,5min)→蒸餾水懸浮細(xì)胞→加2×SDS加樣緩沖液(1:1)→沸水加熱10min→離心(5000r/min,10min)→取上清液加樣。目前十七頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)(三)操作步驟(1)將長(zhǎng)、短玻璃板分別插到凹形橡膠框的凹形槽中。溫馨提示:注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。(2)在長(zhǎng)玻璃板下端與橡膠??蚪唤绲目p隙處加入已融化的1%瓊脂,封住空隙。溫馨提示:封底用的瓊脂應(yīng)用1×TBE溶解,凝固后的瓊脂中應(yīng)避免有氣泡。(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上,短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽。(4)將下貯槽的螺孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲釘?shù)纳腺A槽,旋緊螺絲帽,豎直電泳槽。溫馨提示:安裝電泳槽,雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽,以免緩沖液滲漏。1.電泳槽組裝目前十八頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)(三)操作步驟2.膠體的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍
凝膠濃度(%)線性分離范圍(kD)1512~431016~687.536~945.057~212目前十九頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)(1)分離膠的制備
SDS%分離膠配方
溶液成分不同體積(mL)凝膠液中各成分所需體積(mL)510152025304050蒸餾水1.63.34.96.68.29.913.216.530%丙烯酰胺溶液2.04.06.08.010.012.016.020.01.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02按表配制12%分離膠,混勻后迅速將配好的分離膠倒入凝膠模長(zhǎng)、短玻璃板間的間隙內(nèi),高度約8cm。然后沿長(zhǎng)玻璃板板壁緩慢注入少許蒸餾水,進(jìn)行水封。待凝膠完全聚合(約30min),傾去水封層的蒸餾水,并用濾紙條吸去殘余水分。溫馨提示:若凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線,則表示凝膠完全聚合。目前二十頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)(2)濃縮膠的制備
SDS%濃縮膠配方
按配制5%濃縮膠,混勻后迅速加到已聚合的分離膠上方(高度以插入梳子不溢出為宜),輕輕將梳子插入濃縮膠內(nèi),待凝膠完全聚合(約30min)后小心拔去梳子。溫馨提示:丙稀酰胺為神經(jīng)毒劑,使用時(shí)要小心,操作務(wù)必戴手套。過(guò)硫酸銨需新鮮配制,并注意濃度,否則影響膠凝固。殘余膠液可暫時(shí)留存,便于參考膠凝固時(shí)間。溶液成分不同體積(mL)凝膠液中各成分所需體積(mL)123456810蒸餾水0.681.42.12.73.44.15.56.830%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831.01.31.71.0mol/LTris(pH6.8)0.130.250.380.50.630.751.01.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%過(guò)硫酸銨0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01目前二十一頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)3.上樣
(1)將Tris-甘氨酸電泳緩沖液倒入上、下貯槽中,高度應(yīng)沒(méi)過(guò)短玻璃板約0.5cm。(2)用微量注射器吸取10~20μL樣品液加入上樣孔,加樣體積可根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握。溫馨提示:若樣品槽中有氣泡,可用注射器針頭挑除;加樣時(shí),微量注射器針頭應(yīng)盡量接近加樣槽底部,但針頭勿碰破凹形槽膠面。(三)操作步驟目前二十二頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)4.電泳連接電泳儀,打開(kāi)電源,按8V/cm確定所需電壓,待指示劑(溴酚藍(lán))進(jìn)入分離膠后將電壓提高到15V/cm,繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部(約3h),停止電泳,關(guān)閉電源。溫馨提示:正極應(yīng)接下槽。(三)操作步驟目前二十三頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)5.剝膠電泳結(jié)束后,取下凝膠模,卸下橡膠框,輕輕撬開(kāi)兩層玻璃,取出凝膠,切角作記號(hào)。溫馨提示:剝離凝膠應(yīng)戴手套,防止污染膠面。(三)操作步驟目前二十四頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)6.染色經(jīng)SDS分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍(lán)R250染色。(1)染色將凝膠浸泡在染色液中,在室溫下緩慢搖動(dòng)染色30min。(2)脫色回收染色液,凝膠先用蒸餾水漂洗一次,再浸入脫色液中,放在脫色搖床上于室溫平緩搖動(dòng)3~5h,其間更換脫色液3~4次,直至條帶清晰。(3)漂洗脫色后,用蒸餾水漂洗凝膠3~5次。(三)操作步驟目前二十五頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)五、結(jié)果展示與評(píng)價(jià)SDS-PAGE電泳示意圖1:對(duì)照2:樣品M:蛋白質(zhì)Marker12M目前二十六頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)1、SHMT2、電泳3、電泳技術(shù)4、PAGE5、SDS6、IFE六、總結(jié)與拓展目前二十七頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)1、SHMTSerinehydroxymethyltransferase絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶glyA目前二十八頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)2、電泳電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)。帶電粒子(帶電顆粒)在電場(chǎng)作用下,向著與其電性相反的電極移動(dòng),稱為電泳(electrophoresis)。目前二十九頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)3、電泳技術(shù)利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。利用電泳現(xiàn)象使物質(zhì)分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。不同物質(zhì)由于所帶電荷、分子大小和形狀不同,在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同。
目前三十頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)4、PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis
聚丙烯酰胺凝膠電泳
以聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)的電泳技術(shù)廣泛用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離、制備及定性、定量分析。目前三十一頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑的作用下聚合而成。丙烯酰胺單體和N,N'-甲叉雙丙烯酰胺單獨(dú)存在或混合存在時(shí)是穩(wěn)定的,當(dāng)遇到自由基時(shí),二者發(fā)生聚合反應(yīng)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有化學(xué)聚合和光聚合兩種。目前三十二頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)聚合方式催化劑加速劑聚合條件凝膠特點(diǎn)化學(xué)聚合過(guò)硫酸銨(AP)N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺(TEMED)堿性環(huán)境膠孔徑較小,多用于制備分離膠光聚合核黃素(VB2)無(wú)光膠孔徑較大,不穩(wěn)定多用于制備濃縮膠目前三十三頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)
①在一定濃度時(shí),膠體透明,有彈性,機(jī)械性能好。②化學(xué)性能穩(wěn)定,與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。③對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。④幾乎無(wú)電滲作用,只要丙烯酰胺單體純度高,操作條件一致,則樣品分離重復(fù)性好。⑤樣品不易擴(kuò)散,且用量少,其靈敏度可達(dá)10-6g。⑥凝膠孔徑可調(diào)節(jié),根據(jù)被分離物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量,改變單體及交聯(lián)劑的濃度可調(diào)節(jié)凝膠的孔徑。⑦分辨率高,尤其在不連續(xù)凝膠電泳中,集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體,因而有更高的分辨率。
目前三十四頁(yè)\總數(shù)三十九頁(yè)\編于十點(diǎn)凝膠濃度和交聯(lián)度是影響聚丙烯酰胺凝膠性能的主要因素。通常用100mL凝膠溶液中含有Acr及Bis的總克數(shù)表示凝膠濃度(T%)。交聯(lián)度(C%)是指交聯(lián)劑Bis占單體Acr與Bis總量的百分?jǐn)?shù)。一般分離蛋白質(zhì)和核酸的聚丙烯酰胺凝膠標(biāo)準(zhǔn)濃度分別為7.5%和2.
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