辣根過氧化物酶標(biāo)記

辣根過氧化物酶標(biāo)記辣根過氧化物酶標(biāo)記第1頁2試驗(yàn)原理（1）免疫標(biāo)識技術(shù)免疫標(biāo)識技術(shù)是將一些既易測定又含有高度敏感性物質(zhì)標(biāo)識到特異性抗原或抗體分子上，經(jīng)過這些標(biāo)識物增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體性質(zhì)與含量。常見標(biāo)識物包含熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標(biāo)識物進(jìn)行標(biāo)識免疫檢測技術(shù)被稱為3大免疫標(biāo)識技術(shù)。當(dāng)前，使用免疫標(biāo)識物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。辣根過氧化物酶標(biāo)記第2頁（2）辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)識抗體原理a.辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP）

HRP廣泛分布于植物界，它是由無色酶蛋白和棕色鐵卟啉結(jié)合而成糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為pH3～9，酶催化最適PH因供氫體不一樣而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下硫酸銨溶液。HRP輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，普通以O(shè)D403nm／OD275nm比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶純度。

HRP催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色還原型染料，經(jīng)過反應(yīng)可生成有色氧化型染料(D)。

HRPDH2＋H2O2────→D＋2H2O辣根過氧化物酶標(biāo)記第3頁4b.辣根過氧化物酶標(biāo)識方法酶標(biāo)識抗體制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。辣根過氧化物酶標(biāo)識常見過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適合用于含糖量較高酶。過碘酸鈉將HRP分子表面多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可深入用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定酶標(biāo)識抗體。辣根過氧化物酶標(biāo)記第4頁5

在酶標(biāo)過程中普通都混有未結(jié)合酶和抗體。游離酶理論上不影響最終顯色。但游離抗體則不一樣，它會與酶標(biāo)抗體競爭固相抗原，從而降低了結(jié)合到固相上酶標(biāo)抗體量。所以需要對制備酶結(jié)合物進(jìn)行純化，去除游離酶和抗體。純化方法很多，硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果并不理想。用離子交換層析、分子篩法可得到最正確分離效果，但費(fèi)用較貴。

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四操作步驟

（1）稱取5mgHRP溶解于0.5ml蒸餾水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配0.1MNaIO４溶液，混勻，4℃靜置30分鐘。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混勻，靜置30分鐘。（4）加入含5mg抗體水溶液1ml，混勻裝入透析袋，pH9.5碳酸鹽緩沖液透析，4℃過夜。

辣根過氧化物酶標(biāo)記第6頁7（5）加0.2mL新配5mg/mLNaBH４液，混勻，再置4℃,2h。（6）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1h。（7）3000r/min離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最終沉淀物溶于少許0.15moL/LpH7.4PBS中。（8）將上述溶液裝入透析袋中，對0.15moL/LpH7.4PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保留。辣根過氧化物酶標(biāo)記第7頁8酶制劑及其底物凡無毒性又能展現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)酶，標(biāo)準(zhǔn)上均可作為標(biāo)識用。但作為標(biāo)識抗體用酶應(yīng)滿足以下要求：(1)起源方便，易于純化；(2)比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定；(3)酶活性和量能用簡單方法測定。當(dāng)前在免疫酶技術(shù)中常見酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。辣根過氧化物酶標(biāo)記第8頁9因?yàn)槔备^氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常見。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色酶蛋白和棕色鐵卟啉結(jié)合而成糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化最適PH因供氫體不一樣而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下飽和度硫酸銨溶液。HRP輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm／OD275nm比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶純度。高純度酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達(dá)3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。辣根過氧化物酶標(biāo)記第9頁10HRP催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色還原型染料，經(jīng)過反應(yīng)可生成有色氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)過程以下:

HRP

DH2＋H2O2────→D＋2H2O供氫體種類很多，形成產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3－二氨基聯(lián)苯胺)反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已極少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且因?yàn)楫a(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時間內(nèi)進(jìn)行測定。當(dāng)前用得較廣泛和較滿意供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。辣根過氧化物酶標(biāo)記第10頁11另外，還有一個供氫體稱ABTS[2,2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選供氫體。因?yàn)镠RP底物H2O2本身又是酶抑制劑，所以酶促反應(yīng)中使用H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰（說明H２O２已消耗殆盡）。這么即使再延長時間也不會增加反應(yīng)產(chǎn)物顏色。辣根過氧化物酶標(biāo)記第11頁12HRP標(biāo)識抗體方法酶與抗體交聯(lián)方法有許各種,依據(jù)酶結(jié)構(gòu)不一樣可采取不一樣方法。對于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常見。辣根過氧化物酶標(biāo)記第12頁13戊二醛二步法1.原理：戊二醛為一個雙功效試劑，經(jīng)過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上氨基共價結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。辣根過氧化物酶標(biāo)記第13頁142.標(biāo)識步驟：(1)稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。

(2)反應(yīng)后酶溶液經(jīng)SephadexG-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，搜集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，遲緩攪拌。

(3)將待標(biāo)識抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

(4)用1MPH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時。辣根過氧化物酶標(biāo)記第14頁15(5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。

(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。(7)

3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最終沉淀物溶于少許0.15MPH7.4PBS中。

(8)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15MPH7.4PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。辣根過氧化物酶標(biāo)記第15頁16

3.結(jié)果判定：(1)定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標(biāo)識抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫電泳試驗(yàn)。然后用酶底物使沉淀弧顯色，可初步判定其活性。最終以直接ELISA法(或在正式試驗(yàn)系統(tǒng)里)對酶結(jié)合物進(jìn)行滴定(見本節(jié)(三)工作濃度選擇)。辣根過氧化物酶標(biāo)記第16頁17

(2)定量和克分子比值測定：

(2)定量和克分子比值測定：可用分光光度計(jì)測定(光程1cm)。酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4

IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg／ml)

IgG量(mg／ml)酶量克分子比值＝────────÷───────＝───×4

40,000

160,000

IgG量辣根過氧化物酶標(biāo)記第17頁18注意事項(xiàng)（1）為提升標(biāo)識效率，應(yīng)嚴(yán)格掌握整個反應(yīng)體系中9抗體含量。（2）碘酸鈉要新鮮配制。（3.）室溫?cái)嚢钑r須避光，室內(nèi)溫度普通在25℃為宜。標(biāo)識物每次透析前，須認(rèn)真檢驗(yàn)，預(yù)防漏液辣根過氧化物酶標(biāo)記第18頁19注意事項(xiàng)

（4）在具備高質(zhì)量HRP條件下，所要標(biāo)識抗體也要活性高,效價高(最低1∶16),純度高，親和力好，這是確保標(biāo)識物效價高，免疫活性好首要條件。