酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第1頁

試驗(yàn)過程中影響原因終止與讀數(shù)結(jié)果判讀試劑加樣溫育樣本洗板顯色酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第2頁

一、標(biāo)本

排泄物血清唾液尿液、糞便分泌物體液酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第3頁血清標(biāo)本脂血標(biāo)本溶血標(biāo)本標(biāo)本保留標(biāo)本離心采血試管酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第4頁

采血試管

1.使用非抗凝標(biāo)本（血清）；肝素抗凝血漿會增加OD值;EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA檢測系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性;2.最好使用一次性玻璃試管或真空采血管.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第5頁

標(biāo)本采集后，應(yīng)先將標(biāo)本37°放置30-60分鐘后采取3000r/min離心15-20分鐘，取上清液加樣。15min3000r/min標(biāo)本離心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第6頁

標(biāo)本離心

強(qiáng)行離心分離血清，會使血清中仍殘留個別纖維蛋白原，在ELISA測定過程中能夠形成肉眼可見纖維蛋白塊或附著在酶標(biāo)板孔壁內(nèi)使酶標(biāo)識物不易洗掉，易造成假陽（陰）性結(jié)果。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第7頁

標(biāo)本保留

1.一周----2～4℃保留；2.超出一周----提議-20℃保留。3.冰凍血清融解后，蛋白質(zhì)會出現(xiàn)局部濃縮而分布不均，加樣前應(yīng)充分混勻。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第8頁

標(biāo)本保留

4.混濁或有沉淀血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。5.作屢次檢測，宜少許分裝冰存;6.血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測盡可能防止細(xì)菌污染。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第9頁

防止細(xì)菌污染A.如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP會產(chǎn)生假陽性；

B.細(xì)菌生長，其所分泌一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用（如明膠酶等蛋白水解酶）；

C.一些細(xì)菌內(nèi)源性酶如大腸桿菌β-半乳糖苷酶本身會對用對應(yīng)酶作標(biāo)識測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第10頁

溶血標(biāo)本

1.ELISA以辣根過氧化物酶標(biāo)識抗原或抗體；2.紅細(xì)胞破壞后可釋放出大量含有過氧化物酶活性血紅蛋白；3.殘留過氧化物酶催化底物產(chǎn)生非特性顯色造成結(jié)果假陽性。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第11頁

脂血標(biāo)本

1.脂質(zhì)小粒粘附在反應(yīng)孔內(nèi)壁；2.非離子型洗滌劑極難洗掉反應(yīng)板上干擾性物質(zhì)非特異性吸附，引發(fā)吸光度A值升高，易造成假陽性結(jié)果。

餐后抽血、高甘油三脂血癥患者、標(biāo)本離心時(shí)間、離心速度不適當(dāng)?shù)?，都可使分離血清標(biāo)本中殘留著大量脂質(zhì)小粒。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第12頁

二、試劑1.試劑盒保留于2-8℃2.使用前應(yīng)先將檢測試劑盒放置室溫平衡15-30分鐘，確保酶等液體初始反應(yīng)溫度及活性劑溶解。3.觀察外包裝和內(nèi)組份有沒有漏液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第13頁三、加樣仔細(xì)注意加樣全部過程移液器使用及時(shí)放入孵育箱標(biāo)本較多時(shí)，請分批操作試劑滴加酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第14頁

加樣過程應(yīng)注意：

A.加樣不可太快；B.要防止加在孔壁上部；C.不可濺出；D.防止產(chǎn)生氣泡；E.盡可能使用同一加樣器，裝緊槍頭，加樣后充分混勻。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第15頁

試劑滴加

從滴瓶中滴加，應(yīng)注意滴加角度和速度。滴加太快，很輕易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間現(xiàn)象，這么就會在孔內(nèi)非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引發(fā)非特異顯色。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第16頁酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第17頁移液器使用移液方法及注意事項(xiàng)槍頭裝配量程調(diào)整酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第18頁量程調(diào)整

1.從大致積調(diào)為小體積2.從小體積調(diào)為大致積在該過程中，千萬不要將按鈕旋出量程，不然會卡住內(nèi)部機(jī)械裝置而損壞了移液槍酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第19頁

槍頭（吸液嘴）裝配

使勁地在槍頭盒子上敲幾下——錯誤

將移液槍（器）垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動即可使其緊密結(jié)合——正確槍頭卡緊標(biāo)志是略為超出O型環(huán)，并能夠看到連接個別形成清楚密封圈。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第20頁移液方法前進(jìn)移液法反向移液法

普通用于轉(zhuǎn)移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量液體，其原理就是先吸入多于設(shè)置量程液體，轉(zhuǎn)移液體時(shí)候不用吹出殘余液體。重復(fù)操作移液法

適合用于快速、簡便地重復(fù)轉(zhuǎn)移等量同種液體。全血移液法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第21頁

移液注意事項(xiàng)

1.吸收液體時(shí)，移液器保持豎直狀態(tài)，將槍頭插入液面下1厘米。

注意吸液體時(shí)，一定要遲緩平穩(wěn)松開拇指，絕不允許突然松開，以防將溶液吸入過快而沖入移液器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第22頁

移液注意事項(xiàng)

2.設(shè)定加樣體積，不能大于加樣槍標(biāo)定移液范圍

3.加樣吸嘴潔凈和裝配

4.吸收液體和排出液體動作都一定要慢。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第23頁

移液注意事項(xiàng)

5.加樣槍禁止吸收有強(qiáng)揮發(fā)性、強(qiáng)腐蝕性液體（如濃酸、濃堿、有機(jī)物等）

6.不要用大量程加樣槍移取小體積液體，以免影響準(zhǔn)確度。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第24頁

移液注意事項(xiàng)

7.如不使用，要把移液槍量程調(diào)至最大值刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護(hù)彈簧，并將其豎直掛在移液槍架上。8.表面清潔：用10%次氯酸鈉溶液或70%酒精溶液清潔后，自然晾干。

9.微量加樣槍必須按要求定時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第25頁四、溫育

1.抗原抗體反應(yīng)必須在一定溫度條件下反應(yīng)一定時(shí)間。2.溫育所需時(shí)間與溫度成反比。3.最為常見溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第26頁

實(shí)際操作中應(yīng)注意：

溫育溫度選擇足夠反應(yīng)時(shí)間“邊緣效應(yīng)”排除酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第27頁

溫育溫度選擇

1.微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定時(shí)間；2.在臨床試驗(yàn)室中，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計(jì)時(shí)，這么就很輕易造成實(shí)際測定中溫育時(shí)間不夠，弱陽性樣本測不出來問題。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第28頁

“邊緣效應(yīng)”排除1.“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深;2.有研究證實(shí)在溫育中熱力學(xué)梯度可能是根本原因。3.聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，板從室（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第29頁

總而言之，在臨床ELISA測定中，要確保好測定效果，應(yīng)盡可能采取水浴。

溫育中讓微孔板浮于水面上（浸入1/3），或?qū)⒔杆巢挤湃胍淮箫埡兄行纬蓾窈?，然后放于溫箱中，這么可使微孔板板孔底部直接與37℃水或濕布接觸，而且水浴箱或濕盒內(nèi)溫度較高，可使反應(yīng)溶液溫度快速與溫室平衡。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第30頁

五、洗板

血清中殘留纖維蛋白絲或洗滌液析出結(jié)晶易使洗板機(jī)針孔全阻塞或半阻塞，造成未結(jié)合標(biāo)識酶洗脫不徹底，造成“花板”造成假陽性或假陰性。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第31頁酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第32頁

洗板注意事項(xiàng)1.要有適當(dāng)浸泡時(shí)間（30-60秒）。2.洗板機(jī)吸液要徹底，殘余量低于5ul。3.洗液應(yīng)調(diào)至適當(dāng)注出量，每孔應(yīng)在350ul-450ul之間，但不要溢出孔外。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第33頁4.洗板次數(shù)應(yīng)與說明書要求一致，盡可能不要私自增加或降低洗板次數(shù)。5.稀釋洗液應(yīng)使用蒸餾水或去離子水，pH值不宜過酸或過堿，確保配出洗液pH值為7.4±0.2，水質(zhì)宜新鮮，長菌或有沉淀不宜使用，且用非金屬容器保留。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第34頁6.因?yàn)橄礈煲合蹈邼舛攘姿猁}，會形成結(jié)晶，配制洗液時(shí)應(yīng)完全溶解。7.稀釋好洗液4℃下可保留3—5天。8.洗板后，拍干包被板，應(yīng)垂直扣在備好潔凈吸水紙或毛巾上，且每次拍板應(yīng)換掉前次拍過毛巾或吸水紙，防止交叉污染。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第35頁9.操作洗板機(jī)過程中要不時(shí)觀察洗板

機(jī)針孔內(nèi)洗液通暢情況，及時(shí)糾

正，洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清

洗幾遍后關(guān)機(jī)。10.每七天要進(jìn)行保養(yǎng)清洗。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第36頁

六、顯色

注意事項(xiàng)：1.檢驗(yàn)底物溶液有效性；2.試劑顯色時(shí)先加A液，后加B液，二者不要顛倒。3.前后加入間隔時(shí)間不超出10分鐘。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第37頁4.若把A液和B液先混合，再加樣顯色，需要求二者等體積混合。5.A、B液應(yīng)防止接觸污染物。6.不一樣廠家顯色液不得混用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第38頁

七、終止和讀數(shù)

肉眼判斷結(jié)果時(shí)，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果準(zhǔn)確性，必須使用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果，以確保結(jié)果一致性。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第39頁

注意事項(xiàng)1、酶標(biāo)儀波長是否適當(dāng)或?yàn)V光片是否正確。2、單波長或雙波長比色選擇問題。

ELISA測定比色時(shí)，最好是使用雙波長比色

3、加完終止液后30分鐘內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。4、確保酶標(biāo)板底部是清潔干燥。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第40頁雙波長比色？

雙波長比色測定能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度影響，普通無須設(shè)空白孔。

ELISA測定中單個空白孔非特異吸收上有一定程度不確定性；在ELISA測定比色時(shí)，最好是使用雙波長比色。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第41頁八、結(jié)果判讀灰區(qū)定義

灰區(qū)又稱灰色帶反應(yīng)。就是把OD值在Cutoff值正負(fù)20%這個范圍內(nèi)標(biāo)本稱為灰區(qū)標(biāo)本。這個范圍稱為灰區(qū)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第42頁

灰區(qū)處理1.灰區(qū)是客觀存在，沒有不存在灰區(qū)試劑，咱們只是盡可能降低灰區(qū)出現(xiàn)百分比。2.降低灰區(qū)最有效方法就是盡可能將板洗滌潔凈。3.嚴(yán)格控制溫育時(shí)間。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素第43頁其它影響

1.干擾物質(zhì)影響常見干擾物質(zhì)如類風(fēng)濕因子、

甲胎蛋白、一些本身抗體等，都會使結(jié)果造成假陽性。2.藥品影響如高效價(jià)乙肝免疫球蛋白等。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的影響因素