基因工程操作步驟

基因工程操作步驟目前一頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)知識(shí)回顧：基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用

載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。

才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。目前二頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)一、目的基因的獲取1目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的基因：如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因、具調(diào)控作用的因子等。2獲取目的基因的常用方法：1、從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成目前三頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn):基因結(jié)構(gòu)目前四頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子)。與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)目前五頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.基因文庫(kù)的概念:將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。2.基因文庫(kù)的種類(lèi):基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)目前六頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)cDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入cDNA文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA目前七頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)真核細(xì)胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動(dòng)子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子目前八頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以目前九頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)③怎樣從基因文庫(kù)中找到我們所需要的目的基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因。目前十頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。2原理：DNA復(fù)制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列目前十一頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)PCR技術(shù)的操作過(guò)程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一目前十二頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G變性復(fù)性延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ目前十三頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)③過(guò)程：目前十四頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)PCR技術(shù)的操作過(guò)程PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴(kuò)增目前十五頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋變復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再?gòu)?fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶、DNA連接酶等目前十六頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)PCR技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈目前十七頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)3.人工合成法

在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子嗎？目前十八頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)人工合成法（真核生物）反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推測(cè)推測(cè)單鏈DNA合成目前十九頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)課堂小結(jié)目的基因的獲取1、從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成種類(lèi)基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)目前二十頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因目前二十一頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過(guò)程:目前二十二頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。表達(dá)載體過(guò)程:目前二十三頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心

1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。目前二十四頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)2、基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因它們各自的作用是什么?目前二十五頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)目前二十六頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)3.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點(diǎn)位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞目前二十七頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。2常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。3目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。目前二十八頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。目前二十九頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)③過(guò)程：目前三十頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞①操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。②

鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：?jiǎn)巫尤~植物目前三十一頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞②

特點(diǎn):十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉目前三十二頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法①程序目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物目前三十三頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞④過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)

細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合目前三十四頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目前三十五頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過(guò)程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)目前三十六頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)1、鑒定——分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)變性變性目前三十七頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)1、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N目前三十八頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)1、鑒定——分子水平的鑒定提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)目前三十九頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于八點(diǎn)2、鑒定——個(gè)體水平的鑒定抗蟲(chóng)、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入