實驗大腸桿菌的培養(yǎng)和分離emma

菌落：由單個細菌（或其他微生物）在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度；形成肉眼可見有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)等特征的子細胞的群落。

不同微生物形成的菌落具有不同的特征（形態(tài)、突起、邊緣），是鑒定菌種的重要依據(jù)。酵母菌放線菌霉菌大腸桿菌目前一頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點大腸桿菌（E.coli）分布：人和哺乳動物腸道，此外還廣泛分布于水、污水、土壤、谷類、乳制品等當(dāng)中。大腸桿菌在人體的_____中一般對人體無害，但任何大腸桿菌如果進入__________都會對人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌是_______工程中被廣泛采用的工具。腸道泌尿系統(tǒng)基因革蘭氏______（填陰或陽）性菌陰代謝類型：異養(yǎng)，兼性厭氧型生長適宜溫度：質(zhì)粒、EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA連接酶、受體細胞37℃左右目前二頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點實驗一大腸桿菌的培養(yǎng)和分離1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作2.進行大腸桿菌的分離,用固體平板培養(yǎng)基進行細菌的劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理實驗?zāi)康腖B液體（固體）培養(yǎng)基目前三頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點一、配制培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。水、碳源、氮源、無機鹽、生長因子(生長因子即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)1、成分區(qū)別于動物培養(yǎng)與植物培養(yǎng)：不加激素固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的區(qū)別：瓊脂成分作用主要來源碳源主要作能源物質(zhì)無機碳(CO2)或有機碳(糖類)氮源合成含N類化合物N2，NH3，銨，硝酸鹽尿素，牛肉膏，蛋白胨無機鹽調(diào)節(jié)滲透壓等水生長因子調(diào)節(jié)促生長維生素，AA，堿基等如NaCl目前四頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點一、配制培養(yǎng)基不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方實例：“細菌喜葷，霉菌喜素”

細菌培養(yǎng)基要用蛋白胨和酵母提取物來配制，還要加入一定的氯化鈉，以維持一定的滲透壓；霉菌培養(yǎng)基一般用無機物配制或添加蔗糖的豆芽汁調(diào)節(jié)pH真菌：5～6細菌：6.5～7.5溶解計算稱量調(diào)pH分裝加塞，包扎滅菌2、過程勿沾到瓶口或者壁上，易污染，則作廢目前五頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點二、包器材封口膜通空氣不通細菌牛皮紙或報紙加蓋后幾個包在一起接種環(huán)包牛皮紙P20①分裝：注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，因此在將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到三角瓶或試管中時必須用__________。②加塞：試管用塑料蓋或________；三角瓶口用_______或_________封口,再用_________或報紙封口。③包扎：用________或報紙三角漏斗棉花塞封口膜6層紗布牛皮紙牛皮紙250ml裝50ml目前六頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點三、滅菌定義：以化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物（包括芽孢(休眠體)和孢子（真菌、放線菌生殖細胞））方法1：高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15min（培養(yǎng)基、無菌水、玻璃器皿等滅菌。P20），滅菌前排出鍋內(nèi)冷空氣，因為空氣膨脹壓大于水蒸氣膨脹壓，達不到水蒸氣的溫度。滅菌鍋壓力與大氣壓相同時打開鍋蓋滅菌后，通常將實驗用具放進60～80℃的烘箱中烘干，除去滅菌時的水分，防止污染(P20)方法2：干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。玻璃器皿等耐熱器具惡劣環(huán)境下目前七頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點四、超凈臺操作

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止________污染（培養(yǎng)基和操作者）的方法。雜菌1、紫外消毒（針對空氣）：實驗用具放在超凈臺上，打開超凈臺的紫外燈和過濾風(fēng)（人離開）30min左右，培養(yǎng)基冷卻至60℃，關(guān)閉紫外。2、酒精消毒：用鑷子取出酒精棉擦拭超凈臺桌面，并擦拭雙手。3、開始實驗_________必須無菌（滅菌）_________也必須要無菌（滅菌）_________時不帶入雜菌（滅菌、消毒各種器具培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移菌種滅菌與消毒的區(qū)別目前八頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點滅菌與消毒的區(qū)別消毒：使用較溫和理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對人體有害的微生物的過程。不能殺死芽孢和孢子。（對被消毒物體基本無害）滅菌：使用強烈的理化因素消滅物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢和孢子。（細菌蛋白質(zhì)變性達到滅菌目的）例題：請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。無菌操作消毒滅菌①高壓蒸汽滅菌②干熱滅菌③灼燒滅菌①紫外線消毒法（使蛋白質(zhì)變性，還能損傷②化學(xué)藥劑消毒法（酒精）③煮沸消毒法400~500℃70%DNA結(jié)構(gòu)④巴氏消毒法目前九頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點四、超凈臺操作倒平板制斜面：冰箱4℃保存單菌落在酒精燈火焰旁，以右手無名指及小指夾持封口膜，右手其他三個手指拿著三角瓶；左手拿著培養(yǎng)皿，并打開上蓋的一邊，將三角瓶中培養(yǎng)基（10~20ml）倒在培養(yǎng)皿里，將其放于水平位置，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿底部，凝固形成平面。倒置放置既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多,不容易進入雜菌，同時能用來做純細菌的長期保存。目前十頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點思考題：A、操作過程中避免帶入雜菌的方法有哪些？1、滅菌后的培養(yǎng)基、器具置于超凈臺上，并打開超凈臺的紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌30分鐘。2、用鑷子夾出灑精棉球擦拭桌面和實驗者雙手。3、整個操作在酒精燈火焰旁進行4、打開后或加塞前試管口、三角瓶口灼燒滅菌。B、培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60后才倒平板，你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度呢？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。目前十一頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點思考題C、在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。D、如何檢查培養(yǎng)基是否受雜菌的污染？將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)，若無菌落產(chǎn)生則未受雜菌污染。目前十二頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點四、超凈臺操作接種擴大培養(yǎng)從大腸桿菌斜面→錐形瓶中的液體培養(yǎng)基接種好后在37度搖床振蕩培養(yǎng)12h注意事項:1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.目前十三頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點四、超凈臺操作劃線分離法原理：通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。由于劃線過程中接種環(huán)上的菌液逐漸減少，因此最后部分的細菌間距加大。獲得單菌落首尾注意事項:1.接種環(huán)灼燒滅菌后要冷卻，避免溫度高殺死菌種1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次,不能劃破培養(yǎng)基.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)37℃，12~24h目前十四頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點第一區(qū)域第二區(qū)域第三區(qū)域第四區(qū)域第五區(qū)域注意1:不能出現(xiàn)線條的重疊注意2:第二次或隨后幾次的操作總是從上一次劃線的末端開始注意3:最后一個區(qū)域不能與第一個區(qū)域相連目前十五頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點

平板劃線接種灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第一區(qū)域）蘸取菌液灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第二區(qū)域）灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第三區(qū)域）灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第四區(qū)域）灼燒接種環(huán)冷卻劃線（第五區(qū)域）灼燒接種環(huán)平板倒置放置培養(yǎng)目前十六頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點第一次灼燒每次劃線之前灼燒劃線結(jié)束灼燒目的避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上的殘留菌種殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境或感染操作者在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。單菌落分離的標志？劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落為什么要倒置培養(yǎng)？既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成細菌隨水?dāng)U散污染，難以分成單菌落，達不到分離的目的目前十七頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點1、系列稀釋操作四、超凈臺操作涂布分離法2、涂布平板操作玻璃刮刀目前十八頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點細菌的分離方法劃線分離法和涂布分離法。

種類:作用:單菌落的分離是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一。

劃線分離法，簡單方便；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些目前十九頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點單菌落培養(yǎng)試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多,不容易進入雜菌，同時能用來做純細菌的長期保存。在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37℃培養(yǎng)24h后，置于4℃冰箱中保存目前二十頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點分析與討論:1、如何操作才可以盡量避免被雜菌污染？（1）膽大心細，操作快捷（2）注意滅菌操作原則，滅菌要徹底，盡量降低環(huán)境污染幾率，手和實驗服要保持清潔，合理地減少操作時間，對污染源的改善要考慮周到（3）注意微生物的生長條件，如pH、滲透壓、溫度等。細菌喜中性偏堿性環(huán)境，喜蛋白質(zhì)豐富的物質(zhì)營養(yǎng)，喜37℃的溫度；而霉菌喜中性偏酸性環(huán)境，喜糖類豐富的物質(zhì)營養(yǎng)，喜25-30℃的溫度。不僅考慮培養(yǎng)基成分，也要考慮理化性質(zhì)：pH、滲透壓、溫度、氧氣等目前二十一頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點分析與討論:2、在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染？（1）從菌落的形態(tài)看，是否濕潤、透明、黏稠，呈何種顏色等，是區(qū)別細菌、酵母菌、放線菌和霉菌的關(guān)鍵指標（2）用顯微鏡鏡檢觀察其形態(tài)、大小，看是否有菌絲、孢子、芽孢等，這也是區(qū)別細菌、酵母菌、放線菌和霉菌的關(guān)鍵指標（3）上述方法較難區(qū)分同類的不同菌種，這時就需要借助化學(xué)方法和進一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法，觀察孢子形態(tài)、孢子著生方式、菌絲生長方式、有無鞭毛、芽孢、毒素及特異生理生化性質(zhì)等目前二十二頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點分析與討論:3、實驗完成后，接觸過細菌的器皿應(yīng)如何處理？完成實驗后，所有接觸過細菌的器皿都必須先經(jīng)過高壓滅菌后再洗滌，特別是培養(yǎng)基有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體會影響人畜健康，也會污染環(huán)境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要經(jīng)過高壓滅菌后再丟棄。對于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌30min，再永清水洗凈，仍可再用。封口膜也可重復(fù)使用。目前二十三頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點分析與討論:4、如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌，如何保證不被普通的大腸桿菌所污染？轉(zhuǎn)基因用的質(zhì)粒，不是細菌中原有的質(zhì)粒，而是通過改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，如抗氨芐青霉素基因。轉(zhuǎn)基因載體（質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌后，能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長，而未被轉(zhuǎn)化的就不能生長，其它沒有抗氨芐青霉素基因的雜菌也不能生長，這種設(shè)計保證了轉(zhuǎn)基因工程菌的純潔性。在獲得轉(zhuǎn)基因工程菌后，如果為了選擇高表達量菌株等進行分離，也可使用含抗生素的培養(yǎng)基，這就保證了轉(zhuǎn)基因工程菌不被普通（無抗性基因）的大腸桿菌所污染。目前二十四頁\總數(shù)二十六頁\編于十八點請回答下列酵母菌有關(guān)的問題：

（1）從生態(tài)系統(tǒng)的成分上看，酵母菌屬于

，它的同化作用類型是

。（2）培養(yǎng)酵母菌時，為防止雜菌污染需要對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行

。（3）酵母菌菌種A能耐高溫，但產(chǎn)酒精率較低，而菌種B不耐高溫，產(chǎn)酒精率卻較高。利用細胞工程課獲得耐高溫、產(chǎn)酒精率高的融合子酵母菌（目的菌種），利用A、B兩菌種對某一藥物抗藥性的差異，可對融合子進行篩選。實驗中，應(yīng)將含有融合子的培養(yǎng)液利用

方法接種到含有相關(guān)藥物的基本培養(yǎng)基上。下表為A、B兩菌種在幾種藥物的作用下，生長狀況的實驗結(jié)果。由于A種不能獨立在基本培養(yǎng)基上生長，所以，據(jù)表可以判斷，加入

（藥物），可以篩選出融合子。 注：“+”可以良好生長，“一”不能生長。多菌靈三唑酮霜霉狂殺放線菌酮菌種A+