HE染色概念及定義

He染色介紹蘇木精一伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining)，簡稱HE染色法，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍色 ；伊紅為酸性染料，主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著紅色。染色分類易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)稱為嗜堿性(basophilia)和嗜酸性(acidophilia)。組織內(nèi)的蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的種類很多，它們有不同的等電點。在普通染色法中，染色液的酸堿度為口能左右，細胞內(nèi)的酸性物質(zhì)如細胞核的染色質(zhì)、腺細胞和神經(jīng)細胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及透明軟骨基質(zhì)等均被堿性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜堿性。而細胞質(zhì)中的其它蛋白質(zhì)如紅細胞中的血紅蛋白、嗜酸粒細胞的顆粒及膠原纖維和肌纖維等被酸性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜酸型。如果改變?nèi)旧旱乃釅A度，pH值升高時，則原來被酸性染料染色的物質(zhì)可變?yōu)槭葔A性；pH值降低時，原來被堿性染料染色的物質(zhì)則可變?yōu)槭人嵝浴Ｋ哉f染色液的pH值可以影響染色的反應(yīng)。去氧核糖核酸(DNA)兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中稱藍色，所以細胞核被染成藍色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽離子結(jié)合使胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明對比。伊紅是細胞漿的良好染料。由于組織或細胞的不同成分對蘇木精的親和力不同及染色性質(zhì)不一樣。經(jīng)蘇木精染色后，細胞核及鈣鹽粘液等呈藍色，可用鹽酸酒精分化和弱堿性溶液顯藍，如處理適宜，可使細胞核著清楚的深藍色，胞漿等其它成分脫色。再利用胞漿染料伊紅染胞漿，使胞漿的各種不同成分又呈現(xiàn)出深淺不同的粉紅色。故各種組織或細胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點均可顯示出來。染色結(jié)果細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍色，粘液呈灰藍色。細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。著色情況與組織或細胞的種類有關(guān)，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，很多細胞在新生時期胞漿對伊紅著色較淡或輕度嗜堿，當其衰老時或發(fā)生退行性變則呈現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時，伊紅著色由淺變深。常規(guī)HE染色步驟5-10min(1)二甲苯(I)

5-10min(2)二甲苯(II) 5-10min⑶95%乙醇(I) 1-3min95%乙醇(II) 1-3minTOC\o"1-5"\h\z80%乙醇 1min(6)蒸餾水 1min(7)蘇木精液染色 5-15min(8)流水稍洗去蘇木精液 1-3s(9)1%鹽酸乙醇 1-3s(10)稍水洗 10-30s(11)促藍液返藍 10-30 s(12)流水沖洗 10-15 min(13)蒸餾水過洗 1-2 s(14)0.5%曙紅液染色 1-3min(15)蒸餾水稍洗 1-2 s80%乙醇稍洗 1-2s95%乙醇(I) 3-5min95%乙醇(I) 3-5min(19)無水乙醇 5-10 min(20)無水乙醇 5-10 min(21)二甲苯(I) 3-5min(22)二甲苯(I) 2-5 min(23)二甲苯(III) 3-5 min(24)中性樹膠封固結(jié)果：細胞漿紅色，細胞核藍紫色。一、操作方法及步驟：①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24x24x2mm。②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細小組織，滴上包埋劑。③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5?10um間。二、冰凍切片時的注意事項：①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。③放置組織冰凍前，應(yīng)視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。④組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預(yù)先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現(xiàn)冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經(jīng)固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當冰凍發(fā)生時，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。⑤當切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點。⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。三、冰凍切片的快速染色方法：①切片固定30秒一1分鐘。②水洗。③染蘇木素3—5分鐘。④分化。⑤于堿水中返藍20秒。⑥伊紅染色10-20秒。⑦脫水，透明，中性樹膠封固。冰凍組織1-2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘?？偣苍?0分鐘內(nèi)完成快速制片過程，結(jié)果與石蠟切片不相上下。冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環(huán)的半導體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法在目前來說已很少使用，因此在這里不作闡述。常規(guī)方法:(1)冰凍切片固定10?30s(2)稍水洗1?2s(3)蘇木精液染色(60℃)30?60(4)流水洗去蘇木精液5?10s(5)1%鹽酸乙醇1?3s(6)稍水洗1?2s(7)促藍液返藍5?10s(8)流水沖洗15?30s(9)0.5%曙紅液染色30?60s(10)蒸餾水稍洗1?2s(11)80%乙醇1?2s(12)95%乙醇1?2ss(13)無水乙醇TOC\o"1-5"\h\z(14)石炭酸二甲苯 2?3s(15)二甲苯(I) 2?3s(16)二甲苯(II) 2?3s(17)中性樹膠封固。注：第(14)步如果不用石炭酸二甲苯，可改用無水乙醇，染色結(jié)果為：細胞核藍色、胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈深淺不一的紅色。封片切片染色后封片常用中性樹膠，酸性的樹膠可使胞核褪色