核酸的生物合成專業(yè)知識講座

核酸的生物合成專業(yè)知識講座核酸的生物合成專業(yè)知識講座第1頁教學(xué)目標和要求1、掌握DNA半保留復(fù)制；原核生物DNA復(fù)制過程，2、掌握DNA損傷與修復(fù)；3、掌握RNA轉(zhuǎn)錄過程。4、了解真核生物DNA復(fù)制特點、反轉(zhuǎn)錄；DNA人工合成，真核細胞轉(zhuǎn)錄特點等。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第2頁中心法則（centraldogma）遺傳信息傳遞方向規(guī)律基因表示：是指將遺傳信息由DNA轉(zhuǎn)錄為RNA、再翻譯成蛋白質(zhì)過程核酸的生物合成專業(yè)知識講座第3頁中心法則遺傳流向有5條路徑

1、DNA→DNA：DNA復(fù)制（以DNA為模板合成DNA）

2、RNA→RNA：RNA復(fù)制（以RNA為模板合成RNA）

3、DNA→RNA：DNA轉(zhuǎn)錄（以DNA為模板合成RNA）

4、RNA→DNA：反(逆)轉(zhuǎn)錄（以RNA為模板合成DNA）

5、RNA→Protein：翻譯核酸的生物合成專業(yè)知識講座第4頁

復(fù)制：是親代雙鏈DNA按堿基配對標準，準確形成兩個相同核苷酸序列子代DNA分子過程。兩條DNA鏈都可作為復(fù)制模板。

轉(zhuǎn)錄：是以一條DNA鏈為模板，將DNA鏈上儲存遺傳信息按堿基配對標準準確轉(zhuǎn)換成互補mRNA過程。

翻譯：是以mRNA為模板，將mRNA上遺傳信息轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)氨基酸序列過程。逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，生成DNA過程。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第5頁第一節(jié)DNA生物合成一、DNA半保留復(fù)制

二、與DNA復(fù)制相關(guān)酶和蛋白質(zhì)

三、DNA復(fù)制過程

四、逆轉(zhuǎn)錄核酸的生物合成專業(yè)知識講座第6頁一、DNA半保留復(fù)制定義：由親代DNA生成子代DNA時，每個新形成子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制半保留復(fù)制試驗證據(jù):1958年Meselson和Stahl用同位素15N標識大腸桿菌DNA,首先證實了DNA半保留復(fù)制。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第7頁15N-DNA密度大于14N-DNA密度核酸的生物合成專業(yè)知識講座第8頁二、與DNA復(fù)制相關(guān)酶和蛋白質(zhì)

原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、

dCTP、dTTP)

模板：以DNA兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA。

引物：一小段RNA(或DNA）為引物，在大腸桿菌中，DNA合成需要一段RNA鏈作為引物。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第9頁1.引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA引物（Primer)。實質(zhì)是以DNA為模板RNA聚合酶。2.DNA聚合酶:以DNA為模板DNA合成酶，其催化反應(yīng)特點

（1）以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物；（2）反應(yīng)需要有模板指導(dǎo)；（3）反應(yīng)需要有3-OH存在；（4）DNA鏈合成方向為53核酸的生物合成專業(yè)知識講座第10頁（5）DNA聚合酶反應(yīng)能夠利用DNA雙鏈作為模板和引物，亦能夠單鏈DNA作為模板和引物（6）DNA體外聚合必須加入少許DNA才能進行。DNA在提取過程中易形成切口（nick）或缺口（gap）.則加入DNA一條鏈作為模板而另一條鏈可作為引物。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第11頁原核生物中DNA聚合酶在大腸桿菌中發(fā)覺有三種DNA聚合酶（用突變株研究其功效）：

⑴DNA聚合酶Ⅰ:單體酶,多肽鏈內(nèi)含一個鋅原子（其鰲合劑是O-二氮雜菲），多功效酶。它含有53聚合酶功效（對脫氧核苷酸選擇）；3’

5’外切酶活性（對雙鏈無作用，校對功效。但在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長鏈）及5’

3’外切酶活性（雙鏈有效，主要是對DNA損傷修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時RNA引物切除及其空隙填補）；在DNA鏈3

形成焦磷酸解（生理意義不大）；無機焦磷酸鹽與dNTP之間焦磷酸基交換。

⑵DNA聚合酶Ⅱ：多亞基酶，聚合作用，但聚合活力很低；含有3’

5’外切酶活性。其它生理功效尚不清楚，可能在修復(fù)紫外光引發(fā)DNA損傷中起作用。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第12頁⑶DNA聚合酶Ⅲ：是原核生物DNA復(fù)制主要聚合酶，該酶由10種亞基組成，其中、、形成全酶關(guān)鍵酶。含有5’3’DNA聚合酶活性（亞基，速率高）；含有3’

5’外切酶（亞基）校對功效，提升DNA復(fù)制保真性；還含有5’

3’外切酶活性（單鏈有效，其意義未知）。（4）DNA聚合酶IV和V：1999年發(fā)覺，當DNA嚴重損傷時，誘導(dǎo)產(chǎn)生。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第13頁

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ

亞基數(shù)目1（單體酶）＞1（多亞基酶）＞1（多亞基酶）

5’3’聚合活性+中+很低+很高3‘5’外切活性+++（保護DNA復(fù)制忠實性fidelity）5‘3’外切活性+--主要是對DNA損傷修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時切除RNA引物并填補其留下空隙。修復(fù)紫外光引發(fā)DNA損傷DNA復(fù)制主要聚合酶，還含有3’-5‘

外切酶校對功效，提升DNA復(fù)制保真性核酸的生物合成專業(yè)知識講座第14頁

在真核細胞內(nèi)有五種DNA聚合酶（與細菌DNA聚合酶性質(zhì)基礎(chǔ)相同：底物、模板、引物、方向）

αβγδε定位細胞核細胞核線粒體細胞核細胞核3‘-5’外切--+++酶活性功效引物合成修復(fù)作用線粒體DNA復(fù)制核DNA復(fù)制修復(fù)作用核酸的生物合成專業(yè)知識講座第15頁

3.DNA連接酶（1967年發(fā)覺）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。

不過它不能將兩條游離DNA單鏈連接起來。

大腸桿菌和其它細菌DNA連接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。T4噬菌體DNA連接酶不但能在模板鏈上連接DNA和DNA鏈之間切口，而且能連接無單鏈粘性末端平頭雙鏈DNA。3‘5‘3‘5‘OHP核酸的生物合成專業(yè)知識講座第16頁連接酶反應(yīng)機制：

酶+NAD+(ATP)酶-AMP+煙酰胺單核苷酸（PPi）酶-AMP+P-5‘-DNA酶+AMP-P-5’-DNADNA-3’-OH+AMP-P-5’-DNADNA-3’-O-P-5’-DNA+AMPDNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起主要作用作用核酸的生物合成專業(yè)知識講座第17頁拓撲異構(gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負超螺旋，反應(yīng)不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄相關(guān)。

拓撲異構(gòu)酶Π：使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當引入負超螺旋時需要由ATP提供能量，同復(fù)制相關(guān)。二者共同控制DNA拓撲結(jié)構(gòu)。5、解螺旋酶（解鏈酶）：經(jīng)過水解ATP將DNA兩條鏈打開。E.coli中rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開一對堿基需要水解2個ATP分子。4.拓撲異構(gòu)酶：催化DNA拓撲連環(huán)數(shù)發(fā)生改變酶，在DNA重組修復(fù)和其它轉(zhuǎn)變方面起主要作用。除連環(huán)數(shù)不一樣外其它性質(zhì)均相同DNA分子稱為拓撲異構(gòu)體，引發(fā)拓撲異構(gòu)體反應(yīng)酶稱為拓撲異構(gòu)酶核酸的生物合成專業(yè)知識講座第18頁6.其它蛋白因子：⑴單鏈結(jié)合蛋白(SSB-single-strandbindingprotein)：穩(wěn)定已被解開DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護單鏈不被核酸酶降解。⑵引發(fā)前體:它由各種蛋白質(zhì)dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’

和i組成。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。引發(fā)體能夠沿模板鏈5’3’方向移動,含有識別合成起始位點功效，移動到一定位置上即可引發(fā)RNA引物合成。移動和引發(fā)均需要ATP提供能量，n’蛋白含有ATP酶活力。引發(fā)體移動與復(fù)制叉移動方向相同，與岡崎片段合成方向相反。rep蛋白沿3’5’移動，而解螺旋酶I、II、III沿5’

3’移動。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第19頁三、DNA復(fù)制過程：（以大腸桿菌為例）

雙鏈解開

RNA引物合成

DNA鏈延伸切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰DNA片段核酸的生物合成專業(yè)知識講座第20頁1、雙鏈解開一些概念：

DNA復(fù)制有特定起始位點，叫做復(fù)制原點。常見ori(或o）表示。許多生物復(fù)制原點都是富含A、T區(qū)段。大腸桿菌染色體DNA以及真核生物細胞器DNA為雙鏈環(huán)狀，只有一個復(fù)制原點，而真核生物染色體DNA是線性雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點。從復(fù)制原點到終點，組成一個復(fù)制單位，叫復(fù)制子（基因組獨立進行復(fù)制單位）。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第21頁復(fù)制原點由DnaA蛋白識別，在原點由DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補鏈(DNA雙鏈解開還需DNA拓撲異構(gòu)酶Π

、SSB),在原點處形成一個眼狀結(jié)構(gòu)，叫復(fù)制眼。

DNA復(fù)制進行時，在眼兩側(cè)出現(xiàn)兩個叉子狀生長點(growthpoint)，叫復(fù)制叉。在復(fù)制叉上分布著各種與復(fù)制相關(guān)酶和蛋白因子，它們組成復(fù)合物稱為復(fù)制體（replisome）復(fù)制叉復(fù)制叉核酸的生物合成專業(yè)知識講座第22頁原核生物DNA聚合反應(yīng)相關(guān)酶類

（1）DNA聚合酶（2）引物酶和引發(fā)體：開啟RNA引物鏈合成。

(3）DNA連接酶（4）DNA解鏈酶

(5）單鏈結(jié)合蛋白：結(jié)合在解開DNA單鏈上，預(yù)防重新形成雙螺旋。

(6）拓撲異構(gòu)酶:兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能快速將DNA超螺旋或雙螺旋擔心狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物核酸的生物合成專業(yè)知識講座第23頁(1)復(fù)制起始①相互纏繞雙鏈母本DNA，復(fù)制從特定位置(復(fù)制原點OriorO)開始，該位置常是富含A、T區(qū)段。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第24頁②首先DNA解螺旋酶(DnaB)打開局部雙鏈，SSB與每條單鏈結(jié)合,穩(wěn)定單鏈并預(yù)防DNA復(fù)性;然后在DNA旋轉(zhuǎn)酶（TOPⅡ)作用下，使螺旋DNA局部變成松弛態(tài)。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第25頁核酸的生物合成專業(yè)知識講座第26頁③起始因子、引物酶、DNA聚合酶等隨即結(jié)合，復(fù)制開始。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第27頁核酸的生物合成專業(yè)知識講座第28頁

引發(fā)體在復(fù)制叉上移動，沿模板鏈5’3’方向移動，與復(fù)制叉移動方向相同，識別合成起始位點，DnaB蛋白活化引物合成酶。引發(fā)RNA引物合成。領(lǐng)頭鏈先引發(fā)開始合成，以原來一條DNA單鏈為模板（3’

5’),按5’

3’方向合成一段RNA引物鏈。領(lǐng)頭鏈開始合成后，隨即鏈也開始合成其引物。引物長度約為幾個至10個核苷酸，在引物5’端含3個磷酸殘基（引物酶底物是核苷三磷酸），3’端為游離羥基。（2）RNA引物合成核酸的生物合成專業(yè)知識講座第29頁在DNA聚合酶Ш催化下，以四種脫氧核糖核苷5’-三磷酸為底物，在RNA引物3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈延伸同時進行領(lǐng)頭鏈和隨即鏈合成。兩條鏈方向相反。

領(lǐng)頭鏈隨即鏈岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型（3）DNA鏈延伸核酸的生物合成專業(yè)知識講座第30頁復(fù)制叉起點復(fù)制叉延伸延伸起點領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈隨即鏈隨即鏈3’5’3’5’DNA雙向復(fù)制核酸的生物合成專業(yè)知識講座第31頁領(lǐng)頭鏈—在DNA復(fù)制時，合成方向與復(fù)制叉移動方向一致并連續(xù)合成鏈。隨即鏈—在DNA復(fù)制時，合成方向與復(fù)制叉移動方向相反，形成許多不連續(xù)片段，最終再連成一條完整DNA鏈。半不連續(xù)復(fù)制—在DNA復(fù)制時，領(lǐng)頭鏈是連續(xù)合成,而隨即鏈合成是不連續(xù)，這種復(fù)制方式稱為半不連續(xù)復(fù)制。發(fā)覺（1968）：

同位素試驗，3HdT

短時間內(nèi)為DNA小片段一段時間后檢測到DNA大片段。當用DNA連接酶變異株時，檢測到大量DNA片段積累。——證實DNA復(fù)制中有小片段合成。測定DNA小片段，遠遠大于合成DNA二分之一。因為U替換dT，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。在缺乏尿嘧啶-N-糖基酶突變植株中，檢測到二分之一3H標識出現(xiàn)在小片段（岡崎片段）中。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第32頁岡崎片段

在DNA復(fù)制過程中，領(lǐng)頭鏈能連續(xù)合成，而隨即鏈只能是斷續(xù)合成53多個短片段，這些不連續(xù)小片段以其發(fā)覺者名字命名為岡崎片段。岡崎片段：真核生物中100-200個核苷酸（核小體DNA單位）。原核生物中1000-個核苷酸（相當于一個順反子）。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第33頁蛋白Mr亞基數(shù)功效SSB(單鏈結(jié)合蛋白)756004結(jié)合單鏈DNADnaB蛋白(解螺旋酶)3000006DNA解螺旋,引物體成份引物酶(DnaG蛋白)600001RNA引物合成,引物體成份DNA聚合酶Ⅲ90000018~20新鏈延長DNA聚合酶I1030001除去引物,填充缺口DNA連接酶740001連接DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ)4000004超螺旋參加鏈延伸階段蛋白質(zhì)和酶核酸的生物合成專業(yè)知識講座第34頁核酸的生物合成專業(yè)知識講座第35頁

當新形成岡崎片段延長至一定長度，其3’-OH端碰到上一個岡崎片段時即停頓合成。復(fù)制叉移動到終止區(qū)即停頓復(fù)制（大腸桿菌有一個終止區(qū)）。這時會發(fā)生一系列改變：在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰DNA鏈；修復(fù)摻入DNA鏈錯配堿基；以修復(fù)方式填補終止區(qū)50-100bp空缺。這么以兩條親代DNA鏈為模板，各自形成一條新DNA互補鏈。結(jié)果是形成了兩個DNA雙股螺旋分子。（4）切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰DNA片段（復(fù)制終止）核酸的生物合成專業(yè)知識講座第36頁真核生物中DNA復(fù)制特點1、真核生物染色體有多個復(fù)制起點，多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。2、岡崎片段長約200bp.3、真核生物DNA復(fù)制速度比原核慢。4、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點不再重新開始復(fù)制；而在快速生長原核中，起點能夠連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物快速生長時，往往采取更多復(fù)制起點。5、真核生物有各種DNA聚合酶。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，預(yù)防染色體間末端連接。由端粒酶負責新合成鏈5RNA引物切除后填補，亦保持端粒一定長度。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第37頁復(fù)制叉復(fù)制叉終止區(qū)

端粒結(jié)構(gòu)3535

端粒結(jié)構(gòu)端粒酶是含RNA逆轉(zhuǎn)錄酶核酸的生物合成專業(yè)知識講座第38頁DNA復(fù)制其它方式大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制（一個復(fù)制起點，雙向復(fù)制）真核細胞線狀染色體DNA復(fù)制方式（多個復(fù)制起點，雙向復(fù)制）單向滾環(huán)式復(fù)制（噬菌體X174DNA—單鏈環(huán)狀）3

D-環(huán)式復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀DNA：兩條鏈復(fù)制起點不一樣位置，且復(fù)制不一樣時）核酸的生物合成專業(yè)知識講座第39頁定義:以RNA為模板，按照RNA中核苷酸次序合成DNA稱為逆轉(zhuǎn)錄，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進行。1970年Temin和Baltimore同時分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知致癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。用特異抑制物（放線菌素D）能抑制致癌RNA病毒復(fù)制，而對普通RNA病毒復(fù)制無影響。已知放線菌素D專門抑制以DNA為模板反應(yīng)，可見致癌RNA病毒復(fù)制過程必定包括到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒假說。四、逆轉(zhuǎn)錄核酸的生物合成專業(yè)知識講座第40頁+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄過程

（以前病毒形式引發(fā)整合到宿主細胞DNA中而使細胞惡性轉(zhuǎn)化）

單鏈病毒RNA

RNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶是多功效酶，兼有3種酶活性：

RNA指導(dǎo)DNA聚合酶活性

DNA指導(dǎo)DNA聚合酶活性核糖核酸酶H活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中RNA，可沿5’3’和3’

5’兩個方向起核酸外切酶作用。逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿5’3’方向合成DNA，并要求短鏈RNA作引物。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第41頁cDNA：幾乎全部真核生物mRNA分子3‘末端都有一段polyA,當加入寡聚dT作為引物時，mRNA就可作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下在體外合成與其互補DNA，稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)覺理論和實踐意義：不能把“中心法則”絕對化，遺傳信息也能夠從RNA傳遞到DNA。促進了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)研究，為腫瘤防治提供了新線索。當前逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究這些學(xué)科工具。1983年，發(fā)覺人類免疫缺點病毒（humanimmunedeficiencevirus,HIV）,感染T淋巴細胞后即殺死細胞，造成宿主機體免疫系統(tǒng)損傷，引發(fā)艾滋病（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）核酸的生物合成專業(yè)知識講座第42頁

第二節(jié)DNA損傷修復(fù)一、DNA突變DNA突變形式1、一個或幾個堿基對被置換（置換）2、插入一個或幾個堿基對（插入）3、一個或多個堿基對缺失（缺失）4、嘌呤和嘧啶顛換（顛換）核酸的生物合成專業(yè)知識講座第43頁二、DNA損傷與修復(fù)DNA損傷：DNA在復(fù)制時產(chǎn)生錯配、病毒基因整合；一些物化因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。從而影響DNA復(fù)制，并使DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯也跟著改變，因而表現(xiàn)出異常特征（生物突變）。若DNA損傷或錯配得不到修復(fù)，會造成DNA突變。其主要形式：一個或幾個堿基被置換插入一個或幾個堿基一個或多個堿基對缺失

DNA損傷修復(fù)——

四種修復(fù)路徑:光復(fù)活、切除修復(fù)、重組修復(fù)和誘導(dǎo)修復(fù)（亦稱暗修復(fù)）。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第44頁

光復(fù)活：將受紫外線照射而引發(fā)損傷細菌用可見光照射，大個別損傷細胞能夠恢復(fù)，這種可見光引發(fā)修復(fù)過程就是光復(fù)活作用

.切除修復(fù)：將DNA分子中受損傷個別切除，以完整那條鏈為模板再重新合成。特異內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA連接酶均參加。（發(fā)生在DNA復(fù)制前）重組修復(fù)

（發(fā)生在復(fù)制后）：復(fù)制時，跳過損傷部位，新鏈產(chǎn)生缺口由母鏈填補，原損傷部位并沒有切除但在后代逐步稀釋。誘導(dǎo)修復(fù)：造成DNA損傷或抑制復(fù)制處理均能引發(fā)一系列復(fù)雜誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOSresponse）。此過程誘導(dǎo)產(chǎn)生切除修復(fù)和重組修復(fù)中關(guān)鍵蛋白和酶，同時產(chǎn)生無校對功效DNA聚合酶。所以會有2種結(jié)果：修復(fù)或變異（進化）。

核酸的生物合成專業(yè)知識講座第45頁DNA紫外線損傷光復(fù)活酶修復(fù)核酸的生物合成專業(yè)知識講座第46頁DNA損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺點或錯配結(jié)構(gòu)缺點切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶AP核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復(fù)連接糖苷酶插入酶堿基取代核酸的生物合成專業(yè)知識講座第47頁DNA重組修復(fù)核酸的生物合成專業(yè)知識講座第48頁SOS反應(yīng)機制核酸的生物合成專業(yè)知識講座第49頁第三節(jié)RNA生物合成一、RNA聚合酶

二、RNA轉(zhuǎn)錄過程

三、轉(zhuǎn)錄后加工

四、RNA復(fù)制

核酸的生物合成專業(yè)知識講座第50頁一、概念轉(zhuǎn)錄：以DNA一條鏈為模板在RNA聚合酶催化下，按照堿基配對標準，合成一條與DNA鏈一定區(qū)段互補RNA鏈過程稱為轉(zhuǎn)錄。以四種核糖核苷三磷酸酸（NTP）為底物，形成3、5-磷酸二酯鍵相連接。轉(zhuǎn)錄不對稱性：在RNA合成中，DNA二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄模板，稱為轉(zhuǎn)錄不對稱性。反義鏈（無意義鏈，負鏈）：在RNA轉(zhuǎn)錄中，用作模板DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈（編碼鏈，正鏈）在RNA轉(zhuǎn)錄中，不作為模板DNA鏈稱為有義鏈核酸的生物合成專業(yè)知識講座第51頁RNA聚合酶：大腸桿菌RNA聚合酶全酶由5種亞基α2ββ’σ組成，σ因子與其它個別結(jié)合不是十分緊密，它易于與β’βα2分離，沒有σ亞基酶稱為關(guān)鍵酶——只催化鏈延長，對起始無作用。五種亞基功效分別為：

α亞基：與開啟子結(jié)合功效。

β亞基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯鍵。

β’亞基：與DNA模板結(jié)合功效。

σ亞基：識別起始位點。

一、RNA聚合酶核酸的生物合成專業(yè)知識講座第52頁

真核細胞RNA聚合酶酶類分布產(chǎn)物α-鵝膏蕈堿對酶作用分子量反應(yīng)條件ⅡIⅢ核仁核質(zhì)核質(zhì)rRNA5.8SrRNA18SrRNA28SrRNAmRNAtRNA5SrRNA不抑制低濃度抑制高濃度抑制500000~700000~700000_低離子強度,要求Mg2+或Mn2+高離子強度高Mn2+濃度核酸的生物合成專業(yè)知識講座第53頁RNA聚合酶特點：1、反應(yīng)底物：NTP，DNA為模板、Mg2+促進聚合反應(yīng)。

RNA聚合酶不需要引物，合成方向53。2、真核生物與原核生物RNA聚合酶結(jié)構(gòu)不一樣。3、利福平抑制原核生物RNA聚合酶活性；α-鵝膏蕈堿抑制真核生物RNA聚合酶活性。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第54頁RNA轉(zhuǎn)錄過程：（以大腸桿菌為例）

起始位點識別

轉(zhuǎn)錄起始鏈延伸轉(zhuǎn)錄終止二、RNA轉(zhuǎn)錄過程核酸的生物合成專業(yè)知識講座第55頁（1）起始位點識別

RNA合成不需要引物。體外試驗證實，不含σ亞基關(guān)鍵酶會隨機地在一個基因兩條鏈上開啟，當有σ亞基時就會選擇正確起點。σ亞基起著識別DNA分子上起始信號（開啟子——指RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄一段DNA序列）作用。開啟子結(jié)構(gòu)最少由三個別組成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶識別信號；-10序列是酶緊密結(jié)合位點（富含AT堿基，利于雙鏈打開）；第三個別是RNA合成起始點。AACTGTATATTATTGACATATAAT+1轉(zhuǎn)錄起始點5’3’3’5’

35序列Sextama框

10序列Pribnow框核酸的生物合成專業(yè)知識講座第56頁（2）轉(zhuǎn)錄起始

RNA聚合酶全酶掃描解鏈區(qū)，找到起始點，然后結(jié)合第一個核苷三磷酸。加入第一個核苷三磷酸常是GTP或ATP，極少是CTP，不用UTP。所形成開啟子、全酶和核苷三磷酸復(fù)合物稱為三元起始復(fù)合物，第一個核苷三磷酸一旦摻入到轉(zhuǎn)錄起始點，σ亞基就會被釋放脫離關(guān)鍵酶。因子僅與起始相關(guān)，RNA合成一旦開始，便被釋放E-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板鏈核酸的生物合成專業(yè)知識講座第57頁（3）RNA鏈延伸DNA分子和酶分子發(fā)生構(gòu)象改變，關(guān)鍵酶與DNA結(jié)合比較松弛，可沿DNA模板移動，并按模板次序選擇下一個核苷酸，將核苷三磷酸加到生長RNA鏈3’-OH端，催化形成磷酸二酯鍵。轉(zhuǎn)錄延伸方向從5’

3’核酸的生物合成專業(yè)知識講座第58頁（4）轉(zhuǎn)錄終止

在DNA分子上（基因末端）提供轉(zhuǎn)錄停頓信號DNA序列稱為終止子（terminators),它能使RNA聚合酶停頓合成RNA并釋放出RNA。

需要ρ因子（終止因子，幫助RNA聚合酶識別終止信號）幫助，ρ因子能與RNA聚合酶結(jié)合但不是酶組分，它作用是阻止RNA聚合酶向前移動，于是轉(zhuǎn)錄終止，并釋放出已轉(zhuǎn)錄完成RNA鏈。不依賴于ρ因子。強終止子序列有兩個顯著特征：（1）在終止點之前含有一段富含G-C回文區(qū)域。（2）富含G-C區(qū)域之后是一連串dA堿基序列，它們轉(zhuǎn)錄RNA鏈末端為一連串U（連續(xù)6個）。弱終止子：缺乏回文結(jié)構(gòu)強終止子：有回文結(jié)構(gòu)核酸的生物合成專業(yè)知識講座第59頁新合成RNA分子中經(jīng)典回文結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）核酸的生物合成專業(yè)知識講座第60頁有些終止子作用可被特異因子所阻止，使酶得以越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，稱為通讀（readthrough）能夠引發(fā)抗終止作用蛋白質(zhì)稱為抗終止因子（antiterminationfactors）核酸的生物合成專業(yè)知識講座第61頁核酸的生物合成專業(yè)知識講座第62頁RNA生物合成抑制劑1、嘌呤和嘧啶類似物：人工合成堿基類似物能夠抑制和干擾核酸合成。如NH2SHSH作為代謝拮抗物抑制合成酶類或直接摻到核酸分子中，形成異常RNA或DNA。NH2NH2OHNFNH2SH核酸的生物合成專業(yè)知識講座第63頁2、DNA模板功效抑制物：能夠與DNA模板結(jié)合，抑制其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄（1）烷化劑：使DNA發(fā)生烷基化，發(fā)生在G-N7，A-N1、N3N7

；C-N1。易引發(fā)嘌呤水解，在DNA上留下空隙干擾復(fù)制或轉(zhuǎn)錄；或引發(fā)堿基錯配。（2）放線菌素：放線菌素D與DNA形成非共價復(fù)合物，抑制其模板功效（低濃度抑制轉(zhuǎn)錄，較高濃度抑制復(fù)制）。含有類似作用還有色霉素A3

、橄欖霉素、光神霉素。（3）嵌入染料：可插入雙鏈DNA分子相鄰堿基對之間，普通含有芳香族發(fā)色團。溴化乙錠（EB）是一個高靈敏熒光試劑，常見來檢測DNA和RNA。與DNA結(jié)合后抑制其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第64頁3、RNA聚合酶抑制物（1）利福霉素：抑制細菌RNA聚合酶活性。利福平能夠高效抑制結(jié)核桿菌，殺死麻瘋桿菌，在體外有抗病毒作用。（2）利鏈霉素：與細菌RNA聚合酶亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄過程中RNA鏈延長反應(yīng)。（3）-鵝膏蕈堿：抑制真核生物RNA聚合酶活性。核酸的生物合成專業(yè)知識講座第65頁三、RNA轉(zhuǎn)錄后加工

在細胞內(nèi)，由RNA聚合酶合成原初轉(zhuǎn)錄物（primarytranscript）往往需