原核誘導(dǎo)表達(dá)

可修改精品文檔原核誘導(dǎo)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)使本實(shí)驗(yàn)室工作人員了解誘導(dǎo)表達(dá)的操作過(guò)程，并能實(shí)際動(dòng)手進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)一系本SOP適用于對(duì)新基因克隆的表達(dá)，并針對(duì)新基因產(chǎn)生的可溶性蛋白。E.coli的乳糖操縱子含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)代謝物基因激活蛋白(CAP)結(jié)合位點(diǎn)。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。在沒有乳糖存在時(shí)，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)。此時(shí)，I序列在PI啟動(dòng)序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子即可被誘導(dǎo)。在這個(gè)操縱子體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)b－半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。 (一)實(shí)驗(yàn)器材的滅菌：槍頭的滅菌：1mL，200μL，20μL的槍頭放入槍頭盒，用報(bào)紙包住(2層)，放入高壓滅菌鍋中滅菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常溫放置。螺口管及離心管的滅菌：將螺口管和離心管分別放入鋁制飯盒中(蓋子要擰松，離心管的管蓋打開)，放入高壓滅菌鍋中滅菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常溫放置。50mL離心管的滅菌：將50mL離心管用報(bào)紙包住(2層)，放入高壓滅菌鍋中滅菌，121℃，20min。80℃烘箱中烘干，常溫放置。 (二)LB培養(yǎng)基的配制液體LB培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨10g氯化鈉10g酵母提取物5g調(diào)PH值到7.5，高壓滅菌，4℃保存。固體LB培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨10g氯化鈉10g可修改精品文檔酵母提取物5g瓊脂粉15g高壓滅菌，不燙手的情況下加入抗性，抗性：培養(yǎng)基=1：1000(氨芐，卡那通常濃度)，混勻。馬上在無(wú)菌操作臺(tái)中倒平板，并開大風(fēng)吹干。用封口膜封住，倒置放于4℃保存。 (三)1MIPTG的配制：經(jīng)過(guò)計(jì)算，10gIPTG可以配42ml的1MIPTG。買來(lái)的粉末狀的IPTG一般全部配成1MIPTG。2、用少量去離子水將IPTG溶解完全，并定容。3、在無(wú)菌操作臺(tái)中，用0.22μm的濾器將配好的IPTG濾入滅菌后的1.5ml離心管中，過(guò)濾除菌，-20℃保存。注意事項(xiàng)：在用濾器將IPTG濾入離心管時(shí)，先用針頭吸IPTG，然后將槍頭拔掉，排出氣體，濾頭加入IPTG液，在使針管與濾器相連，保證整個(gè)裝置無(wú)氣體進(jìn)入。濾的過(guò)程中，手不能碰濾頭。 (四)3×SDSloadingbuffer的配制：33×SDSloadingbuffer10ml1MTris-Hcl(PH6.8)1.5mlSDS0.6gBPB(溴酚藍(lán))30mg甘油(丙三醇)3ml去離子水5.5ml1．將除BPB以外的藥品完全溶解。SDS常溫下很難溶解，可以在37℃水浴溶解。2．把溶好的buffer分裝到1.5ml的離心管中，1ml/管，常溫放置。3．使用前，每管加入30μL巰基乙醇。注意事項(xiàng)：巰基乙醇為危險(xiǎn)品，加入的過(guò)程在通風(fēng)櫥中完成，并且?guī)Ш檬痔住?(五)10×PBS的配制：00.1MPBS(10×PBS)NaH2PO4.2H2ONaclNa2HPO4.12H2O85g28.98g用去離子水將以上藥品進(jìn)行溶解。(溶解的非常慢，可能需要過(guò)夜)可修改精品文檔調(diào)PH值到7.2，用0.4μm的濾膜過(guò)濾。常溫保存。工作時(shí)用的是1×PBS。 (六)1.5MTris-Hcl(PH8.8)的配制：250ml45.425g1.5MTris250ml45.425gTris1．用200ml去離子水將Tris溶解。2．用濃鹽酸調(diào)PH值到8.8。3．調(diào)好PH的Tris-Hcl定容到250ml。4．0.4μm的濾膜過(guò)濾，常溫保存。注意事項(xiàng)：Tris的緩沖能力很強(qiáng)，調(diào)PH值時(shí)，費(fèi)些時(shí)間，但不要調(diào)過(guò)。250ml30.275g (七)1MTris-Hcl(PH6.8)250ml30.275g1MTris-HclTris1．用200ml去離子水將Tris溶解。2．用濃鹽酸調(diào)PH值到6.83．調(diào)好PH的Tris-Hcl定容到250ml。4．0.4μm的濾膜過(guò)濾，常溫保存。 (八)30%丙烯酰胺的配制：30%丙烯酰胺丙烯酰胺BIS甲叉丙烯酰胺250ml72.5ml2.5ml1．把藥品用去離子水溶解后定容到250ml。2．用濾紙過(guò)濾，放在棕色瓶子中，4℃保存。注意事項(xiàng)：兩種藥品有毒性，配制過(guò)程要帶手套和口罩。 (九)10%SDS的配制：1．1gSDS加入10ml去離子水進(jìn)行溶解。2．分裝到1.5ml離心管中，-20℃保存。 (十)10%過(guò)硫酸銨的配制：1．1g過(guò)硫酸銨加入10ml去離子水進(jìn)行溶解。2．分裝到1.5ml離心管中，-20℃保存。 (十一)5×SDS電泳緩沖液的配制：可修改精品文檔55×SDS電泳緩沖液TrisGlycine(甘氨酸)SDS94g5g將以上藥品用去離子水溶解后定容到1L，常溫保存。工作時(shí)用的是1×SDS電泳緩沖液。 (十二)考馬斯亮藍(lán)R-250染色液的配制：考馬斯亮藍(lán)R-250染色液1L注意事項(xiàng)：在磁力攪拌器上攪拌時(shí)，要把容器封口。 (十三)脫色液的配制：脫色液醋酸(冰乙酸)乙醇(無(wú)水乙醇)去離子水常溫保存。100ml50ml850ml四．實(shí)驗(yàn)步驟： (一)：質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化酒精擦拭后開始操作。2．從-80℃的冰箱中取出表達(dá)菌(BL21)的感受態(tài)細(xì)胞(每管100μL)，在-80℃冰水中融化。3．載體(PET32a等)與基因片段的連接后質(zhì)粒1μL，緩慢的加入到100μLBL21感受態(tài)中，冰置15min。(無(wú)菌操作)3．42℃下熱激90s，隨后在冰水中冰置5min。4．涂板：先將涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精燈火焰燒，放置等它涼卻。把處理后的感受態(tài)點(diǎn)在含有抗性的固體培養(yǎng)基(氨芐或卡那等)上。用冷卻的涂布棒進(jìn)行涂布，左手把該蓋拿起，小指輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)基，右手來(lái)涂，涂到培養(yǎng)基表面快干。 (無(wú)菌操作)5．放在37℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)過(guò)夜。注意事項(xiàng)：可修改精品文檔1．質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí)，質(zhì)粒是凍在-20℃的冰箱中，等它完全化了在進(jìn)行吸取，往感受態(tài)中加入質(zhì)粒時(shí)，一定要緩慢，因?yàn)楦惺軕B(tài)非常脆弱，防止感受態(tài)受傷。2．質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí)，熱激的時(shí)間90s，一定要控制好時(shí)間。3．質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí)，涂布棒在涂布前，一定要晾涼涂布棒。防止感受態(tài)被燙死，或固體培養(yǎng)基的損壞。 (二)：挑菌與接菌：1．無(wú)菌操作臺(tái)紫外線照射，后通風(fēng)。將轉(zhuǎn)化后的平板取出。)取出，在酒精燈的外焰上灼燒螺口管管口。培養(yǎng)基(一般5.5mL)加入螺口管中，后加入抗性(氨芐霉素、卡那等)。氨芐霉素(卡那)：LB基=1:1000(5.5μL)，抗性由載體決定。4．鑷子用酒精棉球擦拭，并在酒精燈的外焰上灼燒，將鑷子晾涼。用晾涼的鑷子，夾取20μL小槍頭，在轉(zhuǎn)化后的平板上挑取單菌落，扔到培養(yǎng)基中。5．接好菌的螺口管，進(jìn)行搖菌。37℃，180rpm。搖到菌的對(duì)數(shù)期(OD值0.4-0.6)，600時(shí)間大概2-3h?？梢阅：吹绞旨纯?。(注意不要搖過(guò))6．用完的平板用封口膜封住，倒置放于4℃保存。7．若直接用菌液進(jìn)行接菌，接菌比例為，菌液：LB培養(yǎng)基=1：100。注意事項(xiàng)：1．接菌吸培養(yǎng)基時(shí)，把放置培養(yǎng)基的三角瓶?jī)A斜才吸取培養(yǎng)基，移液槍盡量不要插進(jìn)三角瓶中。2．接菌時(shí)一定要加入抗性，挑菌落時(shí)，要挑單個(gè)的菌落，且不要把培養(yǎng)基也扣起來(lái)。3．搖菌不要過(guò)了它的對(duì)數(shù)期，2小時(shí)后隨時(shí)注意其生長(zhǎng)狀態(tài)。 (三)小量保菌：3．保菌：從滅菌的飯盒中取出4個(gè)1.5ml的滅菌的離心管，加入50μL的滅菌后的80%的甘油，并分別加入相應(yīng)的350μL菌液。一個(gè)基因的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)菌都要進(jìn)行保菌。(若不保菌，實(shí)驗(yàn)不能進(jìn)行重復(fù)，只能從頭做)是平行對(duì)照中它排幾號(hào)。注意事項(xiàng)：1．在小量保菌中，一個(gè)基因的四個(gè)平行對(duì)照都要保菌，否則得重新摸條件。2．在小量保菌中，菌液與甘油一定要混勻在保存，否則菌會(huì)被凍死。 (四)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索可修改精品文檔2．小量保菌后的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，分別加入不同終濃度的IPTG，在不同的溫度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)(如下圖)：對(duì)照編對(duì)照編號(hào)IPTG終濃度誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)溫度1mmol/L℃2號(hào)0.1mmol/L℃1mmol/L℃4號(hào)0.1mmol/L℃ (五)小量收菌1．將誘導(dǎo)完成的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液，分別取出1mL，對(duì)應(yīng)裝于4個(gè)不同的1.5ml離心管中并做好標(biāo)記。剩余的平行實(shí)驗(yàn)組菌液放入4℃保存。4．把上層1×PBS倒掉，再次離心同步驟3。5．用80μL1×PBS把表達(dá)菌體重懸。6．在四個(gè)平行的重懸液中，分別加入80μL3×SDSloadingbuffer。(把3×SDSloadingbuffer當(dāng)成2×SDSloadingbuffer用)7．煮樣8min。(打開鍋蓋煮)8．離心13000rpm,10min。吸上清。9．進(jìn)行SDS電泳。注意事項(xiàng)：在煮樣時(shí)要打開鍋蓋煮，防止小樣進(jìn)水，若樣進(jìn)水，則不能再用。 (六)SDS膠的配制1．分離膠的配制 (1)找出配套的膠板，用擦鏡紙擦干凈，并固定在配膠器上。隨后用去離子水試漏。 (2)若膠板不漏水，就進(jìn)行分離膠的配制。依次將水、30%丙烯酰胺、1.5MTris-Hcl (PH8.8)、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨加到干凈的小燒杯中(如下圖)，混勻。(1mm的膠板，一般配一塊膠用5ml。所配的膠濃度一般為12%，但濃度也要視情況而定。蛋白越小，膠的濃度越大。)可修改精品文檔 (3)將膠板中的水倒掉，并用濾紙吸干水分(不要將濾紙塞到膠板底部)。 (4)小燒杯中再加入TEMED，混勻。(TEMED可使膠凝固，所以最后加) (5)灌膠：混勻的分離膠沿著膠板邊緣輕輕灌下，防止產(chǎn)生氣泡。 (6)用水將分離膠壓平。(用水灌滿，同時(shí)加水時(shí)要緩慢加入，防止把膠吹起)2．濃縮膠的配制 (1)待分離膠與水中間形成明顯的橫線，即分離膠凝固。隨后進(jìn)行濃縮膠的配制，依次將水、30%丙烯酰胺、1.0MTris-Hcl(PH6.8)、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨加到干凈的小燒杯中(如下圖)(2)將分離膠上層的水倒掉，并用濾紙吸干水分。(盡量不要把濾紙插入) (3)小燒杯中再加入TEMED，混勻。 (4)灌膠。然后插入梳子。 (5)把制膠器倒過(guò)來(lái)，膠仍然不會(huì)往外流，或可以明顯看出梳子中兩個(gè)齒之間的膠面明顯凹下去，說(shuō)明濃縮膠凝固。將凝固的膠板裝入電泳槽內(nèi)，并在電泳槽內(nèi)加入SDS電泳緩沖液，把膠浸泡一段時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)越好。(防止梳子與膠相連，可修改精品文檔或膠因濕度不夠而萎縮) (6)點(diǎn)樣時(shí)，再把梳子拔出來(lái)，拔時(shí)動(dòng)作要輕，防止膠齒被拔斷。 (七)未誘導(dǎo)和空載的制備在誘導(dǎo)表達(dá)中，有兩個(gè)重要的對(duì)照組，即空載誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)。 (1)未誘導(dǎo)是我們所做一個(gè)基因除了四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)外，再做的一個(gè)對(duì)照組菌，唯一不表達(dá)完的菌濃度差不多即可) (2)未誘導(dǎo)的菌進(jìn)行小量處理，見上面的小量收菌。 (1)空載的轉(zhuǎn)化：將不連基因片段的空載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌(和前面的試驗(yàn)用一個(gè)表達(dá)菌)，如“BL21-PET32a-VAV質(zhì)粒”轉(zhuǎn)入“BL21表達(dá)菌”，其空載應(yīng)當(dāng)是“BL21-PET32a”轉(zhuǎn)入BL”。轉(zhuǎn)化步驟同上。 (2)空載接一個(gè)菌(實(shí)驗(yàn)組)，并搖菌搖到對(duì)數(shù)期(步驟同上)。 (3)空載的誘導(dǎo)：hIPTG濃度為1mmol/L。(誘導(dǎo)步驟 (4)空載的菌進(jìn)行小量處理，見上面的小量收菌。 (八)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索的SDS電泳1．拔掉SDS膠上的梳子，并用小針調(diào)整齒的位置(使它們都平行)。2．點(diǎn)樣。用20μL的小槍頭，吸煮過(guò)的樣品10μL，對(duì)準(zhǔn)膠孔點(diǎn)樣，注意不要把樣品點(diǎn)在外面。我們用的marker是低分子量蛋白marker。一般的點(diǎn)樣順序是：55樣品3號(hào)6樣品4號(hào)3樣品1號(hào)4樣品2號(hào)2未誘導(dǎo)7marker1空載。把膠板從電泳儀上卸下，用刀片把膠板撬開，膠的濃縮膠部分割除，放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中進(jìn)行常溫過(guò)夜染色。5．脫色。將過(guò)夜染色的SDS膠放入脫色液中進(jìn)行脫色，直到背景發(fā)白。 (九)四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液的選擇未誘導(dǎo)沒有過(guò)量的蛋白表達(dá)，而空載有一處蛋白的過(guò)量表達(dá)(大小由表達(dá)載體決定)，四個(gè)目的蛋白。則說(shuō)明蛋白無(wú)表達(dá)。可修改精品文檔3h)，進(jìn)行下面的小量超聲實(shí)驗(yàn)。 (十)表達(dá)菌的小量超聲實(shí)驗(yàn)菌)5．把上層1×PBS倒掉，再次離心同步驟3。LPBS表達(dá)菌重懸。s直到菌液超澄清(透明呈現(xiàn)雞蛋清色)。11．離心產(chǎn)物上清取出100μL，加入100μL3×SDSloadingbuffer。12．上清倒掉，沉淀用1ml1×PBS把表達(dá)菌重懸，再次離心13000rpm，10min。14．上清倒掉，用100μL將沉淀懸起，加入100μL3×SDSloadingbuffer。16．離心13000rpm,10min。吸上清。體。超的過(guò)程中不要超糊。 (十一)破菌超聲的SDS電泳1．配膠、點(diǎn)樣、電泳的步驟如上。破菌超聲的點(diǎn)樣順序一般為：55破菌上清6破菌沉淀2未誘導(dǎo)1marker4全菌3空載2．若破菌上清表達(dá)的蛋白與全菌的蛋白分子量一致(目的蛋白)，且破菌沉淀中沒有， (十二)目的蛋白的大量表達(dá)(1L)可修改精品文檔3．標(biāo)準(zhǔn)保菌：100μL滅菌甘油加入700μL過(guò)夜菌?；靹?，-20℃保存。(寫好名稱日期，如上，放入表達(dá)菌的庫(kù)中)瓶6004．搖菌：37℃，180rpm，搖到對(duì)數(shù)期，搖到菌的對(duì)數(shù)期(OD值0.4-0.6)600大概2-3h?？梢阅：目吹绞旨纯伞?注意在搖過(guò)程中隨時(shí)觀察狀態(tài)，不要搖過(guò))5．誘導(dǎo)：依據(jù)摸索好的條件進(jìn)行誘導(dǎo)。 (十三)大量誘導(dǎo)的收菌：1．50ml離心管滅菌烘干，待用。2．找出兩個(gè)50ml離心管，管蓋和管壁上做標(biāo)記，并稱重。3．6個(gè)50ml離心管(包括稱重的兩個(gè))，倒入菌液(40—45ml)。配平，離心7000rpm，4．倒掉上清，用1×PBS把菌重懸，離心7000rpm，10min。5．重復(fù)4。6．倒掉上清，稱菌體的重量。7．懸菌。1g菌體加入35ml的純化時(shí)用的上樣緩沖液懸起。-20℃保存。 (十四)大量表達(dá)菌的超聲1．把表達(dá)菌從-20℃拿出，在流水中融化。2．把完全融化的表達(dá)菌，放入小燒杯中準(zhǔn)備超聲。3．將超聲儀打開預(yù)熱20min，并準(zhǔn)備冰盒。4．將呈菌液的小燒杯放入冰盒進(jìn)行超聲，超聲效率為30—50HZ，超聲3s，停s。直到菌液超澄清，呈現(xiàn)雞蛋清色。(一般超20-30min，注意不要吵時(shí)間太長(zhǎng)，使菌超糊)6．將上清收集在滅菌的50ml離心管中，進(jìn)行純化。五．促進(jìn)原核表達(dá)的蛋白可溶的方法：一般來(lái)說(shuō)，人們認(rèn)為包涵體的形成是因?yàn)樾律嚯逆湶荒茉谡_位置形成二硫鍵，二硫鍵錯(cuò)配，進(jìn)而錯(cuò)誤折疊的結(jié)果。而IPTG濃度越低，溫度越低，一般蛋白的可溶性越大，因?yàn)檫@樣的條件下，可以減慢蛋白的形成，減少蛋白的二硫鍵錯(cuò)配，從而促進(jìn)蛋白的可溶。1．使蛋白可溶的條件并不是固定的，一般來(lái)說(shuō)，以上條件就可是蛋白可溶(有0.025mmol/L，常溫，過(guò)夜誘導(dǎo)。這種條件是IPTG使用量的最小濃度，可以使包涵體部分可溶。2．180rpm搖菌搖對(duì)數(shù)時(shí)，不要搖過(guò)。對(duì)數(shù)期時(shí)，是表達(dá)菌產(chǎn)蛋白的最佳時(shí)期。表達(dá)菌濃度太大，對(duì)菌中蛋白的可溶性影響會(huì)很大。所以在搖菌到2h后，一定密切600關(guān)注菌的濃度，隨時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)OD值。這就意味著在接菌時(shí)，多接一些菌600實(shí)際情況而定)。3．蛋白的可溶與表達(dá)菌也有關(guān)系。菌株內(nèi)源的蛋白酶過(guò)多，可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株?？胺Q經(jīng)典的BL21系列就是lon和ompT可修改精品文檔蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)。BL21(DE3)即我們做表達(dá)是常用的表達(dá)菌。真核細(xì)胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時(shí)候，真核基因中的一些密碼子對(duì)于原核細(xì)胞來(lái)說(shuō)可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。改造基因是比較麻煩的做法，Rosetta2系列就是更好的選擇――這種攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種 (AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG)稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。(已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒)當(dāng)要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時(shí)，可以選擇K-12衍生菌Origami2系列，thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)。(卡那霉素敏感)Rosetta-gami?2則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點(diǎn)，既補(bǔ)充7種稀有密碼子，又能夠促進(jìn)二硫鍵的形成，幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白。(卡那霉素敏感)OrigamiB是衍生自lacZY突變的BL21菌株，這個(gè)突變能根據(jù)IPTG的濃度精確調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物，使得表達(dá)產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性。(四環(huán)素敏感)在決定試用這些名字古怪的菌株時(shí)，有幾個(gè)小Tips是要注意的，一個(gè)是不同菌株有時(shí)已經(jīng)攜帶某個(gè)質(zhì)粒或者已經(jīng)具有某種抗生素抗性，要注意自己的表達(dá)質(zhì)粒是否能與之兼容。比如Rosetta2已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒，不能再用氯霉素篩選等等。改改進(jìn)方案補(bǔ)充稀有密碼子的tRNA；將稀有密碼子突變?yōu)槠胀ù竽c桿菌密碼子降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽控制優(yōu)化表達(dá)水IPTG化降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽控制優(yōu)化表達(dá)水IPTG化更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制建議菌株Rosetta2Rosetta-gami2Rosetta-gamiBRosettaBlueOrigami2Rosetta-gami2Rosetta-gamiBTunerRosetta-gamiBOrigami2Rosetta-gami2Rosetta-gamiBTunerRosetta-gamiBpLysS菌株pLysS、pLysE菌株可能原因E.coli的密碼子偏移性二硫鍵形成困難表達(dá)過(guò)快，表達(dá)量過(guò)高蛋白錯(cuò)誤折疊毒性蛋白過(guò)高本底表達(dá)現(xiàn)象無(wú)蛋白表達(dá)出現(xiàn)截短蛋白包涵體蛋白無(wú)活性，生長(zhǎng)極困難無(wú)克隆生長(zhǎng)4．若實(shí)在不可溶，只能把蛋白截短，這樣可溶性會(huì)明顯增加。可修改精品文檔六．SDS的相關(guān)技巧：1．SDS電泳的原理：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS(十二烷基硫酸鈉)，SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子2．SDS電泳遇到的相關(guān)問(wèn)題及解答。 (1)配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響？在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋