基因工程學(xué)時(shí)

基因工程學(xué)時(shí)第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一1基因工程概念：應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)（DNA）分離出來，在體外進(jìn)行切割、拼接和重組。然后將重組的DNA導(dǎo)入某種宿主細(xì)胞或個(gè)體，從而改變它們的遺傳品性；或者使新的遺傳信息在新的宿主細(xì)胞或個(gè)體中大量表達(dá)，以獲得基因產(chǎn)物（多肽或蛋白質(zhì)）。第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一2①②③④⑤⑥基因工程技術(shù)的一般步驟第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一3第一節(jié)基因工程理論的研究基礎(chǔ)第二節(jié)基因工程基本技術(shù)路線第三節(jié)常用的工具酶和載體第四節(jié)目的基因片段的獲取第五節(jié)目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第六節(jié)克隆子的篩選和鑒定第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一4第一節(jié)基因工程理論的研究基礎(chǔ)染色體是遺傳物質(zhì)的載體。“基因”一詞的創(chuàng)立：1909年，丹麥遺傳學(xué)家約翰遜提出了“基因”（gene）一詞?！盎蛐汀迸c“表現(xiàn)型”術(shù)語，初步闡明基因與性狀的關(guān)系。不過此時(shí)的基因仍是一個(gè)未經(jīng)證實(shí)，僅靠邏輯推理得出的概念。第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一5基因結(jié)構(gòu)示意圖＋鏈5’－鏈3’上游

3’5’第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一6基因工程研究的理論依據(jù)：不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)基因是可以切割的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系遺傳密碼是通用的基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一7第二節(jié)基因工程的一般步驟生物材料RNADNAmRNAcDNA文庫基因組文庫人工合成目的基因克隆載體重組DNA受體細(xì)胞克隆子轉(zhuǎn)基因生物第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一8第三節(jié)常用的工具酶和載體

3.1工具酶（一）限制性核酸內(nèi)切酶：

(二）DNA連接酶：（三）DNA片段末端修飾酶：

(四)DNA聚合酶第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一9(一)限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）（1）限制性核酸內(nèi)切酶定義一類以環(huán)形或線形雙鏈DNA為底物，能識(shí)別DNA中特定核苷酸序列，并在合適反應(yīng)條件下使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3’－OH和5’－P基團(tuán)DNA片段的內(nèi)脫氧核苷酸酶。第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一10（2）限制性核酸內(nèi)切酶種類I型酶：它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈II型酶：在其識(shí)別位點(diǎn)之中或臨近的確定位點(diǎn)特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶III型酶：它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)之外切開DNA鏈，并且要求識(shí)別位點(diǎn)是反向重復(fù)序列；它們很少能產(chǎn)生完全切割的片段，因而不具備實(shí)用價(jià)值，也沒有人將其商業(yè)化。

第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一11根據(jù)分離此酶微生物的學(xué)名，一般取3個(gè)字母。第一個(gè)字母大寫該微生物屬名前的第一個(gè)字母第二、三個(gè)字母小寫該微生物種名前的2個(gè)字母第四個(gè)字母大寫有變種或品系的第一個(gè)字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種限制酶，按發(fā)現(xiàn)順序排列

如EcoRⅠ是指從大腸桿菌（Escherichiacoli）R株分離得到的第一種限制酶。（3）限制性核酸內(nèi)切酶的命名第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一12HindIIIHaemophilusinfluenzaed屬名種名株名嗜血流感桿菌d株發(fā)現(xiàn)的第三種限制性內(nèi)切酶第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一13

（4）限制性內(nèi)切酶作用模式圖：（a)產(chǎn)生5′突出粘性末端(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA

5′3′3′5′—OH—P

AATTC*********

G*********5′3′3′5′P

OH—第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一14

(b）產(chǎn)生3′突出粘性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一15

(c）產(chǎn)生平末端(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一16常用的限制性內(nèi)切酶RsaI GTAC CATG BamHI GGATCC CCTAGGNotI GCGGCCGC CGCCGGCGEcoRV GATATC CTATAG 5‘3‘第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一17(6)常用的酶切方法：?jiǎn)蚊盖须p酶切部分酶切：底物濃度低，識(shí)別序列的甲基化，酶用量不足，反應(yīng)時(shí)間不夠以及反應(yīng)緩沖液(5)酶切反應(yīng)體系第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一18（二）DNA連接酶

DNA連接酶是基因工程第二位重要的工具酶。催化兩個(gè)dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′－OH、5′－P連接作用。第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一19(1)DNA片段之間的連接（a）具有互補(bǔ)粘性末端片段之間的連接：

T4DNA連接酶或E.coliDNA連接酶

（b）具有平末端DNA片段之間的連接：

T4DNA連接酶；

第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一20（c）DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接：核酸外切酶：切成平末端末端轉(zhuǎn)移酶：修飾成互補(bǔ)黏性末端堿性磷酸酶：將5’-P修飾成5’-OH（d）DNA片段加連桿后連接人工合成連桿或銜接頭第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一21

EcoRI**********GAATTC********************CTTAAG**********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********

G*********5′3′3′5′

—P

OH—DNA連接酶（2）作用模式圖：a）連接粘性末端第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一22

b）連接平末端AluI*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************T4DNA連接酶第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一23（三）DNA片段末端修飾酶*

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：

使DNA片段平末端的3‘-OH加上同聚核苷酸，產(chǎn)生具有poly(A、T、G、C)的粘性末端，通過DNA連接酶的作用而完成DNA片段和載體間的連接*核酸外切酶：

切去DNA片段的凸出末端，使成為平末端*堿性磷酸酶：

為防止DNA片段末端之間的連接，常采用堿性磷酸酶處理，使DNA末端的5’－P成為5’-OH.第24頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一24（四）DNA聚合酶（1）要有底物4種脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）為前體催化合成DNA;（2）必須有模版；（3）需有引物，不能自行其起始合成新的DNA鏈；（4