種子制備課件

第二章種子制備化學(xué)工業(yè)出版社知識(shí)目標(biāo)1．了解常見(jiàn)工業(yè)微生物的種類，工業(yè)微生物菌種的篩選，微生物選擇性分離的原理，重要工業(yè)微生物的分離。2．理解菌種的選育方法，如誘變育種，抗噬菌體菌株的選育，雜交育種，原生質(zhì)體融合技術(shù)。2能力目標(biāo)1.掌握種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，包括實(shí)驗(yàn)室種子制備，生產(chǎn)車間種子制備，基因重組微生物種子培養(yǎng)。2.掌握種子質(zhì)量的控制，包括影響種子質(zhì)量的因素及控制，種子異常分析。3（1）在較短的發(fā)酵過(guò)程高產(chǎn)有價(jià)值的發(fā)酵產(chǎn)品（2）菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基易獲得，價(jià)格低廉,轉(zhuǎn)化效率高（3）菌種對(duì)人、動(dòng)物、植物和環(huán)境沒(méi)有危害，保證安全（4）菌種發(fā)酵后，所產(chǎn)不需要的代謝產(chǎn)物少，產(chǎn)品分離容易（5）菌種不易變異退化，穩(wěn)定性好一、發(fā)酵工業(yè)對(duì)菌種的要求：

5二、發(fā)酵工業(yè)常用的微生物微生物的代謝產(chǎn)物多達(dá)1300多種，而用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的不足100多種；微生物酶有近千種，而工業(yè)上用的不過(guò)40－50種。因此，微生物具有巨大的潛力可挖掘。6

1.細(xì)菌

大腸桿菌應(yīng)用：生產(chǎn)天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。

7

枯草芽孢桿菌應(yīng)用：生產(chǎn)淀粉酶92.酵母菌種類：酒精酵母、啤酒酵母、假絲酵母紅酵母、面包酵母應(yīng)用：生產(chǎn)酒精、啤酒、石油發(fā)酵脫蠟和制取蛋白質(zhì)、生產(chǎn)脂肪

啤酒酵母的菌落特征啤酒酵母11面包酵母133.霉菌曲霉黑曲霉應(yīng)用：生產(chǎn)有機(jī)酸、生產(chǎn)淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶14黃曲霉應(yīng)用：醬油、醬類（淀粉酶）15

應(yīng)用：可以產(chǎn)生蛋白酶，我國(guó)多用于豆腐乳、豆豉等的制作毛霉17根霉種類：米根霉、華根霉、少根根霉、爪哇根霉應(yīng)用：釀酒1819應(yīng)用：生產(chǎn)青霉素、葡萄糖氧化酶21

4.放線菌種類：龜裂鏈霉菌、金霉素鏈霉菌、灰色鏈霉菌、紅霉素應(yīng)用：各類抗生素。土霉素、四環(huán)素、鏈霉素、紅霉素第二節(jié)菌種的選育1.自然選育把菌種制備成單孢子懸浮液，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南♂屢院?，在固體平板上進(jìn)行分離，挑取部分單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力的測(cè)定，經(jīng)反復(fù)篩選，以確定生產(chǎn)能力更高的菌株代替原來(lái)的菌株從自然界中分離篩選菌種的方法步驟采樣

增殖培養(yǎng)

純種分離純培養(yǎng)生產(chǎn)性能測(cè)定方法、地點(diǎn)、時(shí)間和周圍環(huán)境記錄純種分離的原則就是使培養(yǎng)物獲得單個(gè)菌落：1．稀釋分離法2．平板劃線分離法

⑴

涂菌：

⑵

劃線分離：①分步劃線法；②一次劃線法：

3．組織分離法測(cè)定代謝產(chǎn)物或其它目的性狀252.誘變育種指用人工的方法處理微生物，使它們發(fā)生突變，再?gòu)闹泻Y選出符合要求的突變菌株，供生產(chǎn)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)用。誘變育種與其他育種方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、速度快和收效大的優(yōu)點(diǎn)，至今仍是一種重要的、廣泛應(yīng)用的微生物育種方法。26確定出發(fā)菌株

↓菌種的純化選優(yōu)

↓←出發(fā)菌株的性能鑒定同步培養(yǎng)

↓制備單細(xì)胞（或單孢子）懸液

↓←活菌濃度測(cè)定誘變劑的選擇與確定誘變劑量的預(yù)試驗(yàn)

↓誘變處理

↓平板分離

↓計(jì)形態(tài)變異的菌落數(shù)，計(jì)算突變率挑取疑似突變菌落純培養(yǎng)

↓突變體的初步篩選

↓←用簡(jiǎn)單快捷的方法重復(fù)篩選

↓←搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)選出突變體（根據(jù)情況進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)或重復(fù)誘變處理）29中間培養(yǎng)

處理方法：讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會(huì)出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來(lái)的菌株退化。30分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.例如：初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來(lái)挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再?gòu)?fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。31紫外線的誘變育種紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長(zhǎng)為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為106個(gè)／ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106～107個(gè)／ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。323.基因工程技術(shù)基因工程技術(shù)：是運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的方法。33基本程序⑴含目的基因DNA片段的制備；⑵選擇合適的載體；⑶帶有目的基因的DNA片段與載體在體外連接；⑷將重組的DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增；⑸篩選出帶有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；⑹表達(dá)、鑒定外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。3435操作要點(diǎn)⑴提取目的基因用密度梯度離心方法分別從供體細(xì)胞中提取所需要的DNA即目的基因和作為載體的細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w核酸，目的基因也可通過(guò)化學(xué)方法人工合成。⑵處理目的基因在從供體細(xì)胞中提取出的目的基因中加入專一性很強(qiáng)的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行處理，從而獲得帶有特定基因并暴露出粘性末端的DNA單鏈部分。必要時(shí)這種粘性末端也可用人工方法合成。對(duì)作為載體的細(xì)菌質(zhì)?；蚴删wDNA可采用與處理目的基因同一種類的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行處理，使其形成并暴露出與目的基因相應(yīng)的粘性末端。36⑶體外重組

將上述分別處理過(guò)的目的基因和細(xì)菌質(zhì)粒DNA片段（或噬菌體核酸）放在試管中，在較低溫度（5～6℃）下混合“退火”。由于這兩種DNA是用同一種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行處理，具有相同的粘性末端，因此相互之間能夠形成氫鍵，這就是所謂“退火”。而相鄰的核苷酸，在DNA連接酶的作用下也能形成磷酸二酯鍵，這樣就完成了目的基因與質(zhì)粒DNA（或噬菌體DNA）的重組，得到的是一個(gè)完整的具有復(fù)制能力的環(huán)狀DNA重組體，即“雜種質(zhì)?！保ɑ螂s種噬菌體）。37⑷載體傳遞即通過(guò)載體將供體生物中的遺傳基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞內(nèi)。載體必須具有自我復(fù)制的能力，一般可利用質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化作用或噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，將供體基因帶入受體細(xì)胞內(nèi)。⑸復(fù)制、表達(dá)在理想情況下，進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的雜種質(zhì)粒（或雜種噬菌體），可通過(guò)自我復(fù)制到擴(kuò)增，并使受體細(xì)胞表達(dá)出作為供體細(xì)胞所固有的部分遺傳性狀，成為“工程菌”。⑹篩選、繁殖基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽(yáng)性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。38一、概述1.菌種保藏的目的

使微生物菌種保持原來(lái)的性狀和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交換和使用。2.菌種保藏的原理挑選典型培養(yǎng)物（typicalculture）的優(yōu)良純種，并創(chuàng)造最有利于休眠的環(huán)境條件，使微生物處于代謝不活潑、生長(zhǎng)受抑制的休眠狀態(tài)。菌種保藏的目的與原理393.菌種保藏采取的措施低溫

干燥

缺氧

避光缺乏營(yíng)養(yǎng)添加保護(hù)劑：甘油、脫脂牛奶、血清白蛋白40二、常用的菌種保藏方法1.斜面?zhèn)鞔２胤ǚ椒ǎ航臃N適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏措施：低溫：4℃適用：各大類保藏期：1~6個(gè)月用橡皮塞代替棉塞，可適當(dāng)延長(zhǎng)保藏時(shí)間2.液體石蠟保藏法方法：斜面或半固體接種→培養(yǎng)→加無(wú)菌液蠟高出培養(yǎng)基1cm→4~15℃保藏措施：低溫，隔氧適用：不能利用石油的各大類保藏期：1~2年優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便41斜面菌種冰箱保藏菌種液體石蠟保藏的菌種423.砂土管保藏法

方法：孢子或芽孢懸液→加入無(wú)菌砂土管中→干燥→封口→保藏措施：無(wú)營(yíng)養(yǎng)，缺氧，干燥適用：產(chǎn)孢子（芽孢）微生物保藏期：1~10年4.冷凍干燥保藏方法：菌種培養(yǎng)→用保護(hù)劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結(jié)（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→真空封口→檢查真空度→保藏措施：低溫、干燥，缺氧，有保護(hù)劑適用：各大類保藏期：5~15年或更長(zhǎng)435.甘油管保藏法

方法：菌種培養(yǎng)→15~30%甘油緩沖液懸浮→加入保藏管中→置-70℃冰箱保藏措施：低溫（-70℃）、保護(hù)劑（15~50%甘油）適用：細(xì)菌、酵母菌保藏期：約10年6.液氮保藏法方法：菌種培養(yǎng)→保護(hù)劑懸浮→加入保藏管中→置液氮瓶中措施：超低溫（-196℃）、保護(hù)劑適用：各大類保藏期：>15年

44三、菌種保藏工藝流程1.選擇保藏方法2.配制保藏培養(yǎng)基3.接種培養(yǎng)4.保藏45附錄：菌種保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)CCCCM中國(guó)普通微生物菌種保藏中心CGMCC(歸口中國(guó)科學(xué)院)

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所(AS)中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所(AS-IV)

中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心ACCC(歸口中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院)

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所(ISF)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心CICC(歸口輕工業(yè)總會(huì))

中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究所(IFFI)

46中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心CMCC(歸口衛(wèi)生部)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所(ID)，南京衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所(NICPBP)中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所中國(guó)抗生素微生物菌種保藏中心CACC(國(guó)家醫(yī)藥管理局)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所四川抗生素研究所(SIA)，四川華北制藥廠抗生素研究所(IANP),石家莊

47中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心CVCC(歸口農(nóng)業(yè)部)

農(nóng)業(yè)部獸藥監(jiān)察研究所(NCIVBP)

中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏中心CFCC(歸口中國(guó)林業(yè)科學(xué)院)

中國(guó)林業(yè)科學(xué)院林業(yè)研究所(RIF)

48菌種復(fù)壯菌種的衰退degeneration

生產(chǎn)性狀的劣化,原有典型性狀的不典型等

菌落及細(xì)胞形態(tài)的改變

生長(zhǎng)速度緩慢

代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降

致病菌對(duì)宿主侵染力下降

抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體，抗低溫）能力減弱492.菌種衰退的原因基因自發(fā)突變

退化是發(fā)生在群體細(xì)胞中的一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。

自發(fā)突變率加速退化的因素傳代次數(shù)過(guò)多不適宜的培養(yǎng)條件503.防止衰退的措施（1）控制傳代次數(shù)（2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度等（3）利用不易衰退的細(xì)胞傳代：霉菌、放線菌：無(wú)性孢子或有性孢子（4）采用有效的菌種保藏方法51菌種合理傳代方法之一524菌種的復(fù)壯rejuvenation

狹義復(fù)壯

在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種分離和測(cè)定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。廣義復(fù)壯

在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測(cè)定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體。也稱生產(chǎn)育種。53(1)純種分離法

平板表面涂布法平板劃線分離法瓊脂培養(yǎng)基澆注法用“分離小室”進(jìn)行單細(xì)胞分離用顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離用菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離菌落純（菌種純）細(xì)胞純（菌株純）純種分離法54⑵平板涂布方法55⑶平板劃線方法56(4)淘汰已衰退的個(gè)體

對(duì)S.microflavus“5406”農(nóng)用抗生菌的分生孢子采用-10℃-30℃的低溫處理5-7天，使其死亡率達(dá)到80%左右，結(jié)果會(huì)在抗低溫的存活個(gè)體中留下未退化的個(gè)體，從而達(dá)到復(fù)壯的效果

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第三節(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)一、優(yōu)良種子應(yīng)具備的條件1.菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，延遲期短。2.菌種生理性狀穩(wěn)定，如菌絲形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速率等符合要求。583.菌體濃度及總量能滿足大容量發(fā)酵罐的要求。4.無(wú)雜菌污染。5.能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。59二、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)和培養(yǎng)類型1.任務(wù)：獲得大量的活力強(qiáng)的種子，以便在發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中盡可能地縮短遲滯期。

擴(kuò)大培養(yǎng)的級(jí)數(shù)；放線菌（生產(chǎn)抗生素）三級(jí)放大，（其中鏈霉素須四級(jí)擴(kuò)大）；細(xì)菌生長(zhǎng)較快，用二級(jí)放大培養(yǎng)（斜面菌種→一級(jí)種子搖床培養(yǎng)→二級(jí)種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐）60種子擴(kuò)大培養(yǎng)流程圖1、2-保藏種子3-斜面4-搖瓶5-茄子瓶6-固體培養(yǎng)7、8-種子罐9-發(fā)酵罐612.培養(yǎng)類型

實(shí)驗(yàn)室種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法：①液體培養(yǎng)法（三角瓶搖床振蕩或轉(zhuǎn)式培養(yǎng)）；②固體培養(yǎng)法試管三角瓶茄子瓶62生產(chǎn)車間種子擴(kuò)大培養(yǎng)的方法園盤(pán)制曲機(jī)A、固體培養(yǎng)（曲法培養(yǎng)）63B、液體培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)：目前幾乎所有的好氣發(fā)酵均采用此法；64第四節(jié)種子質(zhì)量控制1.培養(yǎng)基：

選用原則：組分簡(jiǎn)單，來(lái)源豐富，價(jià)格便宜，取