第四章生物免疫分析技術(shù)詳解演示文稿

第四章生物免疫分析技術(shù)詳解演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)優(yōu)選第四章生物免疫分析技術(shù)目前二頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)免疫學(xué)方法在食品分析中正得到越來(lái)越廣泛的運(yùn)用，其中酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）已經(jīng)在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用，它能夠用于測(cè)定人們希望含有的物質(zhì)，以及不希望含有的物質(zhì)。例如現(xiàn)在人們所關(guān)注的食品安全性問(wèn)題中一些物質(zhì)的檢測(cè)：殺蟲(chóng)劑、藥物殘留物、激素、生長(zhǎng)素、微生物毒素、真菌毒素或腸毒素、天然毒素，以及一些添加劑。免疫分析法具備有效的靈敏度、特異性、快速和低成本的優(yōu)點(diǎn)；可對(duì)大量的樣品進(jìn)行常規(guī)分析；能夠用于樣品的定性篩選，也能夠?qū)悠愤M(jìn)行定量測(cè)定以確定樣品中待測(cè)組分的含量。目前三頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)4.1免疫的原理Ag+AbAg－Ab特異性、靈敏性在Ag，Ab反應(yīng)中，用容易示蹤的化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記一種反應(yīng)物，以了解反應(yīng)是否發(fā)生，發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度（即對(duì)未知成分的樣品進(jìn)行定性、定位及定量分析）。目前四頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)4.2酶聯(lián)免疫法免疫酶技術(shù)：把抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來(lái)。它具有免疫熒光試驗(yàn)和放射免疫試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，并克服上述兩種方法的缺點(diǎn)。酶標(biāo)記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長(zhǎng)，免疫酶技術(shù)的敏感性接近放射免疫試驗(yàn)，可直接肉眼觀察也可借助簡(jiǎn)單的儀器作定量測(cè)定，所得結(jié)果比較客觀。目前五頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)酶免疫測(cè)定或免疫酶技術(shù)是指酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。它主要包括兩個(gè)方面：免疫過(guò)氧化物酶法：以過(guò)氧化物酶作為標(biāo)記，與抗原或抗體結(jié)合，然后根據(jù)酶與其底物間所產(chǎn)生的不溶性顏色產(chǎn)物，借助于光學(xué)或電子顯微鏡觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的抗原或抗體。酶聯(lián)免疫吸附法：根據(jù)可溶性抗原或抗體與不溶性固相載體結(jié)合后，還保留其免疫活性，結(jié)合了作為標(biāo)記的酶催化作用。目前六頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)ELISA的基本原理和方法ELISA的種類(lèi)和變化ELISA的特點(diǎn)ELISA的應(yīng)用實(shí)例ELISA目前七頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)4.2.1基本原理它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）目前八頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。目前九頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量成正比，因此可借助于顏色反應(yīng)的深淺來(lái)定量抗體或抗原。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。

其方法簡(jiǎn)單，方便迅速，特異性強(qiáng)。目前十頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)4.2.2酶及其底物

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng)。目前十一頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過(guò)氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

目前十二頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)4.2.3ELISA的種類(lèi)和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競(jìng)爭(zhēng)法（四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測(cè)IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

目前十三頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原目前十四頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)步驟：A將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；B加入待檢標(biāo)本溶液，使溶液中的抗原與吸附的抗體結(jié)合，溫育后清洗；C加入酶標(biāo)記特異性抗體，溫育后清洗；D加入酶作用底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顏色的改變與所加的待檢標(biāo)本溶液中的抗原量成正比。目前十五頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法目前十六頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)步驟：A將已知可溶性抗原吸附于載體（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），經(jīng)溫育后清洗；B加入待檢稀釋血清，若血清中有相應(yīng)特異性抗體存在則與吸附的抗原結(jié)合，溫育后清洗；C加入酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體，此時(shí)酶標(biāo)記抗體與吸附的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，溫育后清洗；D加入酶作用底物（或稱基質(zhì)），酶分解底物并顯色，用光電比色計(jì)測(cè)定底物顯色深淺，即可推知抗體量。目前十七頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)（三）競(jìng)爭(zhēng)法

此法可用于檢測(cè)小分子抗原。目前十八頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)步驟：A將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗；B將可能含抗原的待檢溶液和酶標(biāo)記的已知抗原溶液以適當(dāng)比例混合，加入已包被的載體孔中，溫育后清洗；C加入酶作用的底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)。色深表示結(jié)合的酶標(biāo)記抗原多，而待檢溶液中未標(biāo)記的抗原量少；反之，色淺表示結(jié)合的酶標(biāo)記抗原少，而待檢溶液中抗原量多。目前十九頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測(cè)定管的顯色程度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果而異。如待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。目前二十頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)4.2.4特點(diǎn)特點(diǎn)一：靈敏性該測(cè)定法的靈敏度來(lái)自酶。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。例如，在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí)，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5～10μg/ml。目前二十一頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)特點(diǎn)二：特異性其特異性來(lái)自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

目前二十二頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來(lái)源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測(cè)定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。目前二十三頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)ELISA應(yīng)用實(shí)例目前二十四頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素，簡(jiǎn)曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門(mén)氏菌）甲胺磷殘留分析甲基對(duì)硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)目前二十五頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類(lèi)毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲(chóng)劑兩大類(lèi)例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥的檢測(cè)：目前二十六頁(yè)\總數(shù)三十二頁(yè)\編于十七點(diǎn)ELISA檢測(cè)“非典型肺炎”冠狀病毒ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的應(yīng)用檢測(cè)抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（PtA）33抗體ELISA在疾病診斷中的作用ELISA法檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌抗體目前二