重組DNA技術(shù)及基因工程藥物

重組DNA技術(shù)及基因工程藥物第1頁/共108頁2生物技術(shù)(biotechnology)

又稱生物工藝學(xué),生物工程學(xué)。是根據(jù)生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的經(jīng)營和開發(fā)微生物、動植物細(xì)胞及其亞細(xì)胞組分,進(jìn)而利用生物體所具有的功能元件(如基因、蛋白質(zhì))等來提供商品或社會服務(wù)的一門綜合性科學(xué)技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)(ModenBiotechnology)

主要指基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程。第2頁/共108頁3生物技術(shù)與遺傳因子的發(fā)現(xiàn)孟德爾進(jìn)行的豌豆雜交實(shí)驗(yàn)—經(jīng)典的生物技術(shù)。第3頁/共108頁4

基因工程(geneengineering)

又稱基因操作(genemanipulation),重組DNA(recombinantDNA)。基因工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ),以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段,將不同來源的基因(DNA分子),按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子,然后導(dǎo)入活細(xì)胞,以改變生物原有的遺傳特性,獲得新品種,生產(chǎn)新產(chǎn)品,或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能。第4頁/共108頁5現(xiàn)代生物技術(shù)第5頁/共108頁6遺傳工程(geneticengineering)一詞產(chǎn)生于19世紀(jì)20年代，是遺傳學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)科學(xué)。借用工程技術(shù)上的設(shè)計(jì)思想,在離體條件下,對生物細(xì)胞、細(xì)胞器、染色體或DNA分子進(jìn)行按圖施工的遺傳操作,以求定向地改造生物的遺傳性。遺傳工程的概念有廣義和狹義之分。廣義的遺傳工程包括傳統(tǒng)遺傳操作中的雜交技術(shù)和現(xiàn)代遺傳操作中的基因工程和細(xì)胞工程,狹義的遺傳工程僅指基因工程。第6頁/共108頁7細(xì)胞工程(cellengineering)◆應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)的原理和方法,結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段,按照人們預(yù)先的設(shè)計(jì),有計(jì)劃地改變或創(chuàng)造細(xì)胞遺傳性的技術(shù),以及在體外大量培養(yǎng)和繁殖細(xì)胞,或獲得細(xì)胞產(chǎn)品,或利用細(xì)胞體本身的技術(shù)領(lǐng)域?！糁饕獌?nèi)容包括細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)移、細(xì)胞或組織培養(yǎng)等。由于所用細(xì)胞的來源不同，細(xì)胞工程又分為微生物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程、動物細(xì)胞工程等。第7頁/共108頁8細(xì)胞工程技術(shù)第8頁/共108頁9

細(xì)胞分泌工程

(cellsecretionengineering)

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和運(yùn)輸理論而發(fā)展起來的一項(xiàng)新的細(xì)胞工程技術(shù)，主要是通過對基因改造，如基因缺失、多效分泌突變、周質(zhì)泄漏突變或加接信號肽等措施，促進(jìn)基因產(chǎn)物分泌的技術(shù)。第9頁/共108頁10乳腺生物反應(yīng)器第10頁/共108頁11酶工程(enzymeengineering)◆又稱酶技術(shù)。它是圍繞著酶所特有的生化催化特性,結(jié)合現(xiàn)代的技術(shù)手段,在體外模擬或在常溫常壓下生成酶反應(yīng)的產(chǎn)品以及利用重組DNA技術(shù)定向改變酶,進(jìn)行酶的修飾,或酶的全人工合成?！羝渲饕獌?nèi)容包括酶的化學(xué)修飾、酶的固定化、酶反應(yīng)器等。第11頁/共108頁12蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)◆是更廣義上的包括酶工程在內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾操作,通過對蛋白質(zhì)及酶的化學(xué)修飾及基因改造獲得具有特殊功能的非天然蛋白質(zhì)的技術(shù)?！糁饕歉鶕?jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能間的相互關(guān)系,利用基因工程技術(shù),或用化學(xué)方法,合成基因,改造基因,以便合成新的蛋白質(zhì),或改變蛋白質(zhì)的活性、功能以及溶解性等。第12頁/共108頁13發(fā)酵工程(fermentationengineering)

◆又稱微生物工程,微生物發(fā)酵工程?！衾蒙?主要是微生物的某種特定功能,通過現(xiàn)代化工程技術(shù)手段,生產(chǎn)有用物質(zhì),或把微生物直接用于某種工業(yè)化生產(chǎn)的一種技術(shù)體系?！糁饕獌?nèi)容包括菌種選育,發(fā)酵生產(chǎn)微生物,或植物細(xì)胞的代謝產(chǎn)物,生產(chǎn)微生物菌體,最佳培養(yǎng)條件的優(yōu)化組合等。

第13頁/共108頁14傳統(tǒng)的發(fā)酵工業(yè)第14頁/共108頁15二、基因工程技術(shù)第15頁/共108頁16什么是基因工程?第16頁/共108頁17

基因工程是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的遺傳學(xué)的一個(gè)分支學(xué)科第17頁/共108頁18基因克隆操作第18頁/共108頁19◆創(chuàng)建基因工程技術(shù)的兩位大師第19頁/共108頁20

第一個(gè)重組體的構(gòu)建

1972年，美國斯坦福大學(xué)P.Berg等在PNAS上發(fā)表了題為∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。第20頁/共108頁21第一個(gè)重組DNA分子構(gòu)建該圖得到的啟發(fā)：◆Berg的學(xué)科背景◆成功的秘訣●嚴(yán)密的思維●科學(xué)的設(shè)計(jì)第21頁/共108頁22

第一個(gè)有功能重組體的構(gòu)建◆雖然Berg的工作具有劃時(shí)代的意義，但是他們并沒有證明體外重組的DNA分子具有生物學(xué)功能?！?973年，S.N.Cohen等在美國PNAS上發(fā)表了題為“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”

（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）的論文，宣布體外構(gòu)建的細(xì)菌質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),從而完善了Berg開創(chuàng)的基因重組技術(shù)。第22頁/共108頁23質(zhì)粒

pSC101

的獲得質(zhì)粒對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)突破Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻(xiàn)如何給DNA分子做手術(shù)

？第23頁/共108頁24BoyerandEcoRI第24頁/共108頁25CohenandBoyer的策略第25頁/共108頁26基因克隆的五個(gè)基本步驟

◆目標(biāo)DNA的制備◆DNA的酶切◆“乘客”DNA與載體DNA的連接◆DNA導(dǎo)入細(xì)菌◆克隆的分離第26頁/共108頁27DNA克隆的基本過程第27頁/共108頁28

基因工程的主要目的是通過基因“移民”來改造生物的遺傳性,幫助基因“移民”的工具就是分子運(yùn)載體。基因工程的目的第28頁/共108頁29基因工程與基因移民第29頁/共108頁30基因工程的特點(diǎn)◆基因工程有兩個(gè)基本的特點(diǎn)∶分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的表達(dá)。◆基因工程技術(shù)的誕生使人們能夠在試管里進(jìn)行分子水平上的操作，象一項(xiàng)工程那樣，進(jìn)行按圖施工的操作，構(gòu)建在生物體內(nèi)難以進(jìn)行的重組體，然后將重組的遺傳物質(zhì)引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，讓其在宿主細(xì)胞中進(jìn)行工作?！暨@實(shí)際上是進(jìn)行無性繁殖，即克隆，所以基因工程通常又稱為基因克隆。第30頁/共108頁31基因工程的思維導(dǎo)圖第31頁/共108頁32三、生物技術(shù)應(yīng)用第32頁/共108頁33植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)第33頁/共108頁34植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)：基因槍法第34頁/共108頁35植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)第35頁/共108頁36植物轉(zhuǎn)基因：抗蟲植物第36頁/共108頁37轉(zhuǎn)基因抗病植物第37頁/共108頁38植物生產(chǎn)抗體第38頁/共108頁39轉(zhuǎn)基因花第39頁/共108頁40動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)第40頁/共108頁41轉(zhuǎn)基因豬第41頁/共108頁42轉(zhuǎn)基因動物：生物技術(shù)制藥第42頁/共108頁43體細(xì)胞克隆技術(shù)第43頁/共108頁44英國科學(xué)家克隆的羊：多莉第44頁/共108頁45克隆羊:多莉產(chǎn)生的過程第45頁/共108頁46克隆馬第46頁/共108頁47中國克隆豬的誕生第47頁/共108頁48基因器官移植第48頁/共108頁49產(chǎn)前診斷第49頁/共108頁50基因治療第50頁/共108頁511990年9月14日美國政府批準(zhǔn)了世界上第一項(xiàng)人類基因治療臨床研究方案，對一名患有重度聯(lián)合免疫缺陷癥(severecombinedimmunodeficiencydisease,SCID)的兒童進(jìn)行基因治療并獲得成功，從而開創(chuàng)了醫(yī)學(xué)的新紀(jì)元。第51頁/共108頁52基因制藥第52頁/共108頁53細(xì)菌生產(chǎn)胰島素第53頁/共108頁54↓DNA破案↑親子鑒定第54頁/共108頁55基因工程與優(yōu)生第55頁/共108頁56四、生物技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)第56頁/共108頁57科學(xué)是一把雙刃劍

基因克隆與細(xì)胞克隆的風(fēng)險(xiǎn)第57頁/共108頁58人能復(fù)制嗎?第58頁/共108頁59轉(zhuǎn)基因食品可食嗎?第59頁/共108頁60第60頁/共108頁61◆美國加州的文特利亞(Ventria)公司資助一位秘魯科學(xué)家將人的基因轉(zhuǎn)入水稻；◆將人的兩種基因轉(zhuǎn)入水稻后，水稻能夠合成人的兩種蛋白：乳鐵傳鐵蛋白和鹽酸溶菌酶，吃了這種轉(zhuǎn)基因稻米可以防治兒童腹瀉。第61頁/共108頁62第62頁/共108頁63生物安全與公眾知情權(quán)第63頁/共108頁64基因克隆會玷污奧林匹克精神嗎?第64頁/共108頁65五、現(xiàn)代生物技術(shù)與人基因組計(jì)劃第65頁/共108頁66我究竟是從哪里來的呢?第66頁/共108頁67母親養(yǎng)育我們第67頁/共108頁68梅花間竹龍鳳四胞胎第68頁/共108頁69250公斤體重的媽媽第69頁/共108頁70人基因組計(jì)劃的由來與基本內(nèi)容第70頁/共108頁71人類歷史上三大工程◆阿波羅登月計(jì)劃◆曼哈頓原子彈計(jì)劃◆人類基因組計(jì)劃

1990年10月1日正式啟動第71頁/共108頁72美國國會批準(zhǔn)的美國“人類基因組計(jì)劃”：◆于1990年10月1日正式啟動◆總體計(jì)劃是在15年內(nèi)：●投入至少30億美元●進(jìn)行人類全基因組的分析第72頁/共108頁73人類基因組計(jì)劃的國際協(xié)作共有6個(gè)國家：美、日、德、法、英、中。◆1999年9月，我國獲準(zhǔn)加入了這一研究計(jì)劃，負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列的1％，也就是3號染色體上的3000萬個(gè)堿基對◆我國科學(xué)家僅用了半年時(shí)間，在2000年4

月底按照國際人類基因組計(jì)劃的部署，完成了1%人類基因組的工作框架圖。第73頁/共108頁74生物技術(shù)與人基因組計(jì)劃的研究策略第74頁/共108頁75測序策略：鳥槍法第75頁/共108頁76測序組裝過程8個(gè)隨機(jī)測讀片段（10-20bp）計(jì)算機(jī)進(jìn)行組裝最后得到長72bp長片段第76頁/共108頁77Sequencingagenomicbyusinganoverlappingclonemap測序構(gòu)建重疊群與組裝第77頁/共108頁78構(gòu)建亞克隆庫第78頁/共108頁79末端配對測序第79頁/共108頁80

ideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應(yīng)終止劑可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般1：3~4)測序方法：雙脫氧法第80頁/共108頁81基因組學(xué)家們巧妙地將在制造業(yè)中使用的機(jī)器人擴(kuò)大化利用以增加測序的通量，提高可靠性和精確性

第81頁/共108頁82亞克隆測序的創(chuàng)新放射性標(biāo)記平板凝膠電泳

兩大革新：

熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳大大提高了測序的效率1.4個(gè)鏈終止反應(yīng)可以在同一個(gè)體系中進(jìn)行也可以在同一個(gè)泳道中進(jìn)行電泳2.實(shí)時(shí)地自動檢測1.無需費(fèi)時(shí)的灌膠點(diǎn)樣工序2.同一個(gè)毛細(xì)管可以被多次使用3.整個(gè)測序反應(yīng)都是機(jī)器人操作進(jìn)行革新點(diǎn)第82頁/共108頁83早期的DNA測序分成4個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)進(jìn)行延長后的DNA片段被放射性同位素標(biāo)記（主要是32P和35S）曝于X射線下進(jìn)行DNA的檢測不同顏色熒光標(biāo)記的ddNTPs半自動化的測序機(jī)器進(jìn)行DNA的測序

第83頁/共108頁84

人基因組測序完成第84頁/共108頁85第85頁/共108頁86

人類基因組計(jì)劃的意義及影響第86頁/共108頁871.加快腫瘤發(fā)病機(jī)理的研究◆惡性腫瘤起源于細(xì)胞增殖與分化調(diào)控的失常以及細(xì)胞同周圍組織的關(guān)系的紊亂;◆癌基因的激活或失活的發(fā)生，大都由于體細(xì)胞中相關(guān)基因突變所致;◆腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移也涉及于基因表達(dá)的失控。

HGP不僅會推動癌變原理研究，還將開辟從基因水平治療惡性腫瘤的新途徑。第87頁/共108頁88心血管疾病分子機(jī)理研究◆分離心血管病患者的異常基因，有利于發(fā)病機(jī)理研究?！裟承┡c遺傳因素相關(guān)的疾患，像家族性高血壓、家族性高脂蛋白癥等異?；蛞芽寺?。第88頁/共108頁89基因診斷與基因治療

基因治療是指通過外源基因?qū)肴梭w以糾正基因缺陷的療法。因此，正常基因的分離、鑒定以及其正確的表達(dá)是開展基因治療的基礎(chǔ)條件。第89頁/共108頁90基因診斷第90頁/共108頁91

搶基因的世紀(jì)之戰(zhàn)

目前世界上正在進(jìn)行一場“搶基因”的“世紀(jì)之戰(zhàn)”

,其根本動力是基因可以淘金，從一個(gè)肥胖基因能價(jià)值9000萬美元中，人們更悟清了這個(gè)道理。2.基因淘金與基因經(jīng)濟(jì)第91頁/共108頁92DNA雙螺旋與淘金車第92頁/共108頁93“基因土地”的分割◆90年代的人類基因組計(jì)劃就象16世紀(jì)全球掀起的“新大陸探險(xiǎn)熱”。◆人類基因組的研究就是人類基因組中的“地理探險(xiǎn)”，尋找新基因和搞清楚基因組結(jié)構(gòu)與功能的過程恰如開墾地球上的每一塊處女地。第93頁/共108頁94基因版圖第94頁/共108頁95哮喘病相關(guān)基因的研究材料◆取自僅有301個(gè)居民的南大西洋一個(gè)小島(全部是近親婚配，1／3的人患有嚴(yán)重哮喘)；◆我國浙江象山的一個(gè)大家系在內(nèi)的幾個(gè)大家系；◆通過對芬蘭發(fā)現(xiàn)的諸多大家系研究，已成功地克隆了至少12個(gè)基因。◆目前，實(shí)際上已形成了一個(gè)被普遍接受的簡單關(guān)系式，即:

遺傳病家系＝基因＝money（錢）第95頁/共108頁96人類基因組計(jì)劃與倫理第96頁/共108頁97基因有沒有好壞之分?◆當(dāng)我們說某個(gè)基因引起疾病時(shí)，稱它為“致病基因”或“有害基因”。但有時(shí)被認(rèn)為致病的基因也可以在一定情況下對機(jī)體起保護(hù)作用?！衾缭诜侵蓿S多人患有鐮形細(xì)胞癥，這是基因引起的。但非洲又有致命的惡性瘧疾，帶有可引起鐮形細(xì)胞癥基因的攜帶者卻比不帶有該基因的健康人更能抵御惡性瘧疾?！?/p>