第一章分子克隆技術(shù)概述

第一章分子克隆技術(shù)概述第1頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三本課程的主要內(nèi)容分子克隆概述基因克隆工具酶基因克隆載體和宿主目的基因的分離基因克隆操作過程基因克隆的策略目的基因在宿主中的表達(dá)第2頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三參考書目資料《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第三版）：美J.薩姆布魯克等著,黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2008.《GeneIX》：BenjaminLewin編著.《基因工程原理》：吳乃虎，科學(xué)出版社，1998.《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》：郜金榮，葉林柏，武漢大學(xué)出版社，2007.《基因工程》：張惠展，華東理工大學(xué)出版社，2005.生物網(wǎng)址通：/螺旋網(wǎng)：/bbs/生命科學(xué)論壇：/bbs/index.php丁香園：/bbs/index.html第3頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第4頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第5頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三課程考核方式考試要求：閉卷筆試考試目的：測評(píng)運(yùn)用分子克隆技術(shù)原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)解決實(shí)際問題的能力總評(píng)成績：考試成績（80%）平時(shí)成績（20%，課堂+考勤）第6頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第一章分子克隆技術(shù)概述第7頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三一、基本概念基因

從化學(xué)上說，指的是一段DNA或RNA序列，該序列可以產(chǎn)生或影響某種表型（phenotype）；從遺傳學(xué)上說，基因代表一個(gè)遺傳單位，一個(gè)功能單位，一個(gè)突變單位。第8頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第9頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三分子克隆技術(shù)

又稱為重組DNA技術(shù)，是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。

供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。第10頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三基因工程（geneticengineering）

基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。

基因工程的基本特點(diǎn)是，分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)。

第11頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第12頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第13頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三

我們應(yīng)該記住他們——1.第一個(gè)實(shí)現(xiàn)DNA重組的人－Berg1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，經(jīng)過連接組成重組的DNA分子。Berg是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)DNA重組的人。

2.第一個(gè)取得基因工程成功的人－Cohen

1973年，CohenGroup將E.coli的tetr質(zhì)粒psclol和nersrR6-3質(zhì)粒進(jìn)行體外限制酶切割，并連接成一個(gè)新的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli，在含四環(huán)素和新霉素的平板上篩選出了terrNer的轉(zhuǎn)化子,實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移。這是基因工程史上的第一個(gè)克隆并取得成功的例子，這一年被定為基因工程誕生的元年。第14頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三PscloltetrRb-3nersrtetrnertetr

nerOtetrnerCohenGroup第一次實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀轉(zhuǎn)移示意圖第15頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三二、分子克隆技術(shù)的理論基礎(chǔ)19世紀(jì)中孟德爾豌豆雜交試驗(yàn)確定遺傳因子20世紀(jì)初摩爾根果蠅雜交實(shí)驗(yàn)確定基因20世紀(jì)40年代，Avery發(fā)現(xiàn)了生物遺傳物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是DNA20世紀(jì)50年代，Watson-crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，揭示了生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制20世紀(jì)60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式：DNA→RNA→Protein,破譯了全部遺傳密碼第16頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三三、分子克隆的技術(shù)準(zhǔn)備1．“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

（1）20世紀(jì)40－60年代，科學(xué)家們就為基因工程設(shè)計(jì)了美好的藍(lán)圖，但是面對(duì)龐大的dsDNA束手無策，無從下手把它切成單個(gè)基因片斷。（2）當(dāng)時(shí)的酶學(xué)知識(shí)已有相當(dāng)?shù)陌l(fā)展，但是沒有一個(gè)已發(fā)現(xiàn)的酶能完成這樣的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血桿菌（Haemophilusinffuenzae）分離純化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁錮，迎來了改造生物的春天，為基因工程奠定了最為重要的技術(shù)基礎(chǔ)。第17頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三

2．(“交通工具車子”)——載體

（1）有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個(gè)“車子”將重組DNA送到宿主細(xì)胞中去。（2）1946年起，Lederberg開展了細(xì)菌性因子（F因子）的研究。50-60年代相繼發(fā)現(xiàn)了R因子（抗藥因子），CoE(大腸桿菌因子)等質(zhì)粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能將質(zhì)粒作為基因工程載體使用（至今一直是基因工程最重要最廣泛使用的載體）。這是基因工程的第二個(gè)技術(shù)準(zhǔn)備。第18頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三

3．逆轉(zhuǎn)錄酶－1970年Baltimove和Temin等同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學(xué)（生物學(xué)）中心法則，使真核基因的制備成為可能。（原因如下）（1）真核基因組龐大而復(fù)雜，不易制得基因圖譜。（2）即使有了基因圖譜，因?yàn)檎婧嘶蛴袃?nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應(yīng)得產(chǎn)物。（3）經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA(complementoryDNA)得到的cDNA文庫要比基因組文庫小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。有了這些理論和技術(shù)的武裝，基因工程的臨盆降生指日可待，Berg和Cohen兩位科學(xué)的“助產(chǎn)士”，把基因工程接到了人間。第19頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三四、分子克隆的技術(shù)支撐核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子連接技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點(diǎn)突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)第20頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三核酸凝膠電泳第21頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)（包括感受態(tài)細(xì)胞制備）第22頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三DNA序列分析技術(shù)第23頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)第24頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三五、分子克隆技術(shù)的應(yīng)用分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計(jì)、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種第25頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理生物信息資源第26頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)野生細(xì)胞野生細(xì)胞分離工程酶分離工程基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程

工程細(xì)胞發(fā)酵工程酶工程細(xì)胞工程生物活性物質(zhì)第27頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三第28頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三

TheteamthatclonedDollywaiteduntilshewassevenmonthsoldtoannounceherexistence.Creatinghertook277tries,andrightupuntilherbirth,scientistsaroundtheworldweresayingthatcloningamammalfromanadultcellwasimpossible.Theveryfactthatatthismoment,theresearchisproceedingunderground,unaccountable,posesarealthreat設(shè)計(jì)、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種第29頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三多利誕生的過程

為什么震驚和驚呼，我們先了解一下多利誕生的過程以及胚胎細(xì)胞克隆和體細(xì)胞克隆的區(qū)別這兩個(gè)基本問題，對(duì)我們學(xué)習(xí)后面內(nèi)容或許有所幫助和啟發(fā)。多利誕生的過程：

1.取出第一只成年母羊乳腺的普通細(xì)胞，分離基因備用。

2.取出第二只母羊未受精的卵細(xì)胞，取出基因換上第一只羊乳腺細(xì)胞基因（“掉包”），放電激活該卵細(xì)胞，使之象正常受精卵一樣進(jìn)行細(xì)胞分裂，直至一定階段，胚胎成熟。

3.將成熟的胚胎移植到第三只母羊子宮中發(fā)育，妊娠（同正常一樣），最后產(chǎn)下多利。這樣一只與第一只羊基因百分之百一樣的復(fù)制品誕生了。

第30頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三Itchallengesthelawsofnature,theevolutionofalllivingthings.第31頁，共34頁，2023年，2月20日，星期三基因工程克隆技術(shù)是人類對(duì)自然的干預(yù)

經(jīng)典的遺傳學(xué)千百萬年才能積累出現(xiàn)的有利的變異，通過基因工程手段幾