二代測(cè)序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

二代測(cè)序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用魏冬凱目前一頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)概要二代測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介常見(jiàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案石蠟包埋樣本解決方案CTC和ctDNA目前二頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)二代測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介目前三頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)人類(lèi)基因組

HumanGenome30億對(duì)堿基來(lái)自母親30億對(duì)堿基來(lái)自父親線(xiàn)粒體基因組來(lái)自母親與人類(lèi)共生的微生物基因組目前四頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)DNA的構(gòu)成目前五頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)末端終止法測(cè)序目前六頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)ABI3700(ABI3730)目前七頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)人類(lèi)基因組計(jì)劃(HGP)人類(lèi)基因組計(jì)劃(humangenomeproject,HGP)是由美國(guó)科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動(dòng)的。美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、日本和我國(guó)科學(xué)家共同參與了這一預(yù)算達(dá)30億美元的人類(lèi)基因組計(jì)劃。按照這個(gè)計(jì)劃的設(shè)想，最終要把人體內(nèi)約4萬(wàn)個(gè)基因的密碼全部解開(kāi)，同時(shí)繪制出人類(lèi)基因的譜圖。換句話(huà)說(shuō)，就是要揭開(kāi)組成人體4萬(wàn)個(gè)基因的30億個(gè)堿基對(duì)的秘密。人類(lèi)基因組計(jì)劃與曼哈頓原子彈計(jì)劃和阿波羅計(jì)劃并稱(chēng)為三大科學(xué)計(jì)劃。被譽(yù)為生命科學(xué)的“登月計(jì)劃”。目前八頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)CeleraGenomicsCraigVenter成立第一個(gè)使用全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序使用330臺(tái)ABI3700，購(gòu)買(mǎi)當(dāng)時(shí)世界排名第三的服務(wù)器進(jìn)行運(yùn)算，花費(fèi)3個(gè)月時(shí)間對(duì)Venter的基因組進(jìn)行測(cè)序，得到20GB數(shù)據(jù)。目前九頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)Ventor基因組測(cè)序基于分子克隆，必須將DNA片段克隆至大腸桿菌中，否則無(wú)法測(cè)序。每次末端終止反應(yīng)體系10ul，其中含有1013個(gè)DNA分子，但每次只能測(cè)其中1條。預(yù)計(jì)花費(fèi)2億美金，最終花費(fèi)30億美金！怎樣才能降低試劑消耗？目前十頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)降低消耗的辦法1.將分子克隆替換成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），先給DNA片段加上尾巴。

橋式PCR2.降低反應(yīng)體積把測(cè)序反應(yīng)裝到小的空間里去。10ul的試劑做更多的DNA測(cè)序反應(yīng)。目前十一頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)降低消耗的辦法1.將分子克隆替換成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），先給DNA片段加上尾巴。

橋式PCR2.降低反應(yīng)體積把測(cè)序反應(yīng)裝到小的空間里去。10ul的試劑做更多的DNA測(cè)序反應(yīng)。目前十二頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)橋式PCR目前十三頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)二代測(cè)序（NGS）目前十四頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)邊合成邊測(cè)序（SBS）Flowcell目前十五頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)SBS技術(shù)特點(diǎn)讀長(zhǎng)最初的時(shí)候只有31bp，現(xiàn)已能達(dá)到600bp。運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，熒光信號(hào)會(huì)逐漸減弱。每次只能結(jié)合1個(gè)堿基，發(fā)出一種熒光信號(hào)。目前十六頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)Hiseq2500可同時(shí)運(yùn)行2張8通道flowcell有高通量模式和快速模式2種模式。單次運(yùn)行數(shù)據(jù)量高達(dá)500GB?？焖倌Ｊ阶疃踢\(yùn)行時(shí)間17小時(shí)。目前十七頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)常見(jiàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案目前十八頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)二代測(cè)序應(yīng)用醫(yī)療的可行性目前十九頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)NGS的優(yōu)勢(shì)相比于一代測(cè)序，NGS更加省時(shí)低成本，速度快，覆蓋度深，準(zhǔn)確度高；高通量測(cè)序人類(lèi)基因組有助于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的未知基因；對(duì)于疾病引起的基因突變，高通量測(cè)序可以為患者醫(yī)師提供更為準(zhǔn)確的診斷依據(jù)；需求樣本類(lèi)型廣泛，樣本量需求少。目前二十頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)常見(jiàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案全基因組重測(cè)序（WGRS）尋找個(gè)體突變，InDel，CNV，SV等等，需求數(shù)據(jù)量大，單個(gè)樣本需求90G數(shù)據(jù)。全外顯子組測(cè)序（WES）捕獲基因組中的全外顯子進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)量較WGRS少很多，并能獲得高測(cè)序深度（50X-150X）目前二十一頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)常見(jiàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案靶向區(qū)域測(cè)序（TargetSequencing）捕獲富集感興趣的靶向區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，技術(shù)流程與全外顯子捕獲相似，測(cè)序需求量較WES少，能獲得更高測(cè)序深度（最高500X）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）研究轉(zhuǎn)錄水平上的測(cè)序，包括mRNA，lncRNA，microRNA等。目前二十二頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)全基因組重測(cè)序是對(duì)基因組序列已知的個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序，并在個(gè)體或群體水平上進(jìn)行差異性分析的方法。隨著基因組測(cè)序成本的不斷降低，人類(lèi)疾病的致病突變研究由外顯子區(qū)域擴(kuò)大到全基因組范圍。通過(guò)構(gòu)建不同長(zhǎng)度的插入片段文庫(kù)和短序列、雙末端測(cè)序相結(jié)合的策略進(jìn)行高通量測(cè)序，實(shí)現(xiàn)在全基因組水平上檢測(cè)疾病關(guān)聯(lián)的常見(jiàn)、低頻、甚至是罕見(jiàn)的突變位點(diǎn)，以及結(jié)構(gòu)變異等，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價(jià)值。全基因組重測(cè)序(WGRS/DNA-Seq)目前二十三頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)SNP（個(gè)體間差異）CNV（大片段基因拷貝數(shù)變異）InDelSV（結(jié)構(gòu)變異）全基因組重測(cè)序的應(yīng)用目前二十四頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)SNP(SNV)目前二十五頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)示例目前二十六頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)為何研究SNP？SNP目前已被公認(rèn)為疾病發(fā)生的基因分子標(biāo)記。SNP被認(rèn)為是導(dǎo)致藥物差異化的主要因素之一，因此可以根據(jù)SNP的變化來(lái)進(jìn)行個(gè)性化用藥。SNP分布廣泛，且較為穩(wěn)定。某些SNP會(huì)直接影響功能基因表達(dá)。目前二十七頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)大多數(shù)的SNP都是無(wú)用的大多數(shù)的SNP屬于沉默突變。非編碼區(qū)的錯(cuò)義突變也不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生改變。目前二十八頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)但也有例外目前二十九頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)診斷實(shí)例：Dr.JamesGern和JosephDeRisi合作，用MiSeqDx從一個(gè)病危的十幾歲的男孩的腦脊液中抽提出核酸樣本，測(cè)了8百萬(wàn)條核酸序列，從中檢出了475條鉤端螺旋體的序列，從而判定這個(gè)男孩的病是因?yàn)殂^端螺旋體感染。Dr.JamesGern依據(jù)上述的判斷，給男孩青霉素治療，治好了這個(gè)男孩的病。腦脊液是較難取得的體液，只能是采集很少的量，這就限制了所能得到的核酸總量。鉤端螺旋體，在病原體的常見(jiàn)程度排名中是較靠后的種類(lèi)。在本案例中，如果用PCR方法，挨個(gè)排查病原體，可能還沒(méi)排到鉤端螺旋體，核酸就不夠了。但高通量測(cè)序克服了核酸量不夠的問(wèn)題。在本案例中，鉤端螺旋體DNA只占總DNA的萬(wàn)分之0.6，含量極微，但經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序，得到了475條鉤端螺旋體的DNA，這讓鉤端螺旋體無(wú)處循形。目前三十頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)2009年H1N1病毒爆發(fā)感染時(shí)，有一名病人死于呼吸系統(tǒng)引起的多器官衰竭，然而并不知道具體的死因?？茖W(xué)家把病人的肺部穿刺組織的DNA拿來(lái)做高通量測(cè)序。最終在950萬(wàn)條序列中，含有0.85%的序列來(lái)自于H1N1病毒基因組，從而幫助科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了該病人的真正死因。在這樣高人類(lèi)基因組干擾的背景下，目前其他技術(shù)都難以快速發(fā)現(xiàn)致病病毒序列、以及分子分型。Kuroda,M.,Katano,H.,Nakajima,N.,Tobiume,M.,Ainai,A.,Sekizuka,T.,…Sata,T.(2010)..PloSOne,5目前三十一頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)Nimblegen

(Roche)SureSelect(Agilent)RNAOligoTrusight

(Illumina)全外顯子測(cè)序（WES）目前三十二頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)癌癥相關(guān)（人）遺傳性疾?。ㄈ耍┢渌莻魅拘约膊。ㄈ耍┲饕糜趯ふ液币?jiàn)突變，遺傳性突變及癌癥相關(guān)的體細(xì)胞突變可以做SNP，InDel分析，但由于捕獲區(qū)域較短，一般不用于CNV，SV分析。WES應(yīng)用領(lǐng)域目前三十三頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)成本低（一般50-150X，也僅需要8-15G數(shù)據(jù)）降低分析背景，容易發(fā)現(xiàn)稀有突變。大約能測(cè)到50-80bp的片段缺失，由于外顯子捕獲芯片片段較短，很難判斷是由捕獲脫靶導(dǎo)致還是由缺失導(dǎo)致。同樣因?yàn)椴东@芯片片段較短，一般不做CNV，SV分析。WES特點(diǎn)目前三十四頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)WES方案流程目前三十五頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等。可以高通量分析轉(zhuǎn)錄本信息，發(fā)現(xiàn)未知的轉(zhuǎn)錄本和基因注釋。尋找個(gè)體間，同一個(gè)體不同時(shí)期等感興趣基因表達(dá)豐度變化。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)目前三十六頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)mRNA-Seq方案目前三十七頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)有關(guān)lncRNA的一些知識(shí)：長(zhǎng)度大于200bp無(wú)法編碼蛋白有內(nèi)含子區(qū)和外顯子區(qū)非編碼RNA具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，如對(duì)染色體結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)RNA加工修飾及穩(wěn)定性的影響，對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，甚至對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定性都有一定的影響。所以近年來(lái)，許多通過(guò)RNA-seq進(jìn)行測(cè)序分析的文章都包括對(duì)lncRNA的分析，并且發(fā)現(xiàn)了許多新的lncRNA。目前三十八頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)lncRNA-Seq目前三十九頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)sRNA-Seq目前四十頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)RNA-seq的優(yōu)勢(shì)不局限于已知的基因組序列信息，適用于未知基因組序列的物種的高通量轉(zhuǎn)錄組研究相對(duì)于芯片技術(shù)，背景信號(hào)值低，沒(méi)有檢測(cè)上限，對(duì)于基因表達(dá)譜有非常寬的檢測(cè)范圍。在有內(nèi)參的情況下，在定量方面顯示出了較高的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。不需要克隆的步驟，操作簡(jiǎn)單，需要的樣本量少，可在單細(xì)胞的水平上進(jìn)行表達(dá)譜分析通量高，成本比Tillingarray或者大規(guī)模的EST測(cè)序要低。目前四十一頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)RNA-seq的挑戰(zhàn)文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中大片段的RNA必須經(jīng)過(guò)片段化處理，會(huì)引入一定的偏倚。PCR會(huì)造成表達(dá)量的變化。海量短序列數(shù)據(jù)的比對(duì)或拼接情況復(fù)雜，對(duì)重復(fù)序列和多匹配序列的精確定位存在明顯問(wèn)題。高等真核生物可變剪接和反式剪接的鑒定仍有相當(dāng)?shù)恼`差。測(cè)序深度的確定因物種、器官、組織、時(shí)期而變，很難有統(tǒng)一公式直接計(jì)算。目前四十二頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)石蠟包埋樣本解決方案目前四十三頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)FFPE樣本(石蠟包埋切片組織)石蠟包埋技術(shù)（Formalin-FixedandParrffin-Embedded,FFPE）是現(xiàn)今臨床上最常見(jiàn)的保存DNA方法，全球醫(yī)院的珍貴臨床樣本中超過(guò)80%都使用該技術(shù)保存，但由于該技術(shù)DNA經(jīng)過(guò)福爾馬林浸泡，使DNA分子發(fā)生交聯(lián)和酶修飾，導(dǎo)致DNA存在不同幅度的降解。目前四十四頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)樣本量巨大，80%以上的臨床樣本都使用石蠟包埋保存很多珍貴的臨床樣本已經(jīng)做過(guò)組織學(xué)，病理學(xué)研究，很容易完成相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為何要使用FFPE樣本目前四十五頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)難于抽提，福爾馬林處理后的DNA容易產(chǎn)生交聯(lián)，使提取出的DNA量偏低提取出的DNA質(zhì)量低，通常降解200bp-5kb降解程度與石蠟包埋的時(shí)間相關(guān)FFPE-WES的巨大挑戰(zhàn)目前四十六頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)目前四十七頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)目前四十八頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)是否有相同突變?目前四十九頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)目前無(wú)法用于WGRS，樣本降解嚴(yán)重，對(duì)DNA覆蓋度有很大影響。DNA量過(guò)少，質(zhì)量很差。石蠟包埋時(shí)間越長(zhǎng)，福爾馬林對(duì)DNA交聯(lián)和損傷就越大。未使用保護(hù)緩沖液處理的福爾馬林影響更大。FFPE樣本仍存在問(wèn)題目前五十頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)CTCS和ctDNA目前五十一頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)什么是CTCs？CTCs(CirculatingTumorCells)自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞.CTCs是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中在血液循環(huán)系統(tǒng)中存活的腫瘤細(xì)胞，它的生成被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要前提。

目前五十二頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)CTCs研究意義深入研究CTCs有助于對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)一步了解，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供新的依據(jù)

CTCs的檢測(cè)有助于早期轉(zhuǎn)移腫瘤患者的診斷、監(jiān)測(cè)術(shù)后患者腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有助于評(píng)估抗腫瘤藥物的敏感性與患者預(yù)后以及選擇個(gè)體化的治療策略

目前五十三頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)CTCs研究難點(diǎn)CTCs并沒(méi)有顯著的特異性同其它血細(xì)胞明確區(qū)分且不同組織學(xué)類(lèi)型和分子表型的腫瘤分別表達(dá)不同的標(biāo)志物。CTCs在外周血中數(shù)量稀少，一般在106-107個(gè)白細(xì)胞中僅含有1個(gè)。無(wú)顯著特異性數(shù)量少目前五十四頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)CTCs的富集非特異性富集方法

特異性富集方法

方法CTCs-芯片富集法

納米粒富集法

免疫磁珠富集法

密度梯度離心富集法

細(xì)胞大小富集法

細(xì)胞變形性富集法

細(xì)胞電學(xué)特征富集法

Ficoll法和Oncoquick法上皮腫瘤細(xì)胞大小分離(ISET)和微濾芯片技術(shù)

雙向電泳-場(chǎng)流分離法（DEP-FFF）磁性活細(xì)胞分選法(MACS)、AdnaTest法、Cellsearch法目前五十五頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)通過(guò)細(xì)胞形態(tài)富集目前五十六頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)微流芯片目前五十七頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)密度梯度離心Plasma:血漿Mononuclearcell：?jiǎn)魏思?xì)胞（包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞）Ficoll：密度梯度液RBCs：紅細(xì)胞

目前五十八頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)免疫磁珠富集法目前五十九頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)微流體目前六十頁(yè)\總數(shù)六十六頁(yè)\編于十九點(diǎn)CTCs鑒定流式細(xì)胞儀分析(flowcytometry

FCM)

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)ICC

（immunocytochemistry）

鑒定標(biāo)本中細(xì)胞抗原性和形態(tài)學(xué)特征，能使富集的目的細(xì)胞維持細(xì)胞形態(tài)并保持細(xì)胞活力ICC是用能與顯色劑結(jié)