二代測序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

二代測序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用魏冬凱目前一頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點概要二代測序技術(shù)簡介常見醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案石蠟包埋樣本解決方案CTC和ctDNA目前二頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點二代測序技術(shù)簡介目前三頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點人類基因組

HumanGenome30億對堿基來自母親30億對堿基來自父親線粒體基因組來自母親與人類共生的微生物基因組目前四頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點DNA的構(gòu)成目前五頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點末端終止法測序目前六頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點ABI3700(ABI3730)目前七頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點人類基因組計劃(HGP)人類基因組計劃(humangenomeproject,HGP)是由美國科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學(xué)家共同參與了這一預(yù)算達(dá)30億美元的人類基因組計劃。按照這個計劃的設(shè)想，最終要把人體內(nèi)約4萬個基因的密碼全部解開，同時繪制出人類基因的譜圖。換句話說，就是要揭開組成人體4萬個基因的30億個堿基對的秘密。人類基因組計劃與曼哈頓原子彈計劃和阿波羅計劃并稱為三大科學(xué)計劃。被譽(yù)為生命科學(xué)的“登月計劃”。目前八頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點CeleraGenomicsCraigVenter成立第一個使用全基因組鳥槍法測序使用330臺ABI3700，購買當(dāng)時世界排名第三的服務(wù)器進(jìn)行運(yùn)算，花費(fèi)3個月時間對Venter的基因組進(jìn)行測序，得到20GB數(shù)據(jù)。目前九頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點Ventor基因組測序基于分子克隆，必須將DNA片段克隆至大腸桿菌中，否則無法測序。每次末端終止反應(yīng)體系10ul，其中含有1013個DNA分子，但每次只能測其中1條。預(yù)計花費(fèi)2億美金，最終花費(fèi)30億美金！怎樣才能降低試劑消耗？目前十頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點降低消耗的辦法1.將分子克隆替換成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），先給DNA片段加上尾巴。

橋式PCR2.降低反應(yīng)體積把測序反應(yīng)裝到小的空間里去。10ul的試劑做更多的DNA測序反應(yīng)。目前十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點降低消耗的辦法1.將分子克隆替換成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），先給DNA片段加上尾巴。

橋式PCR2.降低反應(yīng)體積把測序反應(yīng)裝到小的空間里去。10ul的試劑做更多的DNA測序反應(yīng)。目前十二頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點橋式PCR目前十三頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點二代測序（NGS）目前十四頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點邊合成邊測序（SBS）Flowcell目前十五頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點SBS技術(shù)特點讀長最初的時候只有31bp，現(xiàn)已能達(dá)到600bp。運(yùn)行時間長，熒光信號會逐漸減弱。每次只能結(jié)合1個堿基，發(fā)出一種熒光信號。目前十六頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點Hiseq2500可同時運(yùn)行2張8通道flowcell有高通量模式和快速模式2種模式。單次運(yùn)行數(shù)據(jù)量高達(dá)500GB?？焖倌Ｊ阶疃踢\(yùn)行時間17小時。目前十七頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點常見醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案目前十八頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點二代測序應(yīng)用醫(yī)療的可行性目前十九頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點NGS的優(yōu)勢相比于一代測序，NGS更加省時低成本，速度快，覆蓋度深，準(zhǔn)確度高；高通量測序人類基因組有助于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的未知基因；對于疾病引起的基因突變，高通量測序可以為患者醫(yī)師提供更為準(zhǔn)確的診斷依據(jù)；需求樣本類型廣泛，樣本量需求少。目前二十頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點常見醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案全基因組重測序（WGRS）尋找個體突變，InDel，CNV，SV等等，需求數(shù)據(jù)量大，單個樣本需求90G數(shù)據(jù)。全外顯子組測序（WES）捕獲基因組中的全外顯子進(jìn)行測序，測序數(shù)據(jù)量較WGRS少很多，并能獲得高測序深度（50X-150X）目前二十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點常見醫(yī)學(xué)領(lǐng)域NGS方案靶向區(qū)域測序（TargetSequencing）捕獲富集感興趣的靶向區(qū)域進(jìn)行測序，技術(shù)流程與全外顯子捕獲相似，測序需求量較WES少，能獲得更高測序深度（最高500X）轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）研究轉(zhuǎn)錄水平上的測序，包括mRNA，lncRNA，microRNA等。目前二十二頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進(jìn)行基因組測序，并在個體或群體水平上進(jìn)行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，人類疾病的致病突變研究由外顯子區(qū)域擴(kuò)大到全基因組范圍。通過構(gòu)建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結(jié)合的策略進(jìn)行高通量測序，實現(xiàn)在全基因組水平上檢測疾病關(guān)聯(lián)的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點，以及結(jié)構(gòu)變異等，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價值。全基因組重測序(WGRS/DNA-Seq)目前二十三頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點SNP（個體間差異）CNV（大片段基因拷貝數(shù)變異）InDelSV（結(jié)構(gòu)變異）全基因組重測序的應(yīng)用目前二十四頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點SNP(SNV)目前二十五頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點示例目前二十六頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點為何研究SNP？SNP目前已被公認(rèn)為疾病發(fā)生的基因分子標(biāo)記。SNP被認(rèn)為是導(dǎo)致藥物差異化的主要因素之一，因此可以根據(jù)SNP的變化來進(jìn)行個性化用藥。SNP分布廣泛，且較為穩(wěn)定。某些SNP會直接影響功能基因表達(dá)。目前二十七頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點大多數(shù)的SNP都是無用的大多數(shù)的SNP屬于沉默突變。非編碼區(qū)的錯義突變也不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生改變。目前二十八頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點但也有例外目前二十九頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點診斷實例：Dr.JamesGern和JosephDeRisi合作，用MiSeqDx從一個病危的十幾歲的男孩的腦脊液中抽提出核酸樣本，測了8百萬條核酸序列，從中檢出了475條鉤端螺旋體的序列，從而判定這個男孩的病是因為鉤端螺旋體感染。Dr.JamesGern依據(jù)上述的判斷，給男孩青霉素治療，治好了這個男孩的病。腦脊液是較難取得的體液，只能是采集很少的量，這就限制了所能得到的核酸總量。鉤端螺旋體，在病原體的常見程度排名中是較靠后的種類。在本案例中，如果用PCR方法，挨個排查病原體，可能還沒排到鉤端螺旋體，核酸就不夠了。但高通量測序克服了核酸量不夠的問題。在本案例中，鉤端螺旋體DNA只占總DNA的萬分之0.6，含量極微，但經(jīng)過高通量測序，得到了475條鉤端螺旋體的DNA，這讓鉤端螺旋體無處循形。目前三十頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點2009年H1N1病毒爆發(fā)感染時，有一名病人死于呼吸系統(tǒng)引起的多器官衰竭，然而并不知道具體的死因?？茖W(xué)家把病人的肺部穿刺組織的DNA拿來做高通量測序。最終在950萬條序列中，含有0.85%的序列來自于H1N1病毒基因組，從而幫助科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了該病人的真正死因。在這樣高人類基因組干擾的背景下，目前其他技術(shù)都難以快速發(fā)現(xiàn)致病病毒序列、以及分子分型。Kuroda,M.,Katano,H.,Nakajima,N.,Tobiume,M.,Ainai,A.,Sekizuka,T.,…Sata,T.(2010)..PloSOne,5目前三十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點Nimblegen

(Roche)SureSelect(Agilent)RNAOligoTrusight

(Illumina)全外顯子測序（WES）目前三十二頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點癌癥相關(guān)（人）遺傳性疾病（人）其它非傳染性疾?。ㄈ耍┲饕糜趯ふ液币娡蛔?，遺傳性突變及癌癥相關(guān)的體細(xì)胞突變可以做SNP，InDel分析，但由于捕獲區(qū)域較短，一般不用于CNV，SV分析。WES應(yīng)用領(lǐng)域目前三十三頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點成本低（一般50-150X，也僅需要8-15G數(shù)據(jù)）降低分析背景，容易發(fā)現(xiàn)稀有突變。大約能測到50-80bp的片段缺失，由于外顯子捕獲芯片片段較短，很難判斷是由捕獲脫靶導(dǎo)致還是由缺失導(dǎo)致。同樣因為捕獲芯片片段較短，一般不做CNV，SV分析。WES特點目前三十四頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點WES方案流程目前三十五頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等?？梢愿咄糠治鲛D(zhuǎn)錄本信息，發(fā)現(xiàn)未知的轉(zhuǎn)錄本和基因注釋。尋找個體間，同一個體不同時期等感興趣基因表達(dá)豐度變化。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)目前三十六頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點mRNA-Seq方案目前三十七頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點有關(guān)lncRNA的一些知識：長度大于200bp無法編碼蛋白有內(nèi)含子區(qū)和外顯子區(qū)非編碼RNA具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，如對染色體結(jié)構(gòu)的影響，對RNA加工修飾及穩(wěn)定性的影響，對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，甚至對蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定性都有一定的影響。所以近年來，許多通過RNA-seq進(jìn)行測序分析的文章都包括對lncRNA的分析，并且發(fā)現(xiàn)了許多新的lncRNA。目前三十八頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點lncRNA-Seq目前三十九頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點sRNA-Seq目前四十頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點RNA-seq的優(yōu)勢不局限于已知的基因組序列信息，適用于未知基因組序列的物種的高通量轉(zhuǎn)錄組研究相對于芯片技術(shù)，背景信號值低，沒有檢測上限，對于基因表達(dá)譜有非常寬的檢測范圍。在有內(nèi)參的情況下，在定量方面顯示出了較高的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。不需要克隆的步驟，操作簡單，需要的樣本量少，可在單細(xì)胞的水平上進(jìn)行表達(dá)譜分析通量高，成本比Tillingarray或者大規(guī)模的EST測序要低。目前四十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點RNA-seq的挑戰(zhàn)文庫構(gòu)建過程中大片段的RNA必須經(jīng)過片段化處理，會引入一定的偏倚。PCR會造成表達(dá)量的變化。海量短序列數(shù)據(jù)的比對或拼接情況復(fù)雜，對重復(fù)序列和多匹配序列的精確定位存在明顯問題。高等真核生物可變剪接和反式剪接的鑒定仍有相當(dāng)?shù)恼`差。測序深度的確定因物種、器官、組織、時期而變，很難有統(tǒng)一公式直接計算。目前四十二頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點石蠟包埋樣本解決方案目前四十三頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點FFPE樣本(石蠟包埋切片組織)石蠟包埋技術(shù)（Formalin-FixedandParrffin-Embedded,FFPE）是現(xiàn)今臨床上最常見的保存DNA方法，全球醫(yī)院的珍貴臨床樣本中超過80%都使用該技術(shù)保存，但由于該技術(shù)DNA經(jīng)過福爾馬林浸泡，使DNA分子發(fā)生交聯(lián)和酶修飾，導(dǎo)致DNA存在不同幅度的降解。目前四十四頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點樣本量巨大，80%以上的臨床樣本都使用石蠟包埋保存很多珍貴的臨床樣本已經(jīng)做過組織學(xué)，病理學(xué)研究，很容易完成相關(guān)實驗驗證為何要使用FFPE樣本目前四十五頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點難于抽提，福爾馬林處理后的DNA容易產(chǎn)生交聯(lián)，使提取出的DNA量偏低提取出的DNA質(zhì)量低，通常降解200bp-5kb降解程度與石蠟包埋的時間相關(guān)FFPE-WES的巨大挑戰(zhàn)目前四十六頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點目前四十七頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點目前四十八頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點是否有相同突變?目前四十九頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點目前無法用于WGRS，樣本降解嚴(yán)重，對DNA覆蓋度有很大影響。DNA量過少，質(zhì)量很差。石蠟包埋時間越長，福爾馬林對DNA交聯(lián)和損傷就越大。未使用保護(hù)緩沖液處理的福爾馬林影響更大。FFPE樣本仍存在問題目前五十頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點CTCS和ctDNA目前五十一頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點什么是CTCs？CTCs(CirculatingTumorCells)自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞.CTCs是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中在血液循環(huán)系統(tǒng)中存活的腫瘤細(xì)胞，它的生成被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要前提。

目前五十二頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點CTCs研究意義深入研究CTCs有助于對腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)一步了解，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供新的依據(jù)

CTCs的檢測有助于早期轉(zhuǎn)移腫瘤患者的診斷、監(jiān)測術(shù)后患者腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有助于評估抗腫瘤藥物的敏感性與患者預(yù)后以及選擇個體化的治療策略

目前五十三頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點CTCs研究難點CTCs并沒有顯著的特異性同其它血細(xì)胞明確區(qū)分且不同組織學(xué)類型和分子表型的腫瘤分別表達(dá)不同的標(biāo)志物。CTCs在外周血中數(shù)量稀少，一般在106-107個白細(xì)胞中僅含有1個。無顯著特異性數(shù)量少目前五十四頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點CTCs的富集非特異性富集方法

特異性富集方法

方法CTCs-芯片富集法

納米粒富集法

免疫磁珠富集法

密度梯度離心富集法

細(xì)胞大小富集法

細(xì)胞變形性富集法

細(xì)胞電學(xué)特征富集法

Ficoll法和Oncoquick法上皮腫瘤細(xì)胞大小分離(ISET)和微濾芯片技術(shù)

雙向電泳-場流分離法（DEP-FFF）磁性活細(xì)胞分選法(MACS)、AdnaTest法、Cellsearch法目前五十五頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點通過細(xì)胞形態(tài)富集目前五十六頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點微流芯片目前五十七頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點密度梯度離心Plasma:血漿Mononuclearcell：單核細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞）Ficoll：密度梯度液RBCs：紅細(xì)胞

目前五十八頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點免疫磁珠富集法目前五十九頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點微流體目前六十頁\總數(shù)六十六頁\編于十九點CTCs鑒定流式細(xì)胞儀分析(flowcytometry

FCM)

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)ICC

（immunocytochemistry）

鑒定標(biāo)本中細(xì)胞抗原性和形態(tài)學(xué)特征，能使富集的目的細(xì)胞維持細(xì)胞形態(tài)并保持細(xì)胞活力ICC是用能與顯色劑結(jié)