體細(xì)胞雜交課件

一、體細(xì)胞雜交的概念概念：體細(xì)胞雜交，即原生質(zhì)體融合，將兩個不同親本的原生質(zhì)體，經(jīng)人工誘導(dǎo)融合并培養(yǎng)再生成株的過程，統(tǒng)稱為體細(xì)胞雜交（A+B）。幾種不同的表述：體細(xì)胞雜交：Somatichybridization細(xì)胞融合：Cellfusion原生質(zhì)體融合：Protoplastfusion無性雜交：asexualhybridization超性雜交：Parasexualhybridization超性融合：Parasexualfusion細(xì)胞操作：Cellmanipulation細(xì)胞工程（Cellengineering）目前一頁\總數(shù)四十七頁\編于三點體細(xì)胞雜交與有性雜交的異同比較內(nèi)容體細(xì)胞雜交有性雜交時間無季節(jié)限制花期限制，特別是母本的花期親緣關(guān)系一定程度上可以克服有性/嫁接不親和性受親和性影響結(jié)果細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均可以重組、倍性增加雙受精，一般無細(xì)胞質(zhì)重組，倍性不改變目前二頁\總數(shù)四十七頁\編于三點+體細(xì)胞雜交有性雜交目前三頁\總數(shù)四十七頁\編于三點PossibleResultofFusionofTwoGeneticallyDifferentProtoplasts=chloroplast=nucleusFusionheterokaryoncybridcybridhybridhybrid=mitochondria目前四頁\總數(shù)四十七頁\編于三點原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-I對稱雜種（雙親給雜種貢獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)均為100%）非對稱雜種（雙親給雜種貢獻(xiàn)的遺傳物質(zhì)不等（相對值）胞質(zhì)雜種（cytoplasmichybrid,Cybrid）：細(xì)胞質(zhì)重組，細(xì)胞核未重組對稱融合（symmetricfusion）也稱標(biāo)準(zhǔn)融合（Standardfusion）非對稱融合（asymmetricfusion）：融合前對一方進(jìn)行處理，使其染色體丟失一部分目前五頁\總數(shù)四十七頁\編于三點原生質(zhì)體融合的有關(guān)名詞-II供-受體融合：Donor-recipientfusion體配融合（gameto-somaticfusion）（性細(xì)胞與體細(xì)胞融合）亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合：Subprotoplast-protoplastfusion小原生質(zhì)體：Miniprotoplast微原生質(zhì)體：Microprotoplast胞質(zhì)體：Cytoplast胞質(zhì)體-原生質(zhì)體融合:Cytoplast-protoplastfusion目前六頁\總數(shù)四十七頁\編于三點發(fā)展歷程70年代，技術(shù)建立和完善優(yōu)化1972年獲得煙草種間體細(xì)胞雜種1975年高Ca高pH加PEG融合方法，電融合法大量成功報道，不少為異想天開的實驗80年代初，由模式植物轉(zhuǎn)向農(nóng)作物/經(jīng)濟(jì)作物，對稱融合到非對稱融合，創(chuàng)造新種質(zhì)的技術(shù)手段80年代末，大量木本植物細(xì)胞融合成功的報道90年代至今，成為一種育種手段目前七頁\總數(shù)四十七頁\編于三點1960年，Kocking用酶法制備高等植物原生質(zhì)體首次獲得成功；1971年，Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株；1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，這是第一個植物體細(xì)胞雜種；1974年，Kao將聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細(xì)胞融合并建立了相應(yīng)的融合技術(shù)；1978年，Melchers獲得第一個屬間體細(xì)胞雜種（番茄＋馬鈴薯）；1981年，Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念；1987年，Schweiger建立了單對原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。植物體細(xì)胞雜交的幾個重要進(jìn)展目前八頁\總數(shù)四十七頁\編于三點理論上，任何細(xì)胞都可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。目前九頁\總數(shù)四十七頁\編于三點根據(jù)融合時細(xì)胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為兩大方式：

對稱融合（symmetricfusion）－即兩個完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。非對稱融合（asymmetricfusion）－利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。

目前十頁\總數(shù)四十七頁\編于三點用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：

物理方法常采用射線處理，如X射線、射線等，使細(xì)胞核失活；

化學(xué)處理目前常用的試劑：核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（R－6－G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達(dá)到失活作用。

目前十一頁\總數(shù)四十七頁\編于三點二、原生質(zhì)體融合融合方法原生質(zhì)體融合過程影響原生質(zhì)體融合的因素目前十二頁\總數(shù)四十七頁\編于三點融合方法PEG融合電融合Polyethyleneglycol（PEG）Electrofusion,Electricallyinducedfusion目前十三頁\總數(shù)四十七頁\編于三點1.PEG誘導(dǎo)融合法

PEG誘導(dǎo)融合的特點：優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。

PEG作用機(jī)理：Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促進(jìn)原生質(zhì)體融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。

目前十四頁\總數(shù)四十七頁\編于三點融合液：CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0molpH5.6誘導(dǎo)液：融合液＋PEG20～45％稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0B液(g/100ml)pH10.5葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.169目前十五頁\總數(shù)四十七頁\編于三點P1P2P1P2混合靜止1min.融合融合液加入PEG稀釋洗滌加入稀釋液加入培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇目前十六頁\總數(shù)四十七頁\編于三點目前十七頁\總數(shù)四十七頁\編于三點2．電融合法

Electrofusion,Electricallyinducedfusion與PEG融合相比，電融合有三大優(yōu)點：不存在對細(xì)胞的毒害問題；融合效率高；融合技術(shù)操作簡便。Electrofusion:AhighfrequencyACfieldisappliedbetween2electrodesimmersedinthesuspensionofprotoplasts-thisinduceschargesontheprotoplastsandcausesthemtoarrangethemselvesinlinesbetweentheelectrodestoformpearl-chain.Theyarethensubjecttoahighvoltagedischargewhichcausestheirmembranestofusewheretheyareincontact.目前十八頁\總數(shù)四十七頁\編于三點電融合儀的結(jié)構(gòu)特點：交變電場部分高頻直流電擊部分目前十九頁\總數(shù)四十七頁\編于三點電融合的基本過程：

細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細(xì)胞融合在一起并圓球化。

目前二十頁\總數(shù)四十七頁\編于三點目前二十一頁\總數(shù)四十七頁\編于三點關(guān)于融合參數(shù)：交流電壓交變電場的振幅頻率交變電場的處理時間直流高頻電壓脈沖寬度脈沖次數(shù)

目前二十二頁\總數(shù)四十七頁\編于三點

原生質(zhì)體的融合過程膜的融合細(xì)胞質(zhì)融合發(fā)生膜融合后的數(shù)小時

核融合融合可能發(fā)生在細(xì)胞間期，也可能發(fā)生在第一次同步分裂過程中目前二十三頁\總數(shù)四十七頁\編于三點影響原生質(zhì)體融合的因素

原生質(zhì)體質(zhì)量對細(xì)胞融合起著至關(guān)重要的作用，高質(zhì)量的原生質(zhì)體是細(xì)胞融合的首要條件

融合方法融合參數(shù)，包括各種融合液都應(yīng)選擇適當(dāng)

目前二十四頁\總數(shù)四十七頁\編于三點三、雜種細(xì)胞的發(fā)育動態(tài)

及體細(xì)胞雜種鑒定雜種細(xì)胞的發(fā)育動態(tài)雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)與體細(xì)胞雜種植株鑒定體細(xì)胞雜種的特點體細(xì)胞雜種后代的遺傳目前二十五頁\總數(shù)四十七頁\編于三點

雜種細(xì)胞的發(fā)育動態(tài)

核融合核重組細(xì)胞器重組部分核物質(zhì)或細(xì)胞器丟失核分裂的非同步性目前二十六頁\總數(shù)四十七頁\編于三點

雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)與雜種植株鑒定1．雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)

外觀選擇：質(zhì)體、細(xì)胞體積等互補(bǔ)選擇：抗生素、營養(yǎng)缺陷型等熒光標(biāo)記選擇：親本標(biāo)記不同熒光

目前二十七頁\總數(shù)四十七頁\編于三點2．體細(xì)胞雜種鑒定形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進(jìn)行鑒定。細(xì)胞學(xué)鑒定：細(xì)胞器鑒定、染色體鑒定、染色體原位雜交生化鑒定：同功酶鑒定分子鑒定：RFLP、RAPD、SSR等分子標(biāo)記目前二十八頁\總數(shù)四十七頁\編于三點形態(tài)鑒定和同功酶鑒定目前二十九頁\總數(shù)四十七頁\編于三點染色體原位雜交GISH、FISH目前三十頁\總數(shù)四十七頁\編于三點RAPD標(biāo)記鑒定510

1100670bp75025050020001000bp

1234567891011121314目前三十一頁\總數(shù)四十七頁\編于三點體細(xì)胞雜種的遺傳1．細(xì)胞分裂與染色體丟失如果細(xì)胞分裂而核不發(fā)生融合，在以后的發(fā)育過程中會有兩種結(jié)果：一是細(xì)胞分裂幾次后即停止生長從而導(dǎo)致死亡；二是在發(fā)育過程中某一親本的細(xì)胞核部分或全部丟失。

減數(shù)分裂時染色體配對異常：環(huán)形、染色體橋等。目前三十二頁\總數(shù)四十七頁\編于三點2．基因轉(zhuǎn)移與性狀表達(dá)由于染色體的部分丟失，常常使某個親本的部分或個別基因與另一親本的染色體發(fā)生整合，其結(jié)果是實現(xiàn)了親本間的基因轉(zhuǎn)移?；蜣D(zhuǎn)移通常在后代中某些性狀得以表達(dá)，有時由于基因的重組也可能產(chǎn)生雙親均沒有的新性狀。

目前三十三頁\總數(shù)四十七頁\編于三點

3．體細(xì)胞雜種遺傳上的不穩(wěn)定性

體細(xì)胞雜種后代在遺傳上常常不穩(wěn)定，這可能涉及到多方面的因素，如親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近、培養(yǎng)過程中的染色體變異、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的重組等。

目前三十四頁\總數(shù)四十七頁\編于三點

4．體細(xì)胞雜種的核質(zhì)遺傳1）核遺傳：雙親之和，少數(shù)有重組和丟失2）

線粒體遺傳：往往有重組，柑橘上例外，僅來自愈傷組織親本3）葉綠體遺傳：隨機(jī)分離，也有共存現(xiàn)象目前三十五頁\總數(shù)四十七頁\編于三點四、體細(xì)胞雜交技術(shù)的應(yīng)用獲得新物種獲得新種質(zhì)和新品種轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)基因控制性狀體細(xì)胞雜交技術(shù)展望目前三十六頁\總數(shù)四十七頁\編于三點體細(xì)胞雜交技術(shù)的應(yīng)用克服生殖障礙，創(chuàng)造新種質(zhì)；轉(zhuǎn)移有益性狀，改良作物品質(zhì)；轉(zhuǎn)移部分染色體，創(chuàng)造非對稱雜種；轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因組，創(chuàng)造胞質(zhì)雜種；作為育種中間材料（bridgematerial），進(jìn)一步用于作物改良。目前三十七頁\總數(shù)四十七頁\編于三點

雜種組合新屬蘿卜Raphanussativus（2n=18）+甘藍(lán)Brassicaoleracea（2n=18）Raphanobrassica甘藍(lán)Brassicaoleracea（2n=18）+Moricandiaarvensis（2n=27,28）Moricandiobrassica芝麻菜Erucasativa（2n=22）+甘藍(lán)型油菜Brassicanapus（2n=38）Erucobrassica二行芥Diplotaxismuralis（2n=42）+甘藍(lán)型油菜Brassicanapus（2n=38）Diplotaxobrassica煙草Nicotianatabacum（2n=24）+番茄Lycopersiconesculentum（2n=24）Nicotiopersicon馬鈴薯Solanumtuberosum（2n=24）+番茄Lycopersiconesculentum（2n=24）Solanopersicon曼陀羅Daturainnoxia（2n=48）+顛茄Atropabelladona（2n=24）Daturotropa水稻Oryzasativa（2n=24）+稻稗Echinochloaoryzicola（2n=24）Oryzochloa通過原生質(zhì)體融合獲得的屬間體細(xì)胞雜種目前三十八頁\總數(shù)四十七頁\編于三點

體細(xì)胞雜種性狀抗性Nicotianatabacum+N.nesophila

煙草花葉病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）Solamuntuberosum+S.chacoense馬鈴薯X病毒（potatovirusX，PVX）N.tabacum+N.nesophila煙草角蠕蟲（tobaccohornworm）S.tuberosum+S.brevidens馬鈴薯卷葉病毒（potatoleafrollvirus，PLRV），晚疫病（lateblight），馬鈴薯Y病毒（potatovirusY，PVY）S.circalifolium+S.tuberosum疫霉屬（Phytophthora）S.melongena+S.sanitwongsei青枯假單胞菌（Pseudomonassolanacearum）S.tuberosum+Smersonii耐霜凍（frosttolerance）Brassica.napus+B.nigra十字花科黑脛菌（Phomalingam）B.oleracea+Sinapisalba甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternariabrassiceae）B.napus+Sinapisalba甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternariabrassiceae）Citrussinensis+Poncirustrifoliata腳腐病（Phytophthora）Lycopersiconesculentum+L.peruvianum煙草花葉病毒（TMV），斑萎病毒（spottedwiltvirus），coldtolerance原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)移的一些遺傳性狀

目前三十九頁\總數(shù)四十七頁\編于三點農(nóng)藝性狀（通過胞質(zhì)雜種轉(zhuǎn)移）

N.tabacum+N.sylvestris鏈霉素抗性（Streptomycinresistance）

三嗪抗性（Triazineresistance）S.nigrum+S.tuberosum三嗪抗性（Triazineresistance）B.nigra+B.napus潮霉素抗性（hygromycinresistance）N.tabacum+N.sylvestris細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）B.campestris+B.napus細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）B.napus+B.campestris+Raphanussativa細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）和三嗪抗性（Triazineresistance）L.esculentum+Solanumacaule細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）B.napus+B.tournefortii細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）目前四十頁\總數(shù)四十七頁\編于三點柑橘體細(xì)胞雜交策略Strategies

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